Summary
Sebrafisk er en populær dyr modell å studere mekanismer for retinal degenerasjon/gjenfødelse virveldyr. Denne protokollen beskriver en metode for å indusere lokaliserte skade forstyrre ytre netthinnen med minimal skade indre netthinnen. Senere, overvåker vi i vivo retinal morfologi og Müller glia respons gjennom netthinnens gjenfødelse.
Abstract
Fascinerende forskjell teleoster og pattedyr er livslang potensialet av teleost netthinnen for retinal neurogenesis og etter alvorlig skade. Undersøker gjenfødelse stier i sebrafisk kunne bringe ny innsikt å utvikle innovative strategier for behandling av netthinnens degenerative sykdommer i pattedyr. Her, fokuserte vi på induksjon av en fokal leksjonen på ytre netthinnen i voksen sebrafisk ved hjelp av en 532 nm diode laser. En lokalisert skade kan undersøke biologiske prosesser som finner sted under retinal degenerasjon og regeneration direkte på området skade. Bruker ikke-invasiv optical coherence tomografi (OCT), kunne vi definerer plasseringen av skadet område og skjerm påfølgende gjenfødelse i vivo. Faktisk produserer OCT bildebehandling med høy oppløsning, tverrsnittsstudie bilder av sebrafisk netthinnen, som gir informasjon som var tidligere bare tilgjengelig med histologiske analyser. For å bekrefte dataene fra sanntid OCT, histologiske delene ble utført og regenererende svar etter induksjon av netthinnen skaden ble undersøkt av immunhistokjemi.
Introduction
Visjonen er trolig den viktigste følelsen av mennesket og dens verdifall har samfunnsøkonomiske inntrykk. I den industrialiserte verden utgjør netthinnens degenerative sykdommer flertallet av synstap og blindhet blant voksne1. Retinitis pigmentosa (RP) er den vanligste arvet årsaken til blindhet i folk mellom 20 og 60, påvirker ca 1,5 millioner mennesker verden over2,3. Det er en heterogen arvet retinal lidelser preget av progressiv tap av fotoreseptorer (PRs) etterfulgt av degenerasjon av netthinnens pigment epitel og, senere, gliosis og ombygging av indre neurons4. I løpet av sykdommen kan forklares av inkrementell tap av de to PR celletyper, vanligvis igangsetting med stenger, som er ansvarlig for akromatisk visjon i svakt lys og kjegler, som er essensielle for farge visjon og synsskarphet5. Ett gen feil er tilstrekkelig til å forårsake RP. Hittil er mer enn 130 mutasjoner i over 45 gener forbundet med sykdom6. Dette fører til varierende sykdom fenotyper er en grunn til at genterapi er ikke-generalizable og dermed intrikate terapeutisk tilnærming. Derfor er det et presserende behov for å utvikle nye generelle terapeutiske metoder å behandle netthinnens degenerations i blendende sykdommer.
Retinal degenerasjon ofte innebærer PR tap; Derfor er PR celledød et kjennetegn på utarte prosesser i netthinnen7. Det har allerede vist at PR celledød stimulerer Müller glia celle (MC) aktivisering og spredning8. MCs, hvilken stor glial celle i virveldyr netthinnen, en gang ble ansett å være noe mer enn en "limet" mellom retinal neurons. De siste årene, har mange studier vist at MCs handle mer enn bare strukturell støtte9. Blant de forskjellige funksjonene, MCs deltar også i neurogenesis og reparere10. Faktisk svar diffusible faktorer fra degenereres netthinnen økning MCs betydelig glial fibrillary Sure protein (GFAP) uttrykk. Derfor kan GFAP merking brukes som en markør for MC aktivisering som sekundær svar på netthinnen skader og degenerasjon11.
