Summary
Protocoles pour une évaluation quantitative de la chimiotaxie des lymphocytes et des migrations sont des outils importants pour la recherche de l’immunologie. Un protocole in vitro est décrit ici, que les permis en temps réel, multiplexés évaluation de la migration cellulaire, ainsi qu’un complémentaire en vivo technique propice suivi de cellules natives de rate.
Abstract
La chimiotaxie est migration le long du gradient chimique spécifique1. Chimiokines sont chimiotactiques cytokines qui favorisent le trafic cellulaire avec spécificité anatomique et temporelle2. La chimiotaxie est une fonction critique des lymphocytes et autres cellules immunitaires pouvant être quantitativement évalués in vitro. Ce manuscrit décrit des méthodes qui permettent l’évaluation de la chimiotaxie, in vitro et in vivo, pour les types de cellules différents y compris les lignées cellulaires et les cellules natives. L' in vitro, budgétisation axée sur les plaques permet la comparaison de plusieurs conditions simultanément en temps réel et peut être complétée en 1-4 h. essai In vitro avec des conditions peuvent être manipulées pour introduire des agonistes et des antagonistes, comme ainsi que différencier la chimiotaxie des chemokinesis, qui est le mouvement aléatoire. En vivo traite les évaluations, les cellules immunitaires peuvent être étiquetés avec les colorants fluorescents multiples et utilisés pour transfert adoptif. L’étiquetage différentielle des cellules permet aux populations de cellules mixtes destinés à être introduits dans le même animal, ce qui diminue l’écart et réduit le nombre d’animaux requis pour une expérience suffisamment alimentée. Migration dans le tissu lymphoïde se produit dedans aussi peu que 1 h, et plusieurs compartiments tissulaires peuvent être dégustés. Cytométrie en flux après la récolte du tissu permet une analyse rapide et quantitative des schémas migratoires de plusieurs types de cellules.
Introduction
Immunité solide nécessite la coordination temporelle et spatiale complexe d’une multitude de types de cellules afin de répondre de manière appropriée à l’injure, infection et générer autotolérance. Plusieurs dizaines récepteurs de chimiokines et de leurs ligands correspondantes ont été découverts et caractérisé des mécanismes moléculaires par lesquels les cellules spécifiques peuvent être arrangés en un tissu spécifique à un moment précis. Ainsi, étudier le chimiotactisme et la migration est un élément indispensable de la recherche de l’immunologie. En effet, le test décrit dans vitro a récemment été utilisé comme un outil de dépistage pour identifier un cofacteur chimiotactique qui accélère le chimiotactisme des cellules T vers le C-C chimiokines 19 et 213. Le but des méthodes décrites ici sont de permettre une évaluation quantitative du chimiotactisme des cellules immunitaires in vitro et in vivo.
L’essai de chambre de Boyden (migration cellulaire et l’invasion) est une méthode rapide, reproductible et peu coûteuse pour évaluer la migration de cellules4,5. Dans l’essai standard, la chambre supérieure est ensemencée avec des cellules et est séparée par un insert poreux d’une chambre basse, dans laquelle les cellules migrent. Au moment voulu, les cellules qui ont migré vers le dessous de l’insert peuvent être fixe et colorées pour le dosage au microscope photonique. Toutefois, ces mesures restreignent la collecte de données à un seul point de fin, qui s’oppose à une collecte de données dynamique et peuvent exiger optimisation approfondie pour déterminer le point de temps optimal pour l’analyse. Ici, plusieurs adaptations sont décrits qui permettent des mesures en temps réel, quantitatives et multiplexés de chimiotactisme in vitro.
Pour des études in vivo , un point de terminaison fonctionnel est utilisé, à savoir l’accumulation spécifique des cellules dans un compartiment de tissu donné. Cellules donneuses préalablement étiquetées sont introduits dans les animaux receveurs par transfert adoptif. Ces cellules du donneur soient reconnaissables par la suite par cytométrie en flux après la récolte de tissus destinataire. Également présenté est une stratégie co étiquetage qui permet la détermination de la traite des différents types de cellules au sein d’un seul animal receveur. Cette méthode élimine la variation inter animale de l’injection de cellules et représente la variabilité physiologique des animale.
