Summary
De zebravis is een populaire diermodel te bestuderen van de mechanismen van Retina degeneratie/regeneratie in gewervelden. Dit protocol beschrijft een methode om gelokaliseerde letsel verstoren het buitenste netvlies met minimale schade aan het innerlijke netvlies veroorzaken. Vervolgens controleren we in vivo de retinale morfologie en de reactie hierop van Müller, glia hele netvlies regeneratie.
Abstract
Een fascinerende verschil tussen teleost en zoogdieren is het levenslang potentieel van het teleost netvlies voor retinale neurogenese en regeneratie na ernstige schade. Onderzoeken van de regeneratie-trajecten in zebrafish zou brengen nieuwe inzichten te ontwikkelen innovatieve strategieën voor de behandeling van retinale degeneratieve ziekten bij zoogdieren. Hierin zijn we gericht op de inductie van een focal laesie aan het buitenste netvlies in volwassen zebrafish door middel van een 532 nm diodelaser. Een gelokaliseerde blessure kunt onderzoek naar biologische processen die tijdens de retina degeneratie en regeneratie rechtstreeks op het gebied van schade plaatsvinden. Met behulp van niet-invasieve optische coherentie tomografie (OCT), konden we de locatie van het beschadigde gebied en monitor volgende regeneratie definiëren in vivo. Inderdaad, OCT imaging produceert met hoge resolutie, transversale beelden van het netvlies van de zebravis, het verstrekken van informatie die eerder alleen beschikbaar met histologische analyses was. Om te bevestigen de gegevens uit real-time LGO, histologisch secties werden uitgevoerd en regeneratieve reactie na de inductie van de retinale schade werd onderzocht door immunohistochemie.
Introduction
Visie is waarschijnlijk de meest essentiële betekenis van de mens en zijn bijzondere waardevermindering heeft een hoge sociaal-economische gevolgen. In de geïndustrialiseerde wereld goed retinale degeneratieve ziekten voor de meerderheid van gezichtsverlies en blindheid onder de volwassen bevolking1. Retinitis pigmentosa (RP) is de meest voorkomende erfelijke oorzaak van blindheid bij mensen tussen de leeftijden van 20 en 60, die ongeveer 1,5 miljoen mensen wereldwijd2,3. Het is een heterogene familie van overgenomen retinale aandoeningen gekenmerkt door progressieve verlies van de researchdieren (PRs) gevolgd door degeneratie van het retinale pigment epitheel en, vervolgens, gliosis en remodeling van innerlijke neuronen4. Het verloop van de ziekte kan worden verklaard door de incrementele verlies van de twee PR celtypes, meestal beginnend met staven, die verantwoordelijk zijn voor Achromatische visie in het schemerige licht en kegels, die essentieel zijn voor kleur visie en gezichtsscherpte5. Een enkel gen-defect is voldoende om het veroorzaken van RP. Tot nu toe zijn meer dan 130 mutaties in meer dan 45 genen geassocieerd met de ziekte6. Dit leidt tot verschillende fenotypes van de ziekte en is een van de redenen dat gentherapie niet-gegeneraliseerd is en dus een ingewikkelde therapeutische aanpak. Daarom is er dringend behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe algemene therapeutische benaderingen voor de behandeling van retinale degenerations in verblindende ziekten.
Retina degeneratie vaak gaat om PR verlies; Dus, de dood van de cel van de PR is een kenmerk van de degeneratieve processen in de retina-7. Het is al gebleken dat de dood van de cel van de PR Müller glia cellen (MC) activering en proliferatie8 stimuleert. MCs, het grote gliale celtype in het netvlies van gewervelde, werden ooit beschouwd als niets meer dan een "lijm" tussen retinale neuronen. In de afgelopen jaren hebben veel studies aangetoond dat MCs fungeren als meer dan louter structurele steun9. Onder de verschillende functies, MCs ook deelnemen aan de neurogenese en repareren van10. Inderdaad, in antwoord op diffusible factoren van de degenererende netvlies, MCs aanzienlijk verhogen gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) expressie. GFAP etikettering kan dus worden gebruikt als een marker voor MC activering als een secundaire reactie op netvlies letsel en degeneratie11.