Nylig har utviklet vi en roman tilpasning av fokal skade bruker en laser til å indusere retinal degenerasjon i sebrafisk (Danio rerio). Fokal skade er fordelaktig for å studere bestemte biologiske prosesser som overføringen av celler på skadde området og nøyaktige tidspunktet for hendelser som finner sted under retinal gjenfødelse12. Videre har sebrafisk som den blitt viktige visuelle forskning på grunn av likheter mellom det visuelle systemet og andre virveldyr. Brutto morfologiske og histologiske funksjoner av menneskelige og teleost retinae viser noen forskjeller. Følgelig, menneskelige og sebrafisk retinae inneholder samme store celle klassene organisert i samme lagdelte mønster, der lyset-sensing fotoreseptorer okkupere det ytterste laget, mens retinal projeksjon neurons, ganglieceller, bor i innerste neuronal lag, proksimale linsen. Netthinnen interneurons, amacrine, bipolar, og vannrett celler, lokalisere mellom photoreceptor og ganglion celle lag13. Videre er sebrafisk netthinnen membran-dominert og derfor nærmere human netthinnen enn, for eksempel intensivt studerte gnager netthinnen. Fascinerende forskjell teleoster og pattedyr er den vedvarende neurogenesis fisk netthinnen og retinal regenerasjon etter skade. I sebrafisk, MCs dedifferentiate og megle gjenfødelse skadet netthinnen14,15. Kylling har MCs noen kapasitet også å skrive inn i cellen syklus og dedifferentiate. Etter retinal skade i voksen fisk, MCs vedta visse egenskaper stamfar og stamceller, overføre til skadede netthinnen vev og produsere nye nerveceller16. Gene expression profilering av pattedyr MCs avslørt uventede likheter retinal progenitors, og bevis for innebygde neurogenic potensialet i MCs i kylling, gnagere og aften human netthinnen vokser17. Likevel er regenerativ svaret fugler og pattedyr er lavere sammenlignet med robust svaret i fisk ennå ikke forstått. Forstå endogene reparasjon mekanismer i sebrafisk kan derfor foreslår strategier for stimulerende retinal gjenfødelse pattedyr og mennesker. Ansette endogene reparasjon mekanismen for MCs som et terapeutisk redskap for behandling av pasienter med retinal degenerasjon ville ha enestående betydning for samfunnet vårt.
Her gir vi de nødvendige trinnene nødvendig å ansette degenerasjon/gjenfødelse modellen i ophthalmica forskning. Vi fokuserte først på inducing fokal skade i neurosensory netthinnen, deretter på avbilding av hendelser utvikling i skaden nettstedet og endelig visualisere involvering av tilstøtende MCs. Generelle protokollen er relativt enkelt å utføre og åpner en rekke muligheter for å vurdere netthinnen etterpå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle eksperimentene overholdt erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og visjon Research Association visjon og Oftalmologi (ARVO) og respekterer relaterte forskrift av statlige myndighetene.
1. dyr
- opprettholde TgBAC (gfap:gfap-GFP) sebrafisk 167 (AB) belastning alderen 6-9 måneder under standard betingelser i vann med en temperatur på 26.5 ° C og en 14/10 h lys/mørke syklus 18.
- Følger retningslinjene for dyr omsorg til de involverte dyreforsøkene etter godkjenning av statlige myndigheter.
2. Reversibel systemisk anestesi
- forberede lagerløsning ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) ved å løse opp 400 mg av tricaine pulver i 97,9 mL tank vann og 2.1 mL 1 M av Tris bufret saltvann (SS). Justere pH 7.0 med 1 M Tris (pH 9) og butikk på 4 ° C i den mørke opptil en måned.
Merk: Tricaine bør være forberedt i vann som dyret naturlig levekår, fortrinnsvis opprinnelige tank vann bør brukes. - Fortynne lager løsning 1:25 i tank vann og bruke umiddelbart.
- Plasserer sebrafisk i en 10 cm Petriskål inneholder 50 mL av anestesi løsning inntil de blir immobile og svarer ikke på eksterne stimuli (ca 2-5 minutter, avhengig av vekt og alder).
- Overfører hver fisk for hånd til en skreddersydd silikon pin holder for laserbehandling ( figur 1A).
FORSIKTIG! Fisken kan være bedøvet utenfor tanken på opptil 10 min bare. - For å reversere anestesi etter behandling og/eller bildebehandling, plasser sebrafisk i beholderen som inneholder tank vann.
- For å støtte gjenoppretting, Opprett en strøm av frisk tank vann over gjellene ved å flytte sebrafisk frem og tilbake i vannet.
3. Laser fokus skade på netthinnen
Merk: en 532 nm diode laser brukes til å opprette fokal skade på netthinnen av sebrafisk. Den eksperimentelle set-up av laser gjør etableringen av en reproduserbar fokal retinal skade i voksen sebrafisk.
- Satt opp utgangseffekten på laser: 70 mW; antenne diameter: 50 µm; puls varighet: 100 ms.