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Protocol
toutes les procédures ont été approuvées par la Rockefeller University ' s Institutional Animal Care et Comité d’urbanisme. Tous les animaux étaient logés dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes.
1. In Vitro chimiotactisme
- Culture THP-1 cellules 6 dans Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 4-(2-hydroxyéthyl) -1- acide piperazineethanesulfonic (HEPES ; 25 mM) (toutes les médias), maintenir la densité entre 0,5 à 1,0 x 10 6 cellules/mL.
- La culture de cellules dans un 35 mm plat, étiquette de 3.5 x 10 5 THP-1 de cellules par État calcéine acétoxyméthyl (calcéine-AM ; 2,5 µM) ou autre colorant fluorescent dans des médias complets à 37 ° C pendant 30 min.
Remarque : Les colorants doivent être perméable à la membrane cellulaire et compatible avec les cellules vivantes étiquetage. - Chaude avant un lecteur de plaque à 37 ° C.
Remarque : En plus du contrôle de la température, la fonctionnalité de lecture de fond est également nécessaire. Voir l’étape 1.10.2 pour une alternative à l’aide d’un lecteur pour la quantification de la migration des cellules. - Tandis que les cellules sont étiquetage, préparer la plaque de test et de la chambre basse.
- Utiliser une culture de tissu de 24 puits plaque, avec une condition / puits. Effectuer chaque condition en trois exemplaires.
- Ajouter 750 µL de Hank ' s Solution saline tamponnée (HBSS) tamponnée avec 25 mM HEPES et 0,1 % sérum albumine bovine (BSA) à la plaque 24 puits. Cela sert comme la condition de contrôle basal.
- Utilisation autre puits pour des conditions de comparateur, gardant toujours le volume total dans la chambre inférieure à 750 µL.
NOTE : Dans cet exemple, humaine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) sert de témoin positif pour la chimiotaxie 7.- Assemble le mélange réactif en combinant HBSS avec 25 mM HEPES, BSA (0,1 %) et le MCP-1 (75 ng/mL). Utiliser du sérum bovin adult (2,7 % v / v) avec un contrôle positif supplémentaire MCP-1.
NOTE : Concentration de chimiokines et chimiokines dépendra de l’axe chimiotactique sous étude. Lyophilisé MCP-1 est remis en suspension dans l’eau distillée avec BSA (0,1 %) pour faire une solution avec une concentration finale de 50 μg/mL. Cela peut être dilué dans l’eau pour une solution de travail de 10 μg/mL. Ajouter 5,6 μl de cette solution à la chambre basse.
- Assemble le mélange réactif en combinant HBSS avec 25 mM HEPES, BSA (0,1 %) et le MCP-1 (75 ng/mL). Utiliser du sérum bovin adult (2,7 % v / v) avec un contrôle positif supplémentaire MCP-1.
- Utilisation autre puits pour des conditions de comparateur, gardant toujours le volume total dans la chambre inférieure à 750 µL.
- Après la composition des chambres bas est terminée, placer un insert poreux dans chaque puits, en veillant à ce que les onglets de l’insert s’alignent avec les encoches de la plaque.
Remarque : Choisir la taille des pores approprié pour les inserts. Pour les monocytes et les lymphocytes, une taille de pore de 3 μm fonctionne bien. Certains types de cellules et de chemokine peuvent nécessiter une surface enduite matrice de migration optimale. Par exemple, pour la mesure de la chimiotaxie monocyte THP-1 vers MCP-1, la fibronectine ou insertions enduit de collagène sont recommandées. Pour lecteur de plaque pour le dosage, l’insert doit avoir un revêtement lumineux-imperméants, comme le polyéthylène téréphtalate, afin d’éviter la détection de non migratrice cellules dans la haute chambre 8.