Onlangs, ontwikkelden we een nieuwe aanpassing van focal letsel met behulp van een laser voor het opwekken van Retina degeneratie in zebrafish (Danio rerio). Focal letsel is voordelig voor de studie van bepaalde biologische processen zoals de migratie van de cellen in de plaats van de gewonden en de precieze timing van gebeurtenissen die tijdens de retinale regeneratie12 plaatsvinden. Bovendien, de zebravis belangrijker geworden in het visuele onderzoek vanwege de overeenkomsten tussen het visuele systeem en dat van andere gewervelde dieren. Bruto morfologische en histologische kenmerken van menselijke en teleost retinae weer enkele verschillen. Dienovereenkomstig, mens en zebrafish retinae bevatten de dezelfde grote cel klassen georganiseerd in gelaagde hetzelfde patroon, waar licht-sensing researchdieren de buitenste laag, bezetten terwijl het netvlies projectie neuronen, de peesknoopcellen, bevinden zich in het binnenste veld neuronale laag, proximale aan de lens. Het netvlies interneuronen, amacrine, bipolaire, en horizontale cellen, localiseren tussen de fotoreceptor en de ganglion cel lagen13. Bovendien is het netvlies zebrafish kegel gedomineerde en dus dichter bij het menselijke netvlies dan, bijvoorbeeld, het intensief bestudeerde knaagdier netvlies. Een fascinerende verschil tussen teleost en zoogdieren is de aanhoudende neurogenese in vis netvlies en netvlies regeneratie na beschadiging. MCs kunnen zebrafish, dedifferentiate en bemiddelen van regeneratie in benadeelde netvlies14,15. In kip hebben MCs sommige capaciteit ook tot Re-Enter de celcyclus en dedifferentiate. Na retinale letsel in volwassen vis, MCs nemen bepaalde kenmerken van voorlopercellen en stamcellen, migreren naar het beschadigde retinale weefsel en produceren van nieuwe neuronen16. Onverwachte overeenkomsten met retinal progenitoren gen expressie profilering van zoogdieren MCs geopenbaard en bewijs voor intrinsieke neurogene potentieel voor MCs in kip, knaagdieren, en zelfs menselijke netvlies groeit17. Echter is waarom de regeneratieve reactie in vogels en zoogdieren is beduidend goedkoper in vergelijking met de robuuste reactie in vis nog niet begrepen. Daarom begrijpen de endogene herstelmechanismes in zebrafish kan stellen voor strategieën voor stimulerende retinale regeneratie bij zoogdieren en mensen. Met betrekking tot de regeling van de endogene reparatie voor MCs als een therapeutisch instrument voor de behandeling van patiënten met Retina degeneratie zou een uitstekende gevolgen voor onze maatschappij hebben.
Hierin bieden we de stappen die nodig zijn om het model van de degeneratie/regeneratie in ophthalmic onderzoek in dienst. We gericht eerst op inducerende focal schade in de hormoonfuncties retina, dan op de beeldvorming van gebeurtenissen op de site van de schade, en ten slotte visualiseren betrokkenheid van de aangrenzende MCs te ontwikkelen. Het algemene protocol is relatief gemakkelijk uit te voeren en een breed scala aan mogelijkheden voor de evaluatie van het netvlies daarna opent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle experimenten vastgehouden aan de instructie voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en onderzoek van de visie van de Association for Research in visie en oogheelkunde (ARVO) en de daarmee verband houdende verordeningen van de gouvernementele autoriteiten respecteren.
1. dieren
- TgBAC handhaven (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 (AB) spanning tussen 6-9 maanden onder standaardomstandigheden in water met een temperatuur van 26,5 ° C en een licht/donker cyclus 14/10 h 18.
