Biology

Dissociated माउस cortical न्यूरॉन संस्कृति की तैयारी

Published: December 19, 2007 doi: 10.3791/562

Lutz G. W. Hilgenberg¹, Martin A. Smith¹

¹Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

इस वीडियो देर से भ्रूण और जल्दी प्रसव के बाद माउस प्रांतस्था से neuronal संस्कृतियों पैदा करने के लिए एक प्रक्रिया से पता चलता है. इन संस्कृतियों immunocytochemistry, जैव रसायन, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कैल्शियम और सोडियम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और ट्रांसजेनिक जानवर है कि एक प्रसव के बाद घातक जीन उत्परिवर्तन ले neuronal विकास का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान.

Abstract

इस वीडियो देर से भ्रूण और जल्दी प्रसव के बाद माउस मस्तिष्क से cortical neuronal संस्कृतियों पैदा करने के लिए इस प्रक्रिया के माध्यम से आपको मार्गदर्शन करेगा. इन संस्कृतियों immunocytochemistry, जैव रसायन, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, इमेजिंग कैल्शियम और सोडियम, प्रोटीन और / या शाही सेना अलगाव सहित आवेदनों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन संस्कृतियों को भी ट्रांसजेनिक जानवर है कि एक देर से भ्रूण या प्रसवोत्तर घातक जीन उत्परिवर्तन ले neuronal विकास का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं. प्रक्रिया अपेक्षाकृत सीधे आगे है, टिशू कल्चर तकनीक में कुछ अनुभव की आवश्यकता है और ले नहीं होना चाहिए अगर आप ठीक ढंग से तैयार कर रहे हैं अब से दो से तीन घंटे. फाइबर thalamo cortical पथ से cortical छिलका की सावधानी से जुदाई अवांछित गैर neuronal कोशिकाओं की संख्या कम हो जाएगा. वृद्धि के लिए neuronal कोशिकाओं की पैदावार cortical ऊतक के टुकड़े एंजाइम ऊष्मायन कदम के बाद धीरे triturate. यह आवश्यक है के रूप में यह कोशिकाओं और समय से पहले neuronal सेल मृत्यु अनावश्यक चोट से बचाता है. चूंकि इन संस्कृतियों glia फीडर कोशिकाओं के अभाव में रखा जाता है, वे भी बढ़ती न्यूरॉन्स में समृद्ध संस्कृतियों में से एक जोड़ा लाभ प्रदान करते हैं.

Protocol

संवर्धन के दिन से पहले तैयारी:

बाँझ विदारक समाधान (डी एस) तैयार है.
NBM/B27 (B27 की खुराक के साथ Neurobasal Mediom) तैयार करें.
आटोक्लेव DDH ₂ हे और गिलास coversilps बाँझ, अगर जरूरत.
कोट टिशू कल्चर पाली - डी - lysine के साथ बर्तन या कांच coverslips.

पाली - डी - Lysine कोटिंग:

बाँझ शर्तों के तहत संवर्धन दिन पहले तैयार करें.

10X और बर्फ पर PDL जगह का पिघलना विभाज्य.
PDL के 1 मिलीलीटर के लिए 9 मिलीलीटर बाँझ अल्ट्रा फ़िल्टर्ड पानी जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से (1X).
1X निम्नानुसार कमरे के तापमान पर रातोंरात PDL के साथ कोट सतहों:
- कांच (Bellco ग्लास इंक # बिल्ली 1943-00,012) coverslips: 75 μl / coverslip
  या
- 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली: 300 μl / अच्छी तरह से
  या
- 35 मिमी संस्कृति पकवान: 1ml/dish
बाँझ पानी (बाँझ पाश्चर pipettes का उपयोग करने के लिए तरल aspirate) के साथ 5X कुल्ला.
पानी निकालें जब तक सतह पूरी तरह से सूखा है.

संवर्धन प्रक्रिया (बाँझ शर्तों के तहत लामिना का प्रवाह हुड में किया)