- Après incubation des cellules pendant 30 min avec calcéine-AM, transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15mL. Cellules de centrifugation à 1 000 x g pendant 2 min. inspectent visuellement les cellules afin de confirmer l’absorption de calcéine-AM ( Figure 1).
- Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’un aspirateur sous vide. Laver les cellules marquées en milieu sans sérum RPMI 1640 additionné de HEPES 25 mM. Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 2 min et éliminer le surnageant.
- Remettre les cellules en milieu sans sérum RPMI 1640 additionné de HEPES 25 mM. Compter les cellules et ajuster le volume pour que les cellules soient à une concentration finale de 1,0 à 1,5 x 10 6 cellules/mL.
- Distribuer 250 μL de la suspension cellulaire dans l’insert (chambre haute).
- Après que toutes les cavités supérieures ont été pourvues, soulever délicatement la plaque et inspectent le dessous de la présence de bulles d’air qui peuvent interférer avec la migration et la détection. Pour supprimer une bulle, tout d’abord essayez de supprimer puis repositionner l’insert. En cas d’échec, utiliser une aiguille de 27 G pour percer la bulle et puis re-positionner l’insert.
- Placer la plaque dans le lecteur de plaque préchauffée 37 ° C.
- Acquire lectures de fluorescence du fond à intervalles de 1-3 min. Lorsque vous utilisez calcéine-AM, fixé la fluorescence des longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 485 nm et 520 nm, respectivement. Selon le système cellulaire de type et des chimiokines, chimiotactisme produit généralement sur une période de 1 à 4 h ( Figure 2 a).
- Comme une alternative aux mesures en continu à l’aide d’un lecteur de plaque, image des puits à l’aide d’un microscope fluorescent inversé ( Figure 2 b), capable d’excitation et de détection de la lumière à 485 nm et 520 nm, respectivement. Utiliser un grossissement faible pour capturer la majorité du dessous de l’insert. Quantifier les cellules en traitant les images avec ImageJ ou similaire du logiciel 9.
2. Transfert adoptif de Lymphocytes murins
- préparation de cellules du donneur
- anesthésier 8-12 semaines-vieux souris mâles donneurs de C57BL/6J avec anesthésie isoflurane (1-3 %) à l’aide d’un vaporisateur. Confirmer la profondeur appropriée de l’anesthésie par orteil-pinch.
- Placer la souris dans la position en décubitus dorsal. Faire une incision médiane avec un scalpel et localisez la rate dans l’espace péritonéal gauche supérieur. Excise la rate toute et placez dans médias complet (RPMI additionné de 10 % FBS et 25 mM HEPES ; 1 mL/rate) sur la glace. Euthanasier les animaux donneurs anesthésiés par décapitation.
- Moudre tissu rate doucement à travers la maille en nylon de 40 µm dans les médias complets (1 mL /spleen) à l’aide de l’extrémité d’un piston de la seringue pour faire une suspension monocellulaire et le transfert d’un tube conique de 15 mL.
- Ajouter 4 volumes de la lyse de potassium (ACK) de chlorure d’ammonium de la mémoire tampon et incuber pendant 5 min à température ambiante pour la lyse des érythrocytes.
- Centrifuger les cellules à 1 000 x g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant. Si les érythrocytes restent dans le culot, remettre en suspension dans le tampon de lyse ACK, incuber pendant 5 min à température ambiante, centrifuger des cellules à 1 000 x g pendant 2 min et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans les médias à une concentration de 2-5 x 10 7 cellules/mL, puis la suspension de cellules de la souche à travers une maille en nylon de 40 µm pour éliminer les débris cellulaires.