- Volg de richtlijnen van de verzorging van de dieren van de betrokken instellingen voor de dierproeven na goedkeuring door de regeringsautoriteiten.
2. Omkeerbare systemische verdoving
- voorbereiden de stockoplossing ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate zout (tricaïne) door het oplossen van 400 mg tricaïne poeder in 97.9 mL tank water en 2,1 mL 1 M van Tris gebufferde zoutoplossing (TBS). Aanpassen op pH 7,0 met 1 M Tris (pH 9) en winkel bij 4 ° C in het donker tot één maand.
Opmerking: Tricaïne moet worden voorbereid op het water als de natuurlijke leefomstandigheden van het dier, bij voorkeur oorspronkelijke tank water dient. - De stamoplossing 1:25 in tank water verdunnen en direct gebruiken.
- Plaats van de zebravis in een 10 cm petrischaal met 50 mL verdoving oplossing totdat ze immobiel worden en niet op externe prikkels (ongeveer 2-5 minuten, afhankelijk van gewicht en leeftijd reageren).
- Overbrengen in elke vis met de hand een op maat gemaakte siliconen pin houder voor laserbehandeling ( figuur 1A).
LET OP! De vis kan blijven buiten de tank gedurende maximaal 10 minuten alleen narcose. - Als u wilt omkeren verdoving na de behandeling en/of imaging, plaats u de zebravis in container met tank water.
- Ter ondersteuning van herstel, maken een stroom van verse tank water over de kieuwen door het bewegen van de zebravis heen en weer in het water.
3. Laser Focal letsel op netvlies
Opmerking: A 532 nm diodelaser is gebruikt voor het maken van focal lichte schade op het netvlies van de zebravis. De experimentele opzet van de laser kan de oprichting van een reproduceerbare focal retinale blessure in volwassen zebrafish.
- Het vermogen van de laser instellen: 70 mW; luchtfoto diameter: 50 µm; impulstijd: 100 ms.
Let op! Het gebruik van laserlicht vereist passende persoonlijke bescherming en etikettering van het gebied. - 1-2 druppels 2% hydroxypropylmethylcellulose topisch in het oog vóór de behandeling van toepassing en een 2.0 mm lens van de laser van de fundus te richten van de straal van laser-gericht op het netvlies.
LET OP! Hydroxypropylmethylcellulose druppels visceus en kan problemen veroorzaken in de ademhaling als het gaat over de kieuwen. - Plaats vier laser plekken rond de oogzenuw aan de linkerkant van het oog en gebruik van de juiste, onbehandelde oog als interne controle.
4. In vivo Beeldvorming van de morfologie van de retinale
- op dag 0, visualiseren het netvlies zebrafish direct na de inductie van de laser zonder hen heropleving van anesthesie. Op alle andere tijdstippen, dienst algemene anesthesie (zie paragraaf 2: omkeerbare systemische verdoving). Plaats de geïmmobiliseerdet zebravis op een op maat gemaakte siliconen pin houder ( Figuur 1 B, B.1).
- Voor optimale beelden, Knip een verkrijgbare hydrogel contactlenzen aan het oog van de zebravis (Ø = 5.2 mm, r = 2.70 mm, dikte van het centrum = 0,4 mm) door middel van een perforator. Vul het concaaf oppervlak van de lens met methylcellulose en plaats deze over het hoornvlies.
- De OCT-systeem met een 78D contactloze gleuf lamp lens uitrusten.
- Concentreren het infrarood (IR)-beeld in de IR + OCT modus ( figuur 2A) visualiseren van de fundus van het oog en nemen de IR foto's door te klikken op de " verwerven " knop ( figuur 2B) te lokaliseren de Laser vlekken op het netvlies met behulp van het systeem ' s software.