Advarsel! Bruk av laserlys krever riktig personlig verneutstyr og merking av området. - 1-2 dråper 2% hydroxypropylmethylcellulose lokalt i øyet før behandling og bruk en 2.0 mm fundus laser linse til å fokusere strålen laser-satsing på netthinnen.
FORSIKTIG! hydroxypropylmethylcellulose dråper er tyktflytende og kan forårsake problemer puste hvis det går på gjellene. - Sted fire laser flekker rundt den optiske nerven til venstre øye og bruke rett, ubehandlet øyet som intern kontroll.
4. I vivo Imaging av Retinal morfologi
- dagen 0, se sebrafisk netthinnen rett etter laser induksjon uten gjenopplive dem bedøvelsen. På alle andre tidspunkt, ansette narkose (se avsnitt 2: reversibel systemisk anestesi). Plasser den immobilisert sebrafisk på en skreddersydd silikon pin ( figur 1 B, B.1).
- å få optimale bilder, kuttet en kommersielt tilgjengelig hydrogel kontaktlinse å passe sebrafisk øyet (Ø = 5,2 mm, r = 2,70 mm, center tykkelse = 0.4 mm) med et hull. Fyll den konkave overflaten av linsen med methylcellulose og plassere den over hornhinnen.
- Utstyre OCT systemet med en 78D ikke-kontakt slit lampe linse.
- Fokus IR infrarød (IR) bildet + OCT modus ( figur 2A) til å visualisere fundus i øyet og ta IR bilder ved å klikke på " Hent " knappen ( figur 2B) å lokalisere den laser flekker på netthinnen bruker systemet ' s programvare.
- Visualiser en tredimensjonal del av netthinnens lagene i IR + OCT modus og ta bilder ved å klikke på " Hent " knappen ( figur 2B). Observere alvorlighetsgraden av skader i ytre kjernefysiske laget (bare) (se avsnitt 3: Laser fokus skade på netthinnen) i disse bildene.
- å reversere anestesi etter behandling og/eller bildebehandling sted sebrafisk i en beholder som inneholder tank vann.
- For å støtte gjenoppretting, Opprett en strøm av frisk tank vann over gjellene ved å flytte sebrafisk frem og tilbake i vannet.
- Utføre lignende i vivo avbilding av netthinnen morfologi på dag 1, 3, 7, 14 og uke 6.
5. Hematoxylin & Eosin (H & E) Beising
- Euthanize sebrafisk ved neddykking i kalde (4 ° C) anestesi løsning på is for minst 10 min og enucleate øynene umiddelbart ved hjelp av små buet tang.
- Fikse hele øynene på 4% paraformaldehyde (PFA) i fosfat bufret saltvann (PBS) i 4 ° C på 20 h og deretter tørke prøvene i en gradert alkohol serie (xylen 100% i 5 minutter to ganger, etanol 100% i 5 minutter to ganger, etanol 96% for 3 min to ganger og etanol 70% 3 mi n gang).
FORSIKTIG! PFA kan være irriterende for øyne, nese og øvre luftveier spor. PFA er en kjent kreftfremkallende og en mistenkt reproduktive fare. - Bygge prøvene i parafin, kuttet 5 µm deler på nivået av synsnerven hodet og montere dem på glass lysbilder.
- Flekk deparaffinized avsnittene med 0,1% syre hematoxylin løsning 5 min og dyppe lysbildene to ganger i destillert vann etter lysbildene i saltsyre blanding (2 mL 25% HCl i 250 mL destillert vann) og ammoniakk blande (2 mL 25% ammoniakk i 250 mL destillert vann). Stain delene med eosin G vannoppløsning 0,5% i 3 minutter etter utviklingen av hematoxylin farging av vann i minst 10 min.
- Montere dehydrert lysbildene i akryl harpiks montering medium og observere lysbildene under lys mikroskopet.
6. Immunohistochemistry for MC aktivering
- varme delene deparaffinized i antigen henting buffer (Tris-EDTA + 0,05% ikke-ioniske vaskemiddel, pH 9.0) for 3 min i en passende dampbåten eller mikrobølgeovn i 10-15 min og vask tre ganger med ss 5 min hver.
- Sirkel delene med en silikon penn og legge 100 µL blokkerer løsning (SS + 10% geit normal serum + 1% bovin serum albumin, pH 7.6) ved romtemperatur for 1 h.
- Flekk med anti-glial fibrillary Sure protein (GFAP) kanin polyklonale antistoffer og anti-glutamin synthetase (GS) musen monoklonalt antistoff, både i en 1:200 