- Label 1 x 10 7 souris de cellules/destinataire avec un colorant fluorescent compatible avec vivre les cellules et qui sera retenu lors de la fixation ultérieure, par exemple 5-chloromethylfluorescein diacétate (concentration finale 2 μM) 10 . Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
Remarque : Pour suivre plus d’une population de cellules, utilisez autres colorants fluorescents avec des populations de cellules supplémentaires. Par exemple, une partie des cellules du donneur peut être marquée avec benzoyle 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)) amino) tétraméthylrhodamine (concentration finale 2 μM) 11. - Ajouter 4 volumes HBSS additionné 25 mM HEPES, puis centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min, puis jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans HBSS additionné de HEPES 25 mM à une concentration finale de 1 x 10 8 cellules/mL.
- Si vous utilisez plus d’un colorant fluorescent, maintenir les populations de cellules séparées jusqu'à ce qu’immédiatement avant l’injection.
- Transférer une petite portion (10 μL) de cellules de chaque couleur à une solution de fixation (1 mL) d’indemnisation de cytométrie en flux ultérieurs.
- Transfert des lymphocytes
- anesthésier les 8-12 semaines-vieilles souris bénéficiaires mâles C57BL/6J à l’isoflurane (1-3 %) à l’aide d’un vaporisateur ; confirmer la profondeur de l’anesthésie par orteil-pinch. Pommade vétérinaire à l’animal ' s yeux pour éviter le dessèchement.
- Brièvement les cellules de donneur vortex (1 s) et le transfert à la seringue d’injection de 1 mL avec 27 G, 0,5 à aiguille, combinant des populations de cellules marquées différemment, le cas échéant.
- Une petite portion (10 μL) de transfert de cellules mixtes pour une solution de fixation (1 mL) pour les analyses de cytométrie en flux ultérieurs.
- Placer les animaux donneurs en position couchée. Appliquez une pression caudale douce sur la peau dorsale à le œil, causant le globe oculaire pour dépassent légèrement.
- Directe de l’aiguille médialement et injecter 100 µL de la suspension de cellules de donneur rétro-orbitalement dans chaque souris destinataire. Les cellules peuvent également être injectés via la veine caudale.
- Progressivement retirer l’aiguille d’injection et placez la souris seule dans une cage de récupération. Surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il a repris connaissance ; retour une fois pleinement récupéré l’animal à un logement social.
- Collecte et l’analyse
- après 1 h, anesthésier destinataires souris avec anesthésie isoflurane (1-3 %) à l’aide d’un vaporisateur, confirmer la profondeur de l’anesthésie par orteil-pinch. Récolter de la rate (ou autres tissus d’intérêt) (étape 2.1.2.) de chaque destinataire souris et le déposer dans les médias complets (1 mL/destinataire). Euthanasier les animaux anesthésiés par décapitation.
Remarque : Des intervalles plus longs avant la récolte de tissus vont augmenter l’accumulation dans les tissus grâce au moins 24 h. - Moudre tissu rate doucement à travers la maille en nylon de 40 µm dans les médias complètes à l’aide de l’extrémité d’un piston de la seringue pour faire une suspension monocellulaire et transfert à tube conique de 15 mL.
- Ajouter 4 volumes de lyse ACK tampon et incuber 5 min à température ambiante. Centrifuger la suspension de cellules à 1 000 x g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant.
- Remettre les cellules en coloration buffer (tampon phosphate salin additionné de 1 % FBS). Compter les cellules et s’adapter à une concentration finale de 3 x 10 7 cellules/mL. Transférer 100 µL de suspension cellulaire dans un 96 puits autour de la plaque inférieure.
- Cellules de tache pour marqueurs souhaités (voir la Table des matières) pour l’analyse par cytométrie en flux. Ajouter les anticorps conjugués fluorophore (voir la Table des matières) contre marqueurs souhaités et incuber à 4 ° C pendant 20 min dans le noir. Ajouter 100 µL tampon de coloration, centrifuger des cellules à 1 000 x g pendant 3 min et éliminer le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 200 µL tampon de coloration, centrifuger des cellules à 1 000 x g pendant 3 min et éliminer le surnageant.
- Remettre le culot en coloration de 125 µL tampon et acquérir des échantillons à l’aide d’un cytomètre en flux à l’aide de procédures standards.