- Visualiseren een driedimensionale gedeelte van het netvlies lagen in de IR + OCT modus en neem de foto's door te klikken op de " verwerven " knop ( figuur 2B). Observeren van de ernst van het letsel in de nucleaire buitenlaag (ONL) (zie paragraaf 3: Laser focal letsel op netvlies) in deze beelden.
- Om te keren van anesthesie, na de behandeling en/of imaging plaatst de zebravis in een container met tank water.
- Ter ondersteuning van herstel, maken een stroom van verse tank water over de kieuwen door het bewegen van de zebravis heen en weer in het water.
- Uitvoeren van soortgelijke in vivo imaging van retinale morfologie op dag 1, 3, 7, 14 en week 6.
5. De Haematoxyline & eosine (H & E) Staining
- euthanaseren zebrafish door onderdompeling in koud (4 ° C) verdoving oplossing in de ijskast voor minstens 10 min en enucleate de ogen onmiddellijk door middel van kleine gebogen verlostang.
- De hele ogen in 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C gedurende 20 uur vast te stellen en vervolgens het uitdrogen van de monsters in een gesorteerde alcohol-reeks (xyleen 100% voor 5 min tweemaal, ethanol 100% voor 5 min tweemaal, ethanol 96% gedurende 3 minuten tweemaal en ethanol 70% 3 mi n keer).
LET OP! PFA kunnen irriterend voor de ogen, neus en bovenste luchtwegen. PFA is een bekend menselijk carcinogeen en een verdachte reproductieve gevaar. - De monsters inbedden in paraffine, gesneden 5 µm secties op het niveau van de kop van de oogzenuw en bevestig ze op glas dia's.
- Vlek in de deparaffinized secties met 0,1% zuur Haematoxyline oplossing voor 5 min en dompel de dia's twee keer in gedistilleerd water na het dompelen van dia's in zoutzuur mix (2 mL 25% HCl in 250 mL gedestilleerd water) en ammoniak mix (2 mL 25% ammoniak in 250 mL gedestilleerd water). De secties met waterige oplossing van eosine G 0,5% gedurende 3 minuten na de ontwikkeling van de Haematoxyline door leidingwater voor ten minste 10 min. kleuring vlekken
- Mount gedehydrateerde dia's in acryl hars montage medium en observeren van de dia's onder de lichte Microscoop.
6. Immunohistochemistry voor de activering van de MC
- Heat van de deparaffinized secties in antigeen ophalen buffer (Tris-EDTA + 0,05% niet-ionogene wasmiddel, pH 9.0) gedurende 3 minuten in een passende stoomboot of een magnetron voor 10-15 minuten en spoel driemaal met TBS voor 5 minuten elk.
- Cirkel de secties met een siliconen pen en voeg 100 µL blokkeren oplossing (TBS + 10% geit normale serum + 1% bovien serumalbumine, pH 7,6) bij kamertemperatuur voor 1 h.
- Vlek met anti-gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) konijn polyclonal antilichaam en anti-glutamine synthetase (GS) muis monoklonaal antilichaam, zowel in een 1:200 verdunning (40 µL per monster). Incubeer de dia in een bevochtigde ruimte bij 4 ° C's nachts. Wassen drie keer met TBS + 0,1% Tween 20 voor 5 minuten elk.
- Afwerking visualisatie met de passende secundaire antilichamen. Dit protocol gebruikt een geit anti-konijn IgG H & L groene secundair antilichaam voor GFAP en een geit-antimuis IgG H & L knalrood voor GS, zowel in de verdunning van een 1:500 bij kamertemperatuur voor 1 h.