अगर और यह गोंद के ब्लॉक सूक्ष्म तक्षणी Vibraslicer (Campden इंस्ट्रूमेंट्स लिमिटेड) के समर्थन ब्लॉक सुपर गोंद का उपयोग पर बाहर कट.
जब देर भ्रूण चरण माउस भ्रूण, euthanise बांध (E17-18) का उपयोग, गर्भाशय और मुक्त व्यक्ति भ्रूण भ्रूण बोरी से हटा दें. बाँझ पेट्री डिश में रखें fetuses और जारी रखने के रूप में नीचे उल्लिखित है.
सिर काटना माउस भ्रूण या पिल्ला (का पालन करें अपने संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों).
वाटमान फिल्टर पेपर डिस्क पर एक 60mm पेट्री डिश ठंड डी एस के साथ भरा में त्वचा और खोपड़ी और जगह मस्तिष्क निकालें.
एक बाँझ धार का उपयोग सेरिबैलम कट.
एक रंग का उपयोग कर मस्तिष्क उठाओ और फिल्टर पेपर पर अधिक तरल पदार्थ नाली, तो Vibraslicer समर्थन ब्लॉक और जगह में गोंद मस्तिष्क (दुम ऊपर की ओर और उदर भाग का सामना करना पड़ अगर) करने के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण.
ठंड डी एस के साथ चैम्बर भरें. 8-9 करने के लिए गति चयनकर्ता सेट.
200-400 सुक्ष्ममापी वर्गों कट, घ्राण बल्ब से शुरुआत. एक बार Vibraslicer के ब्लेड प्रांतस्था में प्रवेश करती है, 600μm राज्याभिषेक वर्गों को काटने शुरू करते हैं. E17-18 माउस मस्तिष्क आम तौर पर 3-4 प्रयोग करने योग्य स्लाइस पैदावार है, जबकि एक P0 माउस मस्तिष्क 4-5 प्रयोग करने योग्य स्लाइस पैदावार.
मस्तिष्क स्लाइसें को 35 मिमी पेट्री डिश 2 डी एस लेबल 10 मिलीलीटर कांच पाश्चर pipet संयुक्त राष्ट्र खामियों को दूर रिवर्स अंत का उपयोग करने के लिए स्थानांतरण.
बाहर प्रांतस्था काटना और गिलास केशिका ट्यूब से खींच सुइयों का उपयोग meninges हटायें.
छोटे टुकड़े, लंबाई में 0.5-1 मिमी में cortical rinds कट.
0.2 सुक्ष्ममापी के माध्यम से फ़िल्टर ES एक 35 मिमी पेट्री डिश में एक 5 सीसी सिरिंज से जुड़ी फिल्टर.
फ़िल्टर ES युक्त पेट्री डिश के लिए cortical ऊतक के टुकड़े स्थानांतरण.
37 डिग्री 30 मिनट के लिए सी सेते हैं.

इस बीच में:

हुड Vibraslicer, और विदारक उपकरण साफ.
एक 60 मिमी पेट्री डिश में NBM/B27 गर्म के 5 मिलीलीटर जोड़ें.

30 मिनट के बाद. ऊष्मायन:

10 मिलीलीटर डी एस के लिए ऊतक स्थानांतरण. 1 मिनट के लिए व्यवस्थित.
पहली हाय ट्यूब swirls ऊतक स्थानांतरण और 2-3 मिनट के लिए व्यवस्थित.
दूसरा हाय करने के लिए स्थानांतरण. ऊपर के रूप में दोहराएँ.
पहली ली के लिए स्थानांतरण. ऊपर के रूप में दोहराएँ.
दूसरा ली के लिए स्थानांतरण. ऊपर के रूप में दोहराएँ.
तीसरे ली के लिए स्थानांतरण. ऊपर के रूप में दोहराएँ.
मीडिया के साथ 60 मिमी पकवान के लिए ऊतक स्थानांतरण.

विच्छेदन खुर्दबीन के तहत:

ऊतकों से साफ़ मलबे और धीरे से एक खींचा कांच pipet (उपयोग बोर आकार घटते) के माध्यम से पारित करने के लिए ऊतक ढीला द्वारा प्रत्येक टुकड़ा triturate.
15 मिलीलीटर शंक्वाकार + NBM B27 के बाकी है (- 35 मिमी व्यंजन धीरे मिक्स और ऊतक के बड़े टुकड़े के लिए प्रतीक्षा करने के लिए व्यवस्थित एक 24 अच्छी तरह से थाली या 5 के लिए 11 मिलीलीटर के लिए कुल 13 मिलीलीटर की एक) युक्त ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण.
स्थानांतरण सेल निलंबन (एक 24 अच्छी तरह से थाली या 2 / एमएल 35 मिमी संस्कृति डिश के लिए 0.5 मिलीलीटर / अच्छी तरह से).
जब कांच coverslips का उपयोग कर, 80 coverslip प्रति μl सेल निलंबन जोड़ने और टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 1 घंटे की अनुमति के लिए कोशिकाओं को अधिक NBM/B27 मीडिया के साथ कक्ष में बाढ़ से पहले पालन करने के लिए.
37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ ₂ संस्कृतियों को बनाए रखें .

