Summary
En kombinasjon av avansert optisk teknikker av laserskanning mikroskopi med lang bølgelengde multi Foton fluorescens eksitasjon ble gjennomført for å fange høy oppløsning, tredimensjonale, sanntid bildebehandling for neural crest vs (sox10:EGFP) og vs (foxd3:GFP) sebrafisk embryoer.
Abstract
Medfødt øye og craniofacial anomalier gjenspeiler forstyrrelser i neural toppen, en forbigående befolkningen i vandrende stamceller som gir opphav til mange celletyper i kroppen. Forstå biologi av neural kam er begrenset, gjenspeiler en mangel på genetisk medgjørlig modeller som kan være studert i vivo og i sanntid. Sebrafisk er en særlig viktig utviklingsmessige modellen for å studere vandrende celle populasjoner, som neural toppen. For å undersøke neural crest overføringen i det tredje øyet, ble en kombinasjon av avansert optisk teknikker av laserskanning mikroskopi med lang bølgelengde multi Foton fluorescens eksitasjon implementert for å ta med høy oppløsning, tredimensjonale, sanntid videoer av tredje øyet i transgene sebrafisk embryoer, nemlig vs (sox10:EGFP) og vs (foxd3:GFP), som sox10 og foxd3 har vist mange dyr modeller å regulere tidlig neural crest differensiering og trolig representere markører for neural crest celler. Flere Foton tidsinnstilt bildebehandling ble brukt til å skjelne atferd og vandrende mønstre av to neural crest celle populasjoner bidra til tidlig øye utvikling. Denne protokollen gir informasjon for å generere time-lapse videoer under sebrafisk neural crest overføring, som et eksempel, og kan brukes til ytterligere for å visualisere den tidlige utviklingen av mange strukturer i sebrafisk og andre modellen organismer.
Introduction
Medfødt øyesykdommer kan forårsake barndommen blindhet og er ofte på grunn av unormalt av skallen neural kam. Neural crest celler er forbigående stamceller som oppstår fra medfødte og danne flere vev i kroppen. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Neural crest celler, avledet fra prosencephalon og mesencephalon, gi opphav til beina og brusken til midface og frontal regioner, iris, hornhinnen, trabekulært meshwork, og sclera i anterior segment av øyet. 4 , 6 , 7 , 8 Neural crest celler fra rhombencephalon form disse strukturene buer, kjeven og kardiale utløp skrift. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 studier har fremhevet bidrag av neural kam å okulær og periocular utvikling, understreker viktigheten av disse cellene i virveldyr øye utvikling. Faktisk avbrudd av neural crest celle migrasjon og differensiering føre til craniofacial og okulær avvik observert i Axenfeld-Rieger syndrom og Peters pluss syndrom. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 derfor, en omfattende forståelse av migrasjon, spredning og differensiering av disse neural crest celler vil gi innsikt i kompleksiteten underliggende medfødt øyesykdommer.
Sebrafisk er en effektiv modell organisme for å studere okulær utvikling, strukturer av sebrafisk øyet er lik for pattedyr i papirformat, og mange gener er evolutionarily konservert mellom sebrafisk og pattedyr. 18 , 19 , 20 i tillegg sebrafisk embryoer er gjennomsiktig og oviparous, tilrettelegge visualisering av øye utvikling i sanntid.
Utvide på tidligere publiserte arbeid,6,7,20 vandrende mønster av neural crest celler ble beskrevet ved hjelp av flere Foton fluorescens time-lapse imaging transgene sebrafisk linjene merket med grønne fluorescerende protein (GFP) under transcriptional kontroll av SRY (sex-bestemme region Y)-boks 10 (sox10) eller Forkhead for D3 (foxd3) genet regulatoriske regioner. 21 , 22 , 23 , 24. flere Foton fluorescens tidsinnstilt bildebehandling er en kraftfull teknikk som kombinerer avansert optisk teknikker av laserskanning mikroskopi med lang bølgelengde multi Foton fluorescens eksitasjon å ta høy oppløsning, tredimensjonale bilder av merket med fluorophores. 25 , 26 , 27 bruk av flere Foton laseren har klare fordeler fremfor standard AC confocal mikroskopi, inkludert økt vev gjennomtrengning og nedsatt fluorophore bleking.
Bruker denne metoden, ble to forskjellige populasjoner av neural crest celler i timingen av migrasjon og vandrende veier diskriminert, nemlig foxd3-positive neural crest cellene i periocular mesenchyme og utvikle øye og sox10-positive neural crest i den craniofacial mesenchyme. Med denne metoden er en tilnærming til å visualisere overføringen for okulær og craniofacial neural crest sebrafisk introdusert, gjør det enkelt å observere regulert neural crest overføring i sanntid under utvikling.