- Monteren van de dia's met montage medium dat DAPI en observeren van de dia's onder de fluorescentie Microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Real-time OCT: om het analyseren van de rol van MCs in netvlies reparatie, gebruikten we een laser letsel model inducerende een goed afgebakende zone van schade in de zebravis retina. De site van schade was beeld door middel van in vivo OCT voor de eerste keer (dag 0) binnen 60 minuten na het letsel (Figuur 3). Om te compenseren voor de optica van de fish eye, werd een op maat gemaakte contactlens gelegd op het hoornvlies. Onmiddellijk na de laserbehandeling, was een diffuse hyper-reflectieve signaal gelokaliseerd aan het buitenste netvlies (pijlen). Zij uitgebreid van de retinale pigment epitheel (RPE) tot de Meervormige buitenlaag (OPL). Een soortgelijke signaal was ook waarneembaar op dag 1. Na dag 3 werd dit diffuse signaal meer georganiseerde en dichte. Consequent werd gezien in de nucleaire buitenlaag (ONL) uit te breiden in de fotoreceptor laag. Na de eerste week (dag 7), was er een significante afname van de gemiddelde laesie grootte en slechts een kleine hyper-reflectieve signaal werd ontdekt. Vanaf dag 14 totdat het laatste tijdstip onderzocht (Week 6), waren de laser-plekken niet langer zichtbaar in IR en LGO beelden.
Histologische beoordeling van de retina degeneratie/regeneratie: om te onderzoeken van de omvang en de kinetiek van Retina degeneratie/regeneratie, H & E kleuring was werkzaam bij verschillende tijdstippen na schade inductie (dag 0, 1, 3, 7, 14 en Week 6) (Figuur 4). Experimenten werden uitgevoerd op drie ogen van drie vis. Echter werd geen statistische analyse uitgevoerd, aangezien het doel van dit manuscript is om aan te tonen van de methode. Subtiele veranderingen in de nucleaire binnenlaag (l) en ONL kan worden gezien onmiddellijk na laser (bijvoorbeeld lichte oedeem in de ONL) en verlaagde intercellulaire ruimte in de l binnen 60 minuten na de laserbehandeling. De degeneratie werd gevolgd voor 6 weken na de inductie van laser letsel. Morfologische veranderingen werden consequent waargenomen na 1 dag met desorganisatie van de PRS-dienst en de formatie van een holte in de ONL en in de subretinal ruimte. Inderdaad, was er een verlies van kernen binnen de ONL in het gebied van de schade tussen 1 en 7 dagen. Het maximale verlies van PR werd gevonden op dag 3. Vanaf 14 dagen tot 6 weken, had het buitenste netvlies hersteld zijn normale morfologie.
Gliale betrokkenheid tijdens Retina degeneratie/regeneratie: te beoordelen MC activering op verschillende tijdstippen (dag 0, 3, 14) na de inductie van Retina degeneratie, we immunohistochemische analyses uitgevoerd voor de cel gliale markers GS en GFAP (Figuur 5). Experimenten werden opnieuw uitgevoerd op drie ogen van drie vis zonder kwantitatieve analyse. GS speelt een belangrijke rol bij het beheersen van het niveau van extracellulaire glutamaat en wordt beschouwd als uitsluitend worden uitgedrukt in MC soma en haar processen19,20. GFAP is upregulated tijdens het ouder worden en wanneer het netvlies is beschadigd of benadrukt. Het is gelokaliseerd in de MC einde-voeten en21verwerkt. Zwakke GFAP expressie werd ook gevonden in het binnenste gedeelte van het netvlies van de ongedeerd-control etikettering van andere soorten gliale cellen, bijvoorbeeld astrocyten. De autofluorescence van de buitenste segmenten van PR verstrekt ook een signaal in de ONL maar dit kan duidelijk worden onderscheiden. Het algemeen kaderakkoord voor vrede signaal was upregulated op dag 3 na letsel. Daarmee analyses uitgevoerd op dag 3 na de laserbehandeling GFAP-positieve MCs toonde alleen binnen de site van de schade in de ONL van het netvlies. Dag 14, de regeneratie was grotendeels voltooid en het algemeen kaderakkoord voor vrede signaal was werden naar basisniveau in het gebied van schade. In tegenstelling tot GFAP was er geen aanzienlijke verandering in het niveau van de GS-expressie. Echter, misschien zijn er een gelokaliseerde Downregulatie van GS op de site van de schade.