Remarque : Le colorant vert est excité par un laser à 488 nm et l’émission est détectée avec 505 et 530/30 filtres dichroïques. Le colorant orange est excité par un 561 nm et l’émission est détectée par un filtre dichroïque 582/15.- Utilisation sauvé cellules 2.1.8.2 pour compenser chaque colorant fluorescent.
Remarque : À l’aide de rémunération à base de perle avec des fluorophores correspondant à l’excitation et les spectres d’émission des colorants étiquetage se traduira par compensation sous-optimaux. - Utiliser les cellules d’entrée enregistrées depuis l’étape 2.2.2.1 pour déterminer avec précision le rapport entre marqués différemment des cellules d’entrée si vous utilisez plus d’une population marquée ( Figure 3). Calculer la migration spécifique de tissu selon le ratio d’étiquetés aux cellules sans étiquette ( Figure 4).
- Utilisation sauvé cellules 2.1.8.2 pour compenser chaque colorant fluorescent.
- après 1 h, anesthésier destinataires souris avec anesthésie isoflurane (1-3 %) à l’aide d’un vaporisateur, confirmer la profondeur de l’anesthésie par orteil-pinch. Récolter de la rate (ou autres tissus d’intérêt) (étape 2.1.2.) de chaque destinataire souris et le déposer dans les médias complets (1 mL/destinataire). Euthanasier les animaux anesthésiés par décapitation.
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Representative Results
Lors de l’utilisation de colorant de calcéine-AM, une inspection visuelle des cellules confirmera l’absorption étiquette (Figure 1). Lecture fluorescent automatique suivra migration comme transport de cellules sur le dessous de l’insert au fil du temps. Ces données montrent clairement une induction de la migration cellulaire vers MCP-1, ainsi qu’une augmentation de cette réponse par le sérum (Figure 2 a). Selon le stimulus migrateur sur la force, il y a un décalage d’au moins 15 min avant une augmentation du signal. Le signal fluorescent peut culminer et ensuite diminuer progressivement. Il s’agit d’une diminution nette du nombre de cellules adhérant à la face inférieure de l’insert comme cellules passent en solution dans la chambre inférieure à un taux plus rapide que celle des cellules en migration à partir de la chambre haute. Des stimuli migratoires plus forts entraînent généralement une) apparition précoce d’une hausse des valeurs de fluorescence ; b) plus rapide taux de croissance en fluorescence ; et c) des valeurs plus élevées de fluorescence des PIC. Images représentatives acquis par microscopie de fluorescence inversé sont également indiqués (Figure 2 b), avec la quantification du nombre de cellules (Figure 2).
Pour in vivo études utilisant plus d’une étiquette fluorescente, il est important de quantifier la proportion relative des populations de cellules dans le matériel d’entrée. Cela explique l’écart dans le mélange de populations de cellules pour injection (Figure 3). Dans ce cas, le ratio de cellules fluorescentes-vert et orange a été 0.97:1. Ainsi, pour expliquer ce léger déséquilibre, du nombre de cellules fluorescentes vertes a été divisé par 0,97 pour indexer leur nombre proportionnellement les matières entrantes. Après quantification des cellules marquées par cytométrie en flux, la traite peut être quantifiée le nombre de cellules marquées récupéré divisé par le nombre total de cellules récupérées.
Ces résultats démontrent l’avantage d’utiliser la stratégie bicolores, qui élimine l’effet de l’efficacité d’injection variable ; Bien qu’il y a un écart considérable de cellules récupérées entre animaux, pour un animal donné que le rapport entre les cellules vert fluorescent à orange fluorescente est environ égal (Figure 4). Ces résultats sont attendus, comme la cellule de deux populations ont été traitées identiquement, mais des perturbations diverses peuvent être testées pour leur effet sur la domiciliation des lymphocytes. Déviation de la ligne d’identité indiquerait différentes capacités migratoires des populations spécifiques de cellules. En outre, plusieurs sous-ensembles de cellules peuvent être déterminés par coloration des cellules récupérées pour les protéines désirées. Ici, T-cellules, indiqués par coloration au CD3 et B-, indiqué par une coloration CD19 sont également récupérées à l’aide des proportions égales de vert-orange fluorescent cellules.