अगले दिन

24 अच्छी तरह से थाली: 0.5 मिलीलीटर गैर neuronal NBM/B27 मध्यम वातानुकूलित कक्ष के साथ एक अच्छी तरह से फ़ीड (cNBM/B27, cNBM/B27 माध्यम की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल के नीचे प्रकट होता)

35 मिमी व्यंजन: cNBM/B27 माध्यम से 0.5 मिलीलीटर बदलें.

ताजा हर cNBM/B27 2-3 दिन के साथ मध्यम के 0.5ml जगह संस्कृति को बनाए रखें.

हालांकि संस्कृति मीडिया glia सेल प्रसार को बढ़ावा देने नहीं करता है, संस्कृतियों संस्कृति में 3-5 दिन में 5μM FDU (5-Fluoro 2'deoxyuridine, F0503 सिग्मा) के साथ इलाज किया जा सकता करने के लिए आगे glial कोशिकाओं की संख्या कम है अगर जरूरत है.

सेट - उत्तर प्रदेश विच्छेदन और संस्कृति के लिए

70% EtOH में विदारक उपकरण जीवाणुरहित या उन्हें आटोक्लेव:

कैंची Spatulas med. (और छोटे) (med. और छोटे)
चिमटी (med. और छोटे) रेजर ब्लेड
Vibraslicer बफर स्नान के लिए ब्लेड
मस्तिष्क के लिए ब्लेड समर्थन के लिए लघु धातु कील

अन्य सामग्री:

पेट्री डिश (60 मिमी)
पेट्री डिश (35 मिमी)
फिल्टर पेपर
ग्लास pipet 10 मिलीलीटर
बाँझ डिस्पोजेबल pipets, 5,10 और 25 मिलीलीटर
सिरिंज फिल्टर, 0.2 सुक्ष्ममापी
सिरिंज 5 सीसी
अपकेंद्रित्र ट्यूबों, 15 मिलीलीटर
बाँझ पाश्चर कांच pipets
PDL लेपित संस्कृति बर्तन या कांच coverslips

लेबल छह 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों और तैयारी का पालन करें:

ट्यूब # 1: एनजाइम समाधान:

5 मिलीलीटर युक्त डी एस के लिए papain (03126 रास वोर्थिन्ग्तों) का 50 यू में जोड़ें:

एल cystein के 100μl (0.8mg)
7 μl 0.1N NaOH
50 μl APV (5mm)

समाधान कमरे के तापमान पर छोड़ बाहर करने के लिए स्पष्ट है. ध्यान दें कि एंजाइम समाधान 'बादल' पहली बार में दिखाई देते हैं और उपयोग करने से पहले स्पष्ट की जरूरत है.

# 2 & # 3 ट्यूब: हाय एनजाइम अवरोध करनेवाला:

3 मिलीलीटर + डी एस 300 μl / BSA तिवारी + 30 μl APV (5mm).

धीरे मिक्स बुलबुले से बचने के लिए, तो दो 1.5ml aliquots में विभाजित है.

# 4 ट्यूब - # 6: कम एनजाइम अवरोध करनेवाला:

8 मिलीलीटर + डी एस 80 μl / BSA तिवारी + 80 μl APV (5mm).

धीरे मिक्स बुलबुले से बचने के लिए, तीन 2.6 मिलीलीटर aliquots में विभाजित.

प्लेस ट्यूबों # 6 के माध्यम से बर्फ पर # 2 गिने. # 1 (एनजाइम समाधान) ट्यूब कमरे के तापमान पर छोड़ दें.

समाधान और ALIQUOTS

एक सिग्मा (buffered खारा) फार्मूला wt 500 मिलीलीटर [सान्द्र.] समाधान
सोडियम क्लोराइड एस 9625 80.0g 137mM 58.45 NaCl
पोटेशियम क्लोराइड पी - 4504 4.0g 5.4mM 74.56 KCl
सोडियम फास्फेट Dibasic निर्जल ना ₂ HPO ₄ 142.0 S-0,876 0.17mM 0.24g
पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार का निर्जल ₂ के.एच. पीओ पी 5379 ₄ 136.09 0.3g 0.22mM

400 मिलीलीटर अल्ट्रा फ़िल्टर्ड पानी के साथ भंग जब तक सभी सामग्री और मिश्रण वजन. 500 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाओ. एक साफ बोतल और आटोक्लेव में रखें. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस और लेबल. "डी एस समाधान एक"

समाधान (Hepes) बी सिग्मा फार्मूला wt 250 मिलीलीटर [सान्द्र.]
Hepes Hepes - एच 3375 283.3 20.97g 9.9mM

अल्ट्रा फ़िल्टर्ड पानी की 200 मिलीलीटर जोड़ें. जब तक भंग मिलाई और 250 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने. एक साफ बोतल और आटोक्लेव में रखें. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस और "डी एस समाधान बी" लेबल.