Figuur 1: opstelling voor de inductie van de schade van de laser van zebravis netvlies en na analyse van de OCT. (A) regeling van het lasersysteem vóór de behandeling. (A.1) Zebrafish geplaatst op siliconen pin houder met fundus contact lens in plaats net vóór toepassing van de laserstraal. (B) regeling van de OCT systeem voor imaging. (B.1) Zebrafish voorgelegd 78D gleuf lamp lens voor de detectie van de sites van de schade door middel van oktober Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: opstelling voor de IR en LGO afbeeldingen ophalen. (A) Screenshot van de software venster tijdens imaging. IR en LGO modi zijn afgebeeld. (B) overzicht van het deelvenster gebruikt voor het verwerven van de beelden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: IR (links) en OCT (rechts) beelden van de gewonden en ongedeerd sites van retina in hetzelfde oog op ander moment punten (dagen 0, 1, 3, 7, 14 en Week 6) na laser-geïnduceerde Retina degeneratie. In de IR-beelden, een groene vak geeft het gedeelte van het netvlies dat heeft worden geanalyseerd en de groene lijn toont de locatie van de OCT beelden op het netvlies. Pijlen geven aan sites van de laser plekjes ontdekt als hyper-reflectieve signalen in de bar van de OCT. schaal = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: H & E kleuring van de gewonden en de contralaterale ongedeerd zebrafish oog op ander moment punten (dagen 0, 1, 3, 7, 14 en Week 6) na laser-geïnduceerde Retina degeneratie. GC, ganglion cellaag; L, nucleaire binnenlaag; ONL, nucleaire buitenlaag. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: immunohistochemische detectie van MC activering. GFAP (groen) en GS (rood) vlekken in het netvlies van gewonden en ongedeerd zebravis op ander moment punten (dagen 0, 3, 14) na laser-geïnduceerde Retina degeneratie. Het groene signaal in de ONL is te wijten aan de autofluorescence van de PR-outer segmenten. Celkernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Netvlies regeneratie/degeneratie in de zebravis is onderzocht door verschillende benaderingen zoals cytotoxin-gemedieerde cel dood22, mechanische schade23en thermische schade24. We een 532 nm diodelaser om schade aan het netvlies zebrafish in dienst. Daarmee is ons model biedt diverse voordelen. Bijvoorbeeld, we snel gemaakt een welomschreven gebied van verwonding gelokaliseerd in de buitenste retina, specifiek in de PRs-laag. Bovendien, deze experimentele opstelling kan worden aangepast voor het produceren van grotere gebieden van schade aan het bestuderen van andere biologische processen, bijvoorbeeld door beschadiging Bruch van membraan voor het opwekken van choroidal neovascularization. Er is minimale collaterale schade en de timing van de regeneratieve reactie kan worden gedifferentieerd precies en reproducibly.
Volg de phenotypical wijzigingen na verloop van tijd en werkzaam we de Heidelberg Spectralis-systeem en de Heidelberg Eye Explorer-software. Dus, fundus IR imaging bleek te zijn met name handig in zebrafish. In tegenstelling tot de fundus autofluorescence (AF), die laag contrast tussen de stip van de laser en de omgeving toont, zijn de beschadigde sites gemakkelijker te lokaliseren door IR imaging. Daardoor kunnen we om wijzigingen te herkennen en te controleren regeneratie in vivo, die zou niet mogelijk zijn met de AF-modus. Als eerder gemeld25, kan OCT worden gebruikt om te controleren van degeneratieve/regeneratieve processen in zebrafish netvlies. In ons model, werd retinale laser letsel ontdekt als een hyper-reflectieve band in de ONL (Figuur 3), die is vergelijkbaar met wat werd gemeld in zoogdieren26. Tijdens regeneratie daalde de hyper-reflectieve signaal totdat het volledig op dag 14 verdwenen.