Figure 1 : marquage cellulaire. Inspection visuelle du culot cellulaire après marquage confirme absorption adéquate du colorant fluorescent (à gauche), contrairement à avant étiquetage (droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Quantification of in vitro la Migration. (A) données représentatives (moyenne ± écart) acquises en temps réel à partir d’un lecteur en comparant les 3 conditions : médias (contrôle), chimiokines (MCP-1, 75 ng/mL) ou chemokine avec sérum (MCP-1, 75 ng/mL et bovine sérique, 2,7 % v/v dans buffer). Lectures ont été acquises par le dessous de la plaque toutes les 3 min avec une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et détection de longueur d’onde 520 nm. (B) les micrographies représentatif à 4 X grossissement du dessous de l’insert à 1 h, ce qui permet une visualisation directe de la migration des cellules. Barreaux de l’échelle = 500 µm (jaune). (C) Quantification du nombre de cellules par champ à faible puissance (LPF ; 4 X) à l’aide de logiciels ImageJ. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : coloration des cellules d’entrée. Diagrammes de cytométrie de flux montrant le rapport entre les deux différemment colorées des populations de cellules dans l’entrée de cellules injectées à l’étape 2.2.2.1. Le ratio déterminé à partir de ce terrain sert à corriger la variance a présenté pendant le mélange initial des deux populations et est utilisé pour ajuster le nombre de cellules lors de l’analyse de données en aval. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Ratio de cellules marquées récupéré des rates de receveuses de. Les proportions des cellules fluorescentes vert ou orange fluorescente sont présentent sous forme de pourcentage des totales splénocytes récupérées, chaque point de données représentant un animal seul destinataire. Le total marqué des cellules sont indiqué (triangle), ainsi que les sous-ensembles qui maculait également positifs pour les marqueurs de surface de cellules CD19 (carré) ou CD3 (cercle). Ligne en pointillé est la ligne d’identité où le rapport entre les couleurs est égal à 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Quantification de la migration des cellules immunitaires peut être accomplie à l’aide de simple et rapide des analyses in vitro et in vivo. Nous démontrons le chimiotactisme in vitro des monocytes humains en réponse à un gradient de MCP-1 et l’augmentation mammaire par le sérum. In vivo, donneur splenocytes murins ont été étiquetés de façon différente et après transfert adoptif, parasitent les animaux receveurs.
En utilisant un lecteur de plaque a l’avantage de l’échantillonnage de plusieurs points dans le temps (aussi souvent que toutes les 30 s) et de l’automatisation de la quantification de la migration des cellules. Ceci élimine la nécessité de choisir un moment unique pour l’évaluation et en évitant les plus fastidieuses méthodes de comptage manuel des puits individuels. En outre, cette méthode fournit des informations plus dynamiques que peuvent être collectées par microscopie. Pendant l’analyse, il faut rappeler que les cellules vont tomber l’insert dans le bas du réservoir et ne contribueront pas à l’intensité de la fluorescence. Ainsi, le nombre de cellules sur le dessous de l’insert, comme en témoigne la fluorescence relative, sera fonction du taux de la migration et le taux par lequel les cellules tombent de l’insert.
Cellules plus grandes peuvent nécessiter un insert avec des pores plus gros, et 8 μm poreux plaquettes sont disponibles. Petites cellules (y compris les lymphocytes natifs) n’est peut-être pas assez brillantes pour être possible de détecter par un fluorimètre et peuvent exiger l’évaluation au microscope, en particulier pour les petits changements dans le chimiotactisme. Certains types de cellules peuvent passer rapidement dans la solution de la chambre basse et pas un assez long temps de séjour sur l’insert pour être détectée, ayant pour résultat une courbe aplatie. Dans ce cas, les cellules peuvent être quantifiés par cytométrie de flux directement à partir de la solution de la chambre basse, ou un insert à matrice-enduit peut être utilisé pour allonger le temps de transit en plus d’utiliser un insert avec des pores plus petits (p. ex. 1 μm).