कार्य समाधान 500 मिलीलीटर [सान्द्र.]
अल्ट्रा फ़िल्टर्ड पानी की 400 मिलीलीटर
स्टॉक समाधान एक 25 मिलीलीटर
स्टॉक समाधान 14 मिलीलीटर बी
डी (+) ग्लूकोज जी 8270 3.0 छ 33.3mM सिग्मा
Sucrose सिग्मा एस 0,389 7.5 छ 43.8 मिमी

7.4 1N NaOH के साथ पीएच को समायोजित करें. अल्ट्रा फ़िल्टर्ड पानी के साथ 500 मिलीलीटर के अंतिम मात्रा लाओ. एक साफ कांच की बोतल और आटोक्लेव में छानना. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस लेबल "समाधान विदारक".

पाली - डी - Lysine तैयार:

बाँझ एच ₂ हे में 1mg/ml पर, 10x शेयर पाली-D-lysine के समाधान (सिग्मा पी - 7280 PDL) तैयार करें.
1.0 मिलीलीटर aliquots बनाओ. इस समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है 3 महीने के लिए.

मीडिया

के 10ml जोड़ें B-27 (17504-044 Gibco) 500 मिलीलीटर NBM बोतल (Neurobasal मध्यम, Gibco 21103-049) अनुपूरक.
4 में 40 मिलीलीटर aliquots और दुकान डिग्री सेल्सियस

APV

10 मिलीग्राम APV की शीशी 10 मिलीलीटर बाँझ एच ₂ हे जोड़ें (2 एमिनो-5-phosphonopentanoic एसिड, सिग्मा ए 5282) और मिश्रण अच्छी तरह से.
-20 डिग्री सेल्सियस पर 180 μl aliquots और दुकान की तैयारी

/ BSA तिवारी

1 ग्राम (गोजातीय albumin. सिग्मा एक 7030) BSA और 1 जी trypsin अवरोध करनेवाला (सिग्मा टी - 9253) को 10 मिलीलीटर डी एस में भंग.
7.4 1N NaOH के साथ पीएच को समायोजित करें.
0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टरिंग द्वारा जीवाणुरहित.
-20 डिग्री सेल्सियस पर 400 μl aliquots और दुकान में फूट डालो

एल - सिस्टीन

एक Eppendorf ट्यूब में 0.6 एल Cysteine 200 μl डी एस में मिलीग्राम (सिग्मा सी - 7755) को भंग.

अगर (4%)

Bacto अग्रवाल के 4 ग्राम (0140-01 Difco) 100 मिलीलीटर बाँझ पानी में भंग. 4 में रखें डिग्री सेल्सियस जब तक संस्कृति के लिए आवश्यक.
माइक्रोवेव अग्रवाल पिघल और एक 35 मिमी पेट्री डिश को भरने. शांत और polymerize बैठते हैं.

PAPAIN (वर्दिग्टन 03126 रास)

e_title "> NUNC संस्कृति बोतलों में गैर neuronal संस्कृतियों

कोटिंग संस्कृति बोतल (4 Nunc बोतलें)

1X PDL बनाने 10X PDL के 3 ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए 9 एमएल बाँझ पानी जोड़ें.
पहली बोतल में 30 मिलीलीटर 1X PDL स्थानांतरण.
थोड़ा ले जाएँ जब तक सभी विकास सतहों को कवर कर रहे हैं. 1 मिनट के लिए बैठते हैं.
दूसरी बोतल 1x PDL स्थानांतरण. 1 मिनट के लिए बैठते हैं.
तीसरे और आगे की बोतलों के साथ दोहराएँ.
सभी चार बोतलें 2X 150 मिलीलीटर बाँझ एच ₂ ओ के साथ कुल्ला

एंजाइम समाधान (ते) तैयार:

0.6 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब वजन में 0.8 बाहर मिलीग्राम एल Cysteine (C7755 सिग्मा), 150ml डी एस और भंवर जोड़ने जब तक क्रिस्टल भंग कर रहे हैं.
एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब 5 मिलीलीटर डी एस के स्थानांतरण, तो एल Cysteine 150ml जोड़ें.
50 इकाइयों papain जोड़ें. (वर्दिग्टन रास 03126)
7ml 0.1N NaOH जोड़ें.