De OCT beelden werden gecorreleerd met morfologische veranderingen gezien binnen de laser laesies (Figuur 4). Het diffuus hyper-reflectieve signaal in OCT beelden (dag 0) vertegenwoordigt de na laser veranderingen gezien in de l van zebravis euthanized binnen 1 uur na de laserbehandeling. De subtiele en goed afgebakende hyper-reflectieve signaal gedetecteerd op dag 3 komt overeen met de vorming van de holte in de ONL als gevolg van het verlies van de staaf. Vanaf dag 14, beide OCT en histologische analyses bevestigen dat het buitenste netvlies zijn normale morfologie had hersteld.
In de huidige studie, hebben we ook de reactie van de MC geëvalueerd tijdens retinale regeneratie (Figuur 5). Vele groepen hebben al onderzocht voor de activering van gliale cellen, met name voor MCs, als een eerste regeneratieve reactie op schade. Meer in het bijzonder, stelden zij dat pathofysiologische MC activering MCs te nemen van de kenmerken van de cel van de stam, bieden een endogene bron van nieuwe functionerende celtypes die kunnen worden geïntegreerd in beschadigde gebieden van de retina27kan veroorzaken. Zoals verwacht, vonden we dat retinale laser letsel MC activering gestimuleerd, zoals aangegeven door de opregulatie van het algemeen kaderakkoord voor vrede. Inderdaad, verhoogde GFAP expressie was opmerkelijk gedetecteerd op 3 dagen na letsel en was beperkt tot het gebied van de schade. Vanaf dag 14, de regeneratie was grotendeels voltooid en het signaal van het algemeen kaderakkoord voor vrede werden naar het basisniveau in het gebied van de schade. Zo hebben we aangetoond dat MCs een actieve rol in het netvlies reorganisatie, en potentieel regeneratie spelen, na letsel.
Kortom, de laser-geïnduceerde Retina degeneratie/regeneratie-model is een veelzijdig instrument voor de productie van snelle en focale schade aan het netvlies zebravis en de volgende regeneratie kan worden gevisualiseerd door niet-invasieve OCT imaging. Bovendien konden we om te laten zien dat laser-Retina degeneratie gaat vergezeld van de activering van de MC en dat de daaruit voortvloeiende gliosis op regeneratie wordt omgekeerd. Een gedetailleerd onderzoek van de betrokken celtypes (bijvoorbeeld microglia, macrofagen) en trajecten moet echter worden uitgevoerd. Kritische wijzigingen nodig zijn, met name scheepsverkeer voor de MCs om beter te begrijpen hoe ze zich gedragen tijdens het regeneratief proces (bijvoorbeeld migratie uit hun oorspronkelijke locatie in de l in het buitenste netvlies, vooral in de PRs-laag) en hun differentiatie naar PR cellen. Anderzijds kunnen lichte schade paradigma's worden gebruikt voor het opwekken van wijdverspreide en consistente verlies van zowel de staaf en de kegel PRs28. Het voordeel van de beschreven model is echter een meer bepaald letsel gebied waar een lokale interacties tussen degenererende researchdieren en geactiveerde MCs kunt studeren.
In het algemeen zijn wij van mening dat het model helpen zal om degeneratieve/regeneratieve processen in de sensorische retina beter te begrijpen en kan de vergelijking van deze ontwikkelingen met de zoogdieren systeem. Het kan ook worden gebruikt om de invloed van het aangeboren immuunsysteem en effecten van neuroactive stoffen te studeren. In de toekomst zou men kunnen deze resultaten gebruiken om de degenererende menselijke visuele systeem te wijzigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Martin Zinkernagel, MD, PhD en Miriam Reisenhofer, PhD voor haar wetenschappelijke bijdrage tot stand te brengen van het model en Federica Bisignani voor haar uitstekende technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