Denne protokollen gir informasjon for å generere time-lapse videoer under øyet utviklingen i vs (sox10:EGFP) og vs (foxd3:GFP) transgene sebrafisk, som et eksempel. Denne protokollen kan videre brukes for høy oppløsning, tredimensjonale, sanntids visualisering av utviklingen av alle okulær og craniofacial struktur avledet fra neural crest celler i sebrafisk. Denne metoden kan videre ytterligere brukes for visualisering av utviklingen av andre vev og organer i sebrafisk og andre dyr modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere Foton fluorescens tidsinnstilt bildebehandling generert en rekke videoer som avslørte migrasjon av skallen neural crest celler som gir opphav til craniofacial strukturer og anterior segment av øyet i vs (sox10:EGFP) og vs (foxd3:GFP) sebrafisk linjer. Som et eksempel overføre sox10 -positive neural crest celler mellom 12 og 30 hpf fra kanten av medfødte i den craniofacial regionen (Video 1, figur 2). Cellene fra prosencephalon og mesencephalon overføre dorsal og ventrale å utvikle øyet til å fylle periocular mesenchyme. Dessuten, danner disse sox10 -positive cellene frontonasal prosessen. Neural crest celler fra rhombencephalon overføre ventrally og gi opphav til pharyngeal buene. Time-lapse imaging av foxd3-positive neural crest celler mellom 30 og 60 hpf viste at disse cellene overføres mellom optikk cup og overflate ektoderm og okulær sprekken (Video 2, Figur 3). Disse foxd3-positive celler sentrert rundt objektivet, danner det iris stroma.
Figur 1 . Oppsett. A. hver komponent av embryoet montering apparater, inkludert åpen bad kammer, rask bytte plattform og scenen adapter. B. montering av åpen bad kammeret. C. tillegg 2% agarose løsningen (60-70 ° C) å åpen bad kammeret. D. plassering av embryoet i åpen bad kammeret under fluorescerende mikroskop. E. Embryo (på 24 hpf) plassert sidelengs i midten av polymerized agarose løsningen i åpen bad kammeret. F. tillegg medier på overflaten av polymerized agarose løsningen til dekker embryoet i åpen bad kammeret. G. åpen bad kammer plassert i rask utveksling plattformen og plassert i scenen kortet. H. plassering av embryoet montering apparatet på scenen av flere Foton mikroskopet. I. Laser safe. Skyvedører (1 og 2) for påfylling åpne kammeret er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Representant deconvolved og max anslått bilder fra flere Foton tidsinnstilt bildebehandling av en Tg (sox10:EGFP) sebrafisk embryoet fra 12 til 30 hpf. Sox10 -positive cellene overført fra prosencephalon (P) og mesencephalon (M) til å fylle de periocular mesenchyme (den stiplede sirkelen angir øyet) og frontonasal prosessen (åpne pil). Sox10 -positive celler fra rhombencephalon (R) overført ventrally for å danne pharyngeal buene (lukket pil). Bildene ble innhentet hvert 20 min under tidsrammen og sydd sammen for å lage Video 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Representant deconvolved og max anslått bilder fra flere Foton tidsinnstilt bildebehandling av en vs(foxd3:GFP) sebrafisk embryoet fra 24 til 48 hpf. Foxd3 -positive celler i det fremre kammeret av øyet (stjerne angir linsen) mellom overflaten ektoderm og optikk cup, med flere celler lokalisert til dorsal ("D")-bakre ("P") kvadrant sammenlignet med den fremre ("A") og ventrale ("V") kvadranter. I tillegg overført foxd3 -positive celler tilstøtende til og gjennom okulær sprekken. Bildene ble innhentet hvert 20 min under tidsrammen og sydd sammen for å lage Video 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Representant deconvolved og max anslått bilder fra flere Foton tidsinnstilt bildebehandling av en vs(foxd3:GFP) sebrafisk embryoet fra 30 til 60 hpf. Foxd3 -positive celler i det fremre kammeret av øyet (ytre prikket sirkel angir ytre kantene av øyet, indre prikket sirkel angir linsen) mellom overflaten ektoderm og optikk cup, med flere celler lokalisert til dorsal ("d")-bakre ("p") kvadrant sammenlignet med det fremre ("a") og ventrale ("v") kvadranter. I tillegg foxd3 -positive celler overført tilstøtende til og gjennom okulær sprekken (hvitt pilhode angir migrere neural crest, rød stiplet linje demarcates okulær sprekken). På 60 hpf, foxd3-positive celler helt omringet objektivet (lukket piler), som angir nedleggelsen av sprekken. I tillegg på 60 hpf, foxd3 ble også uttrykt i fotoreseptorer (åpne pilspiss), som ikke var knyttet til uttrykk for dette transkripsjon faktor i neural crest celler. Bildene ble innhentet hvert 20 min under tidsrammen og sydd sammen for å lage Video 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1. Time-lapse video av en vs (sox10:EGFP) sebrafisk embryoet fra 12 til 30 hpf. Stjerne angir øyet. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2. Time-lapse video av en vs (foxd3:GFP) sebrafisk embryoet fra 24 til 48 hpf. Stjerne angir linsen. Stjernen angir okulær sprekken. d, dorsal; v, ventral; p, bakre; en, anterior. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3. Time-lapse video av en vs (foxd3:GFP) sebrafisk embryoet fra 30 til 60 hpf. Stjernen angir linsen. Pilen betyr okulær sprekken. d, dorsal; v, ventral; p, bakre; en, anterior. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere Foton tidsinnstilt bildebehandling kan i vivo sporing av forbigående og vandrende celle populasjoner. Denne kraftige teknikken kan brukes til å studere embryonale prosesser i sanntid, og studien, resultatene av denne metoden forbedret gjeldende kunnskap om neural crest celle migrasjon og utvikling. Tidligere time-lapse imaging studier vanligvis benytte AC confocal mikroskopi for laserskanning. 29 , 30 , 31 , 32 Her presenterer vi bruk av en flere Foton teknikk, som har mange fordeler fremfor tradisjonelle AC confocal mikroskopi. Grunnlaget for flere Foton mikroskopi er at to fotoner lengre infrarøde bølgelengder brukes å opphisse til fluorophore. Som et resultat, er det mindre spredning og dermed redusert bakgrunn, muliggjør dypere vev gjennomtrenging, oppnå tenkelig dypet overstiger 1 mm i biologisk vev med mer effektiv deteksjon enn AC confocal mikroskopi. Disse egenskapene også redusere Phototoksisitet, som er en viktig faktor med gjentatte og hyppige bildeopptak. 25 , 26 , 27 fra disse egenskapene, to-fotonet mikroskopi kan bildet hele-orgel forberedelser og vev i liten-dyr-modeller (f.eks mus, sebrafisk embryoer på 12 hpf - som i tilfelle av studien). Videre aktivere disse små dyremodeller bruk av genetisk kodet fluorescerende proteiner, som kan være lokalisert i vevet rundt. Dermed kan bruk av flere Foton mikroskopi øke bildeopptak for time-lapse eksperimenter.
Det er mange skritt i denne protokollen, som er avhengig av flere Foton laser og oppdagelsen system brukes. De fleste problemer med denne protokollen oppstår med laser innstillingene og oppkjøpet av bilder basert på deteksjon systemet brukes. Erfaring med personlige systemet og tilgang til teknisk støtte er avgjørende. I tillegg er tidligere erfaring med AC confocal mikroskopi for laserskanning nyttig for feilsøking. Videre kan første systemet satt opp være tidkrevende. Men når systemet satt opp er fullført, er bare små justeringer vanligvis nødvendig ved bruk av transgene linje.
Studien, ble sebrafisk embryo mellom 12 og 60 hpf brukt for disse eksperimentene. I denne aldersgruppen er the embryo liten, lett innebygd i agarose og lett bedøvet med tricaine. Men embryoene kan bli vekst og forsinket developmentally avhengig av lengden av eksperimentet. Derfor, må utvises slik at fosteret er riktig iscenesatt på slutten av eksperimentet.
Flere Foton tidsinnstilt bildebehandling gir høy oppløsning, tredimensjonale, sanntids visualisering av celle migrasjon, som ikke bare forbedrer evnen til å studere i vivo sebrafisk embryogenesis, men kan også brukes til mange andre systemer. Selv om omrisset protokollen fokuserer på sebrafisk neural crest celle migrasjon, kan denne teknikken enkelt tilpasses til andre tenkelig formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble økonomisk støttet gjennom tilskudd fra National Eye Institute av National Institutes of Health (K08EY022912-01) og visjon forskning kjernen (P30 EY007003).
Acknowledgments
Forfatterne takker Thomas Schilling for vennlig gifting vs (sox10:eGFP) fisk og Mary Halloran for vennlige gifting vs(foxd3:GFP) fisken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