L’identification des conditions migrateurs robustes est cruciale pour ces tests. Pour des études in vitro , le type cellulaire étudié doit être capable de répondre à un facteur chimiotactique et cofacteurs nécessaires doivent être considérées. Optimisation peut être exigée pour la densité cellulaire introduite dans la chambre haute. En général, une densité plus élevée aura comme conséquence un signal plus puissant, mais cela doit être mis en balance avec un signal non spécifique migration plus élevé. Tester une gamme de concentrations de facteur chimiotactique peut également aider à identifier une fenêtre temporelle appropriée pour la capture de migration.
Cette méthode pourrait également être adaptée à utiliser plusieurs couleurs. En théorie, cela réduirait la variabilité, ainsi que la multiplication des conditions qui peuvent être inclus dans un seul essai. La considération primordiale ici est la luminosité des colorants fluorescents. Calcéine-AM est très lumineux et donc facilement détecté par des applications de lecteur de microscope et de plaque. Considérant que les colorants utilisés pour des études in vivo n’ont pas été détectés facilement par microscopie et produits ambiants ; sans doute, cela n’empêcherait également détection de lecteur de plaque précise.
Pour des études in vivo , la santé des cellules du donneur est importante de préserver leur fonction migrateur. La récolte des cellules du donneur doit être faite dans le cadre de la chirurgie sans survie, plutôt que de sacrifier l’animal donneur et puis récolte des cellules, ce qui augmente le risque d’ischémie et la mort cellulaire. Le temps entre l’injection et la récolte est une considération importante pour des expériences dans lesquelles les différentes populations cellulaires sont utilisées ; le niveau de divergence ou de la similitude entre populations cellulaires peut-être changer au fil du temps. Temps de traitement après la récolte du donneur jusqu'à ce que l’injection dans le destinataire devrait être réduite au minimum. En outre, compatibilité donneur/receveur est également essentielle. Les cellules humaines seront rapidement rejetées par souris, bien que les cellules allogéniques intra-espèces sont bien tolérées sur de courtes périodes. Par exemple, nous ne trouvons pas une différence dans la migration des cellules C57BL/6J ou BALB/cJ donateurs sont utilisées avec C57BL/6J bénéficiaires sur une période de 1 h.
Cette méthode in vivo est utile pour déterminer les différences dans la capacité migratoire. Les deux cellules d’entrée et receveuses peuvent être soumis à des perturbations pharmacologiques ou autres. De même, animaux receveurs peut être exposés à des stimuli infectieuses ou inflammatoires, ou d’autres traitements qui affectent les lymphocytes trafic12. Ce protocole peut également être facilement appliqué aux lignées de souris transgéniques. En particulier, ceux exprimant des protéines fluorescentes éviterait la nécessité pour l’étiquetage et pourraient potentialiser les stratégies de multiplexage.
Il est important de noter que le temps dans lequel les différentes populations cellulaires sont mélangées avant l’injection devrait être réduit autant que possible. Populations cellulaires différemment étiquetées doivent être mélangées uniquement après que les animaux receveurs ont été complètement anesthésiés et sont prêts pour l’injection. Peuvent se mélanger les colorants présents dans les différentes populations, entraînant peu claire séparation entre les deux, si on les analyse par cytométrie en flux. En outre, des conditions différentes de traitement peuvent affecter les cellules non traitées durant cette période. Par exemple, les agents qui se lient à la surface des cellules peuvent être transférés aux cellules non traitées, confondant ainsi les résultats.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Bernard L. Schwartz programme pour médecins chercheurs à l’Université Rockefeller, le Fonds de développement thérapeutique Robertson à la Rockefeller University et le centre de Sackler de biomédecine et de la recherche sur la Nutrition à la Université Rockefeller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
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