Summary
بروتوكولات للتقييم الكمي اللمفاويات إنزيمية والهجرة أدوات هامة لبحوث علم المناعة. ويرد هنا، بروتوكولا في المختبر أن التصاريح في الوقت الحقيقي، متعدد التقييم للهجرة الخلية، وكذلك تكميلية في فيفو تقنية تمكينية تتبع الخلايا الأصلية للطحال.
Abstract
إنزيمية هو الهجرة على طول تدرج كيميائية محددة1. هي المستقطبات chemotactic السيتوكينات التي تشجع الاتجار بالهاتف الخلوي مع الخصائص التشريحية والزمانية2. به وظيفة هامة من الخلايا الليمفاوية والخلايا المناعية الأخرى التي يمكن أن تكون الكمية المقررة في المختبر. هذه المخطوطة يصف الأساليب التي تسمح بتقييم به، سواء في المختبر و في فيفو، لأنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك خطوط الخلايا والخلايا الأصلية. في المختبر، يسمح الشكل القائم على لوحة المقارنة بين شروط متعددة في وقت واحد في الوقت الحقيقي، ويمكن أن تنجز في غضون حاء – 1-4 في المختبر فحص ظروف ويمكن التلاعب بها لإدخال الخصوم، ويضع فضلا عن تميز به من تشيموكينيسيس، وحركة عشوائية. في فيفو الاتجار التقييمات، يمكن تسميته بالأصباغ الفلورية متعددة الخلايا المناعية والمستخدمة لنقل التبني. العلامات التفضيلية للخلايا يسمح للخلايا المختلطة السكان الأخذ في الحيوان نفسه، وبالتالي تقليل التباين وتقليل عدد الحيوانات اللازمة لتجربة تعمل بشكل ملائم. الهجرة في الأنسجة اللمفاوية تحدث في أقل من 1 ساعة، ويمكن أخذ عينات متعددة الأنسجة المقصورات. التدفق الخلوي عقب الحصاد الأنسجة يسمح بإجراء تحليل سريع والكمية لأنماط هجرة العديد من أنواع الخلايا.
Introduction
حصانة قوية يتطلب التنسيق المعقد الزماني والمكاني لعدد هائل أنواع الخلايا من أجل الاستجابة بشكل مناسب للإصابة والعدوى، وتوليد سيلفتوليرانسي. فقد اكتشفت عدة عشرات من مستقبلات تشيموكيني وعلى يغاندس المقابلة وتتسم الآليات الجزيئية تقدم بالخلايا المحددة التي يمكن أن تكون موجهة إلى أنسجة محددة في وقت محدد. وهكذا، دراسة إنزيمية والهجرة عنصرا لا غنى عنه لأبحاث علم المناعة. في الواقع، استخدمت مقايسة الموصوفة في المختبر مؤخرا كأداة لفحص لتحديد مساعد chemotactic أن يسرع به خلايا تي تجاه المستقطبات 19 و 21 ج-ج3. وغرض الأساليب الموصوفة هنا السماح بتقييمات كمية للخلايا المناعية إنزيمية في المختبر و في فيفو.
مقايسة الدائرة Boyden (الهجرة الخلية والغزو) أسلوب غير مكلفة واستنساخه والسريع لتقييم خلية الهجرة4،5. في التحليل القياسي، مجلس الشيوخ هو المصنف مع الخلايا، ويتم فصل بواسطة إدراج مسامية من النواب، التي تهاجر الخلايا. وفي الوقت المطلوب، يمكن إصلاح الخلايا التي تم ترحيلها إلى الجانب السفلي الإدراج والملون كوانتيتاتيون بالفحص المجهري الخفيفة. ومع ذلك، هذه القياسات تحد من جمع البيانات إلى نقطة نهاية واحدة، مما يحول دون جمع البيانات الحيوية ويمكن أن تتطلب التحسين واسعة النطاق لتحديد نقطة الوقت الأمثل للتحليل. هنا، يتم وصف تعديلات عدة تسمح في الوقت الحقيقي، والكمية ومتعدد القياسات من إنزيمية في المختبر.
للدراسات في فيفو ، يتم استخدام نقطة نهاية فنية، إلا وهي تراكم الخلايا في حجرة أنسجة معينة محددة. يتم إدخال الخلايا المسماة من قبل الجهات المانحة إلى الحيوانات المستفيدة من خلال نقل التبني. يمكن بعد ذلك تحديد هذه الخلايا المانحة التدفق الخلوي بعد الحصاد أنسجة المتلقي. وقدم أيضا هو استراتيجية التوسيم المشترك الذي يسمح لتحديد الاتجار بأنواع الخلايا المختلفة داخل حيوانا مستلم واحد. هذا الأسلوب يلغي الاختلاف بين الحيوانات من حقن الخلايا، وحسابات للتقلب بين الحيوان الفسيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع إجراءات أقرتها جامعة روكفلر ' s "رعاية الحيوان المؤسسية" و "استخدام اللجنة". تم إيواء جميع الحيوانات تحت ظروف معينة خالية من مسببات المرض.
1-إنزيمية في المختبر
- الثقافة THP-1 الخلايا 6 في روزويل بارك التذكاري معهد 1640 (RPMI 1640) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و (2-هيدروكسيثيل)-1-4- حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك (حبيس؛ 25 مم) (إتمام الإعلام)، الحفاظ على الكثافة بين 0.5-1.0 × 10 6 خلايا/مل. طبق
- في 35 مم خلية ثقافة، تسمية 3.5 × 10 5 THP-1 الخلايا كل حالة مع أسيتوكسيميثيل كالسين (كالسين-صباحا؛ 2.5 ميكرومتر) أو أخرى صبغة الفلورسنت مناسب في وسائل الإعلام كاملة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30
ملاحظة: يجب أن تكون الأصباغ نفاذية غشاء الخلية ومتوافقة مع وسم الخلية يعيش. - الحارة قبل قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: بالإضافة إلى التحكم في درجة الحرارة، وظيفة الأسفل القراءة مطلوباً أيضا. راجع الخطوة 1.10.2 عن بديل لقارئ لوحة للتحديد الكمي لترحيل الخلايا. - بينما يتم تسمية الخلايا، تعد لوحة المقايسة ومجلس النواب-
لوحة
- استخدام ثقافة الأنسجة 24-جيدا، مع شرط واحد كل بئر. أداء كل شرط في ثلاث نسخ.
- ميليلتر إضافة 750 من هانك ' s خفف الملح الحل (حبس) مخزنة مع 25 مم حبيس و 0.1% البقري ألبومين المصل (BSA) للوحة 24-جيدا. وهذا بمثابة شرط التحكم القاعدية.
آبار
- استخدام أخرى لشروط المقارنة، دائماً الحفاظ على الحجم الإجمالي في الدائرة السفلي في 750 ميليلتر.
ملاحظة: في هذا المثال، يخدم البشرية الوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1) كعنصر إيجابي إنزيمية 7.- تجميع خليط كاشف عن طريق الجمع بين حبس مع 25 مم حبيس، جيش صرب البوسنة (0.1%)، والعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 (75 نانوغرام/ملليلتر). استخدام مصل بقرى الكبار (2.7% v/v) مع العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 كعنصر إيجابي إضافي.
ملاحظة: يتوقف تركيز تشيموكيني وتشيموكيني على المحور تشيموتاكتيك قيد الدراسة. هو حراكه العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 المجففة بالتبريد في الماء المقطر مع جيش صرب البوسنة (0.1 ٪) لجعل حل أسهم بتركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل. وهذا يمكن أن تضعف في المياه لإيجاد حل عملي من 10 ميكروغرام/مل. إضافة ميكروليتر 5.6 هذا الحل إلى مجلس النواب-
- تجميع خليط كاشف عن طريق الجمع بين حبس مع 25 مم حبيس، جيش صرب البوسنة (0.1%)، والعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 (75 نانوغرام/ملليلتر). استخدام مصل بقرى الكبار (2.7% v/v) مع العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 كعنصر إيجابي إضافي.
- استخدام أخرى لشروط المقارنة، دائماً الحفاظ على الحجم الإجمالي في الدائرة السفلي في 750 ميليلتر.
- بعد اكتمال تشكيل الدوائر أسفل مكان إدراج مسامية في كل بئر، ضمان أن الإدراج علامات تبويب محاذاة مع الشقوق اللوحة.
ملاحظة: اختر حجم المسام المناسبة لإدراج. وحيدات الخلايا الليمفاوية، وحجم مسام ميكرومتر 3 أداء جيدا. قد تتطلب بعض أنواع الخلايا و/أو أنظمة تشيموكيني على سطح معدني مغلف بمصفوفة للهجرة المثلى. على سبيل المثال، لقياس THP-1 الوحيدات به نحو العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1, فيبرونيكتين أو إدراج المغلفة بالكولاجين ينصح. يجب أن يكون الإدراج لوحة للقارئ كوانتيتاتيون، طلاء ضوء إيمبيرميانت، مثل البولي ايثلين، لمنع الكشف عن عدم ترحيل الخلايا في الجزء العلوي للدائرة 8.
- بعد حضانة الخلايا لمدة 30 دقيقة مع كالسين صباحا، نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. فحص خلايا أجهزة الطرد المركزي في 1,000 ز x للحد الأدنى 2 بصريا الخلايا للتأكد من الإقبال على كالسين-صباحا ( الشكل 1).
- بعناية إزالة المادة طافية باستخدام الشافطة فراغ. أغسل المسمى خلايا خالية من المصل ربمي 1640 تستكمل مع حبيس 25 مم. الطرد المركزي خلايا في 1,000 س ز 2 دقيقة وتجاهل المادة طافية.
- الخلايا ريسوسبيند في المصل خالية ربمي 1640 تستكمل مع حبيس 25 مم. حساب عدد الخلايا وضبط مستوى الصوت حيث تكون الخلايا بتركيز نهائي من 1.0-1.5 × 10 6 خلايا/مل.
- الاستغناء عن 250 ميكروليتر من تعليق خلية في الإدراج (مجلس الشيوخ)-
- بعد جميع الدوائر العليا قد ملئت، بلطف رفع اللوحة، وفحص الجزء السفلي من فقاعات الهواء التي قد تتداخل مع الهجرة والكشف عن وجود. لإزالة فقاعة، أول محاولة إزالة ثم إعادة تعيين موضع الإدراج. إذا فشل، استخدم إبرة ز 27 لثقب الفقاعة، وثم إعادة تحديد موضع الإدراج.
- بوضع اللوحة في قارئ لوحة قبل حرارة 37 درجة مئوية.
- الحصول على قراءات الأسفار من أسفل عند فواصل زمنية دقيقة 1-3. عند استخدام كالسين-صباحا، تعيين الأسفار أطوال موجية الإثارة والانبعاثات في 485 نانومتر و 520 نانومتر، على التوالي. الاعتماد على نظام تشيموكيني ونوع الخلية، تحدث به عادة ما يزيد على 1-4 ح ( الشكل 2A).
- كبديل للقياسات المستمرة باستخدام قارئ لوحة، صورة الآبار باستخدام مقلوب فلورسنت مجهر ( الشكل 2) قادرة على الإثارة والكشف عن الضوء في 485 نانومتر و 520 نانومتر، على التوالي. استخدم تكبير منخفض لالتقاط معظم الجانب السفلي الإدراج. تحديد الخلايا بمعالجة الصور مع إيماجيج أو برامج مماثلة 9.
2. نقل التبني "لمفاوية مورين"
- أنيسثيتيزي 8-12 أسبوع من إعداد الخلايا المانحة-الفئران الذكور المانحة C57BL/6J القديمة مع isoflurane التخدير (1-3%) باستخدام المبخر. تأكيد عمق المناسبة للتخدير بأصبع القدم-قرصه-
- ضع الماوس في موقف ضعيف. جعل شق خط الوسط مع مشرط وتحديد موقع الطحال في الفضاء البريتوني الأيسر العلوي. المكوس الطحال كلها وفي وسائل الإعلام كاملة (RPMI تستكمل مع 10% FBS و 25 مم هيبيس؛ 1 مل/الطحال) على الجليد. Euthanize الحيوانات تخديره من الجهات المانحة بقطع الرأس-
- طحن أنسجة الطحال بلطف من خلال 40 ميكرون النايلون في وسائط كاملة (1 مل/spleen) باستخدام نهاية المكبس حقنه لجعل تعليق خلية واحدة ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- 4 إضافة كميات من كلوريد الأمونيوم البوتاسيوم (ACK) تحلل المخزن المؤقت واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة الكريات الحمراء.
- الطرد المركزي الخلايا في 1,000 س ز 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية. إذا بقيت الكريات الحمراء في بيليه، ريسوسبيند في المخزن المؤقت لتحلل ACK، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي خلايا في غ س 1,000 لمدة 2 دقيقة وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام كاملة بتركيز 2-5 × 10 7 خلايا/مل، ثم سلالة تعليق خلية عن طريق شبكة نايلون 40 ميكرون لإزالة الحطام الخلية. يعيش
- التسمية 1 × 10 7 خلايا والمتلقي الماوس مع صبغة فلورسنت متوافقة مع الخلايا، والتي سيتم الاحتفاظ عند التثبيت لاحقاً، مثل 5-تشلوروميثيلفلوريسسين اسيتات (تركيز نهائي 2 ميكرومتر) 10 . احتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30
ملاحظة: لتعقب السكان خلية واحدة أو أكثر، استخدم الأصباغ الفلورية الأخرى مع السكان خلية إضافية. سبيل، يمكن أن توصف بجزء من خلايا المانحين مع البنزويل 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)) الأمينية) تيتراميثيلرهوداميني (تركيز نهائي 2 ميكرومتر) 11- - إضافة 4 وحدات حبس تكملها 25 مم هيبيس، ثم الطرد المركزي في س 1,000 ز 2 دقيقة وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه في حبس وتستكمل مع حبيس 25 مم بتركيز 1 × 10 8 خلايا/مل نهائي.
- في حالة استخدام أكثر من صبغة الفلورسنت، إبقاء السكان خلية منفصلة حتى قبل الحقن مباشرة.
- نقل من قاسمة صغيرة (10 ميكروليتر) من الخلايا لكل لون إلى حل مثبت (1 مل) تعويض اللاحقة التدفق الخلوي-
- ونقل الخلايا الليمفاوية
- تخدير الأسبوع 8-12-القديمة C57BL/6J ذكور الفئران المستفيدة مع إيسوفلوراني (1-3%) باستخدام المبخر؛ تأكيد عمق التخدير عن طريق رشة إصبع القدم. تطبيق مرهم البيطرية للحيوان ' العيون s لمنع تجفيف.
- بإيجاز دوامة المانحة الخلايا (1 ثانية) ونقل إلى 1 مل حقن حقنه مع 27 غ، 0.5 في إبرة، الجمع بين السكان خلية مسماة متفاوتاً، إذا كان ذلك ممكناً.
- نقل من قاسمة صغيرة (10 ميكروليتر) من الخلايا المختلطة إلى حل مثبت (1 مل) لتحليل تدفق اللاحقة الخلوي-
- مكان الحيوانات المانحين في موقف المعرضة. تطبيق الضغط والذيلية خفيفة على الجلد الظهرية للعين، مما تسبب في مقلة العين نتا قليلاً.
- المباشر الإبرة ميديالى وحقن 100 ميليلتر من تعليق الخلية المانحة الرجعية أوربيتالي كل الماوس المتلقية. ويمكن أيضا حقن الخلايا عن طريق الوريد الذيل.
- تدريجيا سحب إبرة حقن وضع الماوس وحدها في قفص انتعاش. مراقبة الحيوانات حتى قد وعيه؛ عودة مرة تماما المستردة الحيوان للإسكان الاجتماعي-
- جمع وتحليل
- بعد ح 1، تخدير الفئران المستفيدة مع التخدير إيسوفلوراني (1-3%) باستخدام المبخر؛ وتأكيد عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين. حصاد الطحال (أو الأنسجة الأخرى للفائدة) (الخطوة 2.1.2.) من كل مستلم الماوس والمكان إلى وسائط كاملة (1 مل والمتلقي). Euthanize الحيوانات تخديره بقطع الرأس-
ملاحظة: سوف تزيد فترات أطول قبل الحصاد الأنسجة تراكم الأنسجة من خلال على الأقل 24 h. - طحن أنسجة الطحال بلطف من خلال 40 ميكرون النايلون في وسائط كاملة باستخدام نهاية المكبس حقنه لجعل تعليق خلية واحدة ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. المخزن المؤقت
- 4 إضافة مجلدات من تحلل ACK واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي من تعليق خلية في 1,000 س ز 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل المادة طافية. المخزن المؤقت
- الخلايا ريسوسبيند في تلطيخ (المالحة مخزنة الفوسفات وتستكمل مع 1% FBS). حساب عدد الخلايا وضبط لتركيز نهائي من 3 × 10 7 خلايا/مل. نقل 100 ميليلتر من تعليق خلية إلى 96-فضلا عن جولة أسفل لوحة.
- الخلايا وصمة عار لعلامات المطلوب (انظر الجدول للمواد) لتحليل التدفق الخلوي. إضافة الأجسام المضادة مترافق fluorophore (انظر "الجدول للمواد") ضد علامات المرجوة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام. إضافة 100 ميليلتر تلطيخ المخزن المؤقت، الطرد المركزي خلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر تلطيخ المخزن المؤقت، الطرد المركزي خلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق وتجاهل المادة طافية. المخزن المؤقت
- ريسوسبيند بيليه في تلطيخ ميليلتر 125 والحصول على العينات باستخدام سيتوميتير تدفق استخدام إجراءات معيارية.
ملاحظة: صبغة الأخضر هو متحمس بليزر 488 نانومتر ويتم الكشف عن الانبعاثات مع المرشحات مزدوج اللون 505 و 530/30. صبغة اللون البرتقالي هو متحمس من 561 الكشف عن شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات بواسطة عامل تصفية مزدوج اللون 582/15.- استخدام حفظ الخلايا من 2.1.8.2 للتعويض عن كل صبغة الفلورسنت.
ملاحظة: استخدام التعويض على أساس حبة مع fluorophores مطابقة بالإثارة وأطياف الانبعاث من الأصباغ التوسيم سيؤدي في التعويض دون المستوى الأمثل. - استخدام خلايا الإدخال المحفوظة من الخطوة 2.2.2.1 لدقة تحديد النسبة الأثران المسمى خلايا الإدخال في حالة استخدام واحد أو أكثر من السكان المسمى ( الشكل 3). حساب الأنسجة الهجرة محددة استناداً إلى النسبة المسمى للخلايا غير مسمى ( الشكل 4).
- استخدام حفظ الخلايا من 2.1.8.2 للتعويض عن كل صبغة الفلورسنت.
- بعد ح 1، تخدير الفئران المستفيدة مع التخدير إيسوفلوراني (1-3%) باستخدام المبخر؛ وتأكيد عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين. حصاد الطحال (أو الأنسجة الأخرى للفائدة) (الخطوة 2.1.2.) من كل مستلم الماوس والمكان إلى وسائط كاملة (1 مل والمتلقي). Euthanize الحيوانات تخديره بقطع الرأس-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند استخدام صبغة كالسين-صباحا، سيؤكد التفتيش البصري لخلايا امتصاص التسمية (الشكل 1). سوف تتبع القراءات الفلورسنت الآلي الهجرة كخلايا العبور على الجانب السفلي من الإدراج على مر الزمن. هذه البيانات تظهر بوضوح تنظيم دورات تعريفية للهجرة الخلية نحو العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، فضلا عن زيادة هذه الاستجابة بالمصل (الشكل 2A). حسب قوة الحافز المهاجرة، هناك تأخير لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل حدوث زيادة في الإشارات. قد ذروة إشارة الفلورسنت وثم تنخفض تدريجيا. وهذا يمثل انخفاضا صافياً في عدد الخلايا التمسك بالجانب السفلي الإدراج الخلايا تمر في الحل في مجلس النواب بمعدل أسرع من الخلايا المهاجرة من مجلس الشيوخ. أقوى المحفزات الكثيرة الارتحال يؤدي عادة) السابقة بداية من ارتفاع في قيم الأسفار؛ ب) أسرع من معدل الزيادة في الأسفار؛ وج) أعلى قيم fluorescence الذروة. كما تظهر الصور التمثيلية التي حصل عليها المجهر المقلوب الأسفار (الشكل 2)، مع كوانتيتيشن عدد خلايا (الشكل 2).
في فيفو دراسات استخدام التسمية فلوري واحد أو أكثر، من المهم أن قوانتيتاتي النسبية نسبة السكان خلية في المدخلات المادية. وهذا يفسر التباين في خلط السكان خلية للحقن (الشكل 3). وفي هذه الحالة، كانت نسبة الخلايا الخضراء والبرتقالي الفلورسنت 0.97:1. وهكذا، لحساب هذا الخلل الطفيف، خلية أخضر نيون التهم كانت مقسوماً على 0.97 لمؤشر أرقام ما يتناسب مع المواد المدخلة. بعد تحديد كمية الخلايا المسماة بالتدفق الخلوي، الاتجار يمكن قياسها كمياً كما عدد الخلايا المسماة تعافي مقسوماً على العدد الكلي للخلايا التي تم استردادها.
هذه النتائج تدل على الاستفادة من استخدام استراتيجية ثنائية اللون، الذي يلغي تأثير متفاوتة الحقن بفعالية؛ بينما يوجد تباين كبير من الخلايا المستردة بين الحيوانات، للحيوان معين أي نسبة الخلايا الفلورية الخضراء إلى اللون البرتقالي الفلورسنت تقريبا متساوية (الشكل 4). هذه النتائج ومن المتوقع، كالخلية اثنين يعاملون السكان مطابق تماما، ولكن يمكن اختبار اضطرابات شتى لأثرها على صاروخ موجه اللمفاويات. الانحراف عن خط الهوية تشير إلى قدرات المهاجرة المختلفة للسكان خلية معينة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد مجموعات فرعية خلية متعددة بواسطة تلطيخ الخلايا المستردة للبروتينات المطلوبة. هنا، كما استعادت خلايا تي، يتبين من تلطيخ CD3، والخلايا البائية، يتبين من تلطيخ CD19 بنسب متساوية من الخلايا الخضراء إلى اللون البرتقالي الفلورسنت.
رقم 1: تسمية الخلية. ويؤكد الفحص البصري لبيليه الخلية بعد وضع العلامات الإقبال الكافي من الفلورسنت الصبغة (يسار)، على العكس من قبل وضع العلامات (يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: القياس الكمي المختبر في الهجرة. (أ) بيانات تمثيلية (يعني ± الخطأ القياسي) المكتسبة في الوقت الحقيقي من قارئ لوحة مقارنة الظروف 3: وسائل الإعلام (مراقبة)، تشيموكيني (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، 75 نانوغرام/مليلتر) أو تشيموكيني مع المصل (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، 75 مصل نانوغرام/مليلتر والأبقار، 2.7% v/v في المخزن المؤقت). القراءات التي تم الحصول عليها من الجانب السفلي لوحة كل دقيقة 3 مع الطول موجي إثارة للطول الموجي نانومتر والكشف عن 485 من 520 نانومتر. (ب) ميكروجرافس الممثل في 4 X التكبير من الجانب السفلي للإدراج في ح 1، الذي يسمح التصور المباشر لترحيل الخلايا. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر (أصفر). (ج) التحديد الكمي لعدد الخلايا في كل حقل بالطاقة المنخفضة (قائمة بيم فورتين؛ 4 X) باستخدام برنامج إيماجيج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الملون خلايا الإدخال. التدفق الخلوي الأرض عرض نسبة هما الأثران الملون السكان خلية في حقن خلية الإدخال من الخطوة 2.2.2.1. يعمل على تصحيح للفرق التي أدخلت خلال خلط الأولية للسكان هما نسبة تحدد من هذه المؤامرة ويستخدم لضبط عدد خلايا أثناء تحليل البيانات المتلقين للمعلومات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 4: نسبة الخلايا المسماة المستردة من الطحال حيوانات المتلقية. يتم عرض نسب الخلايا الفلورسنت الأخضر أو البرتقالي الفلورسنت كنسبة مئوية من سبلينوسيتيس المستردة المجموع، مع كل نقطة بيانات تمثل حيوانا مستلم واحد. المجموع المسمى خلايا يتم عرضها (مثلث)، فضلا عن المجموعات التي الملون أيضا إيجابية لعلامات سطح الخلية CD19 (مربعة) أو CD3 (دائرة). خط متقطع خط الهوية حيث هو النسبة بين ألوان يساوي 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التحديد الكمي للهجرة الخلية المناعية يمكن إنجازه باستخدام بسيطة وسريعة فحوصات في المختبر و في فيفو. نظهر إنزيمية في المختبر من وحيدات البشرية استجابة للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 التدرج والتعزيز بالمصل. في فيفو، كان متفاوتاً المسمى المانحة مورين سبلينوسيتيس وعقب نقل التبني، استعيدت من الحيوانات المتلقية.
استخدام قارئ لوحة يتميز بأخذ عينات من عدد من النقاط الزمنية (غالباً ككل 30 s) وأتمتة كوانتيتاتيون ترحيل الخلايا. هذا يغني عن الحاجة إلى اختيار نقطة مرة واحدة للتقييم، وتجنب أساليب كثيفة العمالة أكثر من العد اليدوي من الآبار الفردية. وعلاوة على ذلك، توفر هذه الطريقة معلومات أكثر دينامية مما يمكن جمعها بالفحص المجهري. أثناء تحليل فإنه يجب أن يوضع في الاعتبار أن الخلايا سوف تسقط الإدراج في الدائرة السفلي، ولن تسهم في شدة الأسفار. وهكذا، عدد الخلايا في الجانب السفلي الإدراج، سيكون كما هو مبين بالأسفار النسبي، وظيفة من معدل الهجرة ومعدل التي تسقط الخلايا الإدراج.
خلايا أكبر قد تتطلب إدراج مع المسام الكبيرة، وتتوفر 8 ميكرومتر المسامية إدراجات. قد لا يكون مشرق بما فيه الكفاية موثوق يمكن الكشف عنها بواسطة فلوريميتير أصغر الخلايا (بما في ذلك الخلايا الليمفاوية الأم) وقد تتطلب التقييم بالفحص المجهري، خاصة بالنسبة للتغيرات الصغيرة في إنزيمية. بعض أنواع الخلايا قد تنتقل سريعاً إلى حل الدائرة السفلي وليس لديها وقت إقامة طويلة بما يكفي على إدراج يتم الكشف عن، أسفر عن منحنى مسطح. وفي هذه الحالة، خلايا يمكن قياسها كمياً بالخلوي مباشرة من حل الدائرة السفلي، أو يمكن استخدامها إدراج المغلفة بمصفوفة لإطالة وقت العبور بالإضافة إلى استخدام إدراج مع مسام أصغر حجماً (مثل 1 ميكرومتر).
حاسمة بالنسبة لهذه الاختبارات يتم تحديد شروط الهجرة قوية. للدراسات في المختبر ، نوع الخلية درس يجب أن تكون قادرة على الاستجابة تشيمواتراكتانت، ويجب النظر في العوامل المشتركة الضرورية. قد يكون الأمثل المطلوب لكثافة الخلية قدم في مجلس الشيوخ. بشكل عام، سيؤدي إلى زيادة كثافة إشارة أقوى، ولكن هذا يحتاج إلى موازنة إشارة هجرة غير المحددة أعلى. اختبار مجموعة من تركيزات chemoattractant قد تساعد أيضا التعرف على أحد الإطارات زمنية مناسبة للاستيلاء على الهجرة.
هذا الأسلوب يمكن تكييفها لاستخدام ألوان متعددة. وهذا سيقلل تصور تقلب، فضلا عن زيادة عدد الشروط التي يمكن تضمينها في مقايسة واحدة. أن الاعتبار الرئيسي هنا هو سطوع الأصباغ الفلورية. كالسين-ص مشرق للغاية وذلك بسهولة تم الكشف عنها بالمجهر ولوحة تطبيقات قارئ. في حين الأصباغ المستخدمة للدراسات في فيفو لم الكشف عن سهولة بالفحص المجهري وأنتجت خلفية عالية؛ يفترض هذا أيضا يحول دون كشف قارئ لوحة دقيقة.
للدراسات في فيفو ، صحة الخلايا المانحة مهم للحفاظ على وظيفتها المهاجرة. وينبغي أن يتم حصاد الخلايا المانحة كجزء من جراحة غير البقاء على قيد الحياة، بدلاً من التضحية بالحيوان المانح والحصاد ثم الخلايا، مما يزيد من احتمال وفاة الاسكيمية، والخلية. الوقت بين الحصاد والحقن هو أحد الاعتبارات هامة للتجارب التي تستخدم فيها السكان خلية مختلفة؛ مستوى الاختلاف أو التشابه بين السكان خلية قد تتغير بمرور الوقت. وقت التجهيز بعد الحصاد من الجهة المانحة حتى ينبغي التقليل من الحقن إلى المستلم. أيضا، من الحيوي أيضا توافق الجهات المانحة والمتلقية. سيتم رفض الخلايا البشرية سريعاً من الفئران، على الرغم من الأنواع داخل الخلايا متمكنة جيدا التحمل على مدى فترات قصيرة. على سبيل المثال، لا نجد فرقا في ترحيل وتستخدم الخلايا مع المانحين C57BL/6J أو بالب/cJ مع المستلمين C57BL/6J على مدى فترة من ح 1.
هذا الأسلوب في فيفو مفيد لتقييم الاختلافات في القدرة على الهجرة. كل إدخال الخلايا والحيوانات المستلم يمكن أن يخضع لاضطرابات دوائية أو غيرها. وبالمثل، يمكن أن يتعرض الحيوانات المتلقية للمحفزات المعدية أو التهاب، أو العلاجات الأخرى التي تؤثر على الاتجار اللمفاويات12. يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول سهولة إلى خطوط الماوس المحورة وراثيا. على وجه الخصوص، الذين يعبرون عن البروتينات الفلورية سيؤدي إلى تفادي الحاجة لوضع العلامات ويمكن تحفيز الاستراتيجيات المتنوعة.
من المهم ملاحظة أن الوقت التي يختلط فيها السكان خلية مختلفة قبل الحقن ينبغي أن تخفض بقدر الإمكان. ينبغي أن تكون مختلطة السكان خلية مسماة خلطات إلا بعد الحيوانات المتلقية قد تم تخديره تماما وهي جاهزة للحقن. يمكن خلط الأصباغ الموجودة في مختلف قطاعات السكان، أسفر عن فصل غير واضح بين البلدين عندما حللت بالتدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، أن شروط معاملة مختلفة يمكن أن تؤثر على الخلايا غير المعالجة خلال هذا الوقت. على سبيل المثال، يمكن نقل العوامل التي تربط إلى سطح الخلية إلى الخلايا غير المعالجة، والخلط وبالتالي النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها "البرنامج شوارتز لام برنارد" "الطبيب العلماء" في جامعة روكفلر، صندوق التنمية العلاجية روبرتسون في "جامعة روكفلر"، ومركز ساكلير للطب الحيوي وأبحاث التغذية في جامعة روكفلر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
- Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
- West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
- Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