तैयार सदस्य (# GIBCO 11090-081)

500 मिलीलीटर सदस्य बोतल से 65 मिलीलीटर निकालें. 10 मिलीलीटर बचाने के लिए ग्लूकोज तैयार.
5 मिलीलीटर पेन / Strep (# Gibco 15070-063) जोड़ें.
10 मिलीलीटर 1M ग्लूकोज (सिग्मा जी - +८२७०) (MEM 1.8 छ / 10 मिलीलीटर) जोड़ें
50 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय (# Gibco 16140-071) सीरम या गोजातीय बछड़ा सीरम (ओमेगा-04 ई.पू.) जोड़ें.
मिश्रण अच्छी तरह से विभाज्य है, और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस

NEUROBASAL MEDIUM/B-27 अनुपूरक (NBM/B27)
NBM, 500 मिलीलीटर (# Gibco 21103-049), बी 27 (50X), 10 मिलीलीटर (# Gibco 17504-044)

B-27 शीशी की संपूर्ण सामग्री NBM बोतल और मिश्रण जोड़ें.
विभाज्य और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान

मस्तिष्क के ऊतकों के विच्छेदन

ड्राई विच्छेदन पहले 70% EtOH से उपकरणों विदारक है.
3-15 मिलीलीटर ट्यूब के प्रत्येक में 10 मिलीलीटर डी एस स्थानांतरण.
माउस पिल्ले (P0 - पी 3) का चयन करें, आप 4 बोतल के लिए तीन दिमाग की आवश्यकता होगी.
35 मिमी पेट्री डिश ठंड डी एस जोड़ें.
माउस पिल्ला सिर काटना और बाहर दिमाग काटना.
ठंड डी एस युक्त पेट्री डिश में रखें दिमाग.
टुकड़े, काफी छोटा करने के लिए एक गिलास विंदुक के माध्यम से पारित में ऊतक जल्द.

एंजाइम हदबंदी

बहुत डी एस के रूप में संभव के रूप में पाश्चर विंदुक के साथ पकवान से निकालें.
0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर और 5cc सिरिंज के माध्यम से फ़िल्टर ES.
ES ऊतक के साथ डिश में रखें.
37 में ऊतक सेते 30 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (सीओ ₂₎ मुक्त.

टिशू वाशिंग

कांच विंदुक के साथ पहली डी एस ट्यूब के लिए स्थानांतरण ऊतक, संभव के रूप में थोड़ा ES के रूप में पाने के लिए सुनिश्चित बनाने.
1500 rpm पर 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र.
ऊतक और दोहराने की प्रक्रिया दो बार स्थानांतरण.

TRITURATION

एक 50ml अपकेंद्रित्र ट्यूब में सदस्य / FBS की 38 मिलीलीटर प्लेस
एक 35 मिमी पकवान और इस पेट्री डिश को हस्तांतरण ऊतक सदस्य / FBS की 3 मिलीलीटर जोड़ें.
धीरे से यह एक 1000μl Eppendorf pipet टिप के माध्यम से triturating द्वारा ऊतक अलग कर देना.
सदस्य / FBS की 38ml युक्त ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण और मिश्रण अच्छी तरह से.

चढ़ाना

संस्कृति की बोतलें ईमानदार खड़े प्रत्येक बोतल में सेल निलंबन और मीडिया के बराबर मात्रा में मिलता है.
प्रत्येक संस्कृति बोतल में सदस्य / FBS की 90 मिलीलीटर रखो.
प्रत्येक बोतल में सेल निलंबन के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
लेबल: गैर Neuronal प्रथमाक्षर, और तारीख. पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ ₂ सेते हैं.

खिला

पर दिन 3 या 4, गर्म सदस्य / FBS (निथारना सभी मीडिया और यह सदस्य / FBS की 100 मिलीलीटर के साथ की जगह) के साथ फ़ीड कोशिकाओं. संस्कृतियों 7-10 दिनों लेने के लिए मिला हुआ बन सकता है.
7-10 दिन पर NBM/B27 के लिए मीडिया को बदलने.
अगले दिन, मीडिया इकट्ठा. 0.22μm साथ फ़िल्टर
40 मिलीलीटर की aliquots बनाओ और सदस्य / FBS साथ संस्कृति फ़ीड.
2 या 3 दिन के अगला, NBM/B27 के लिए मीडिया को बदलने
अगले दिन जमा है, और प्रक्रिया को दोहराने.
के लिए लगभग इकट्ठा मीडिया रखें. 2 सप्ताह.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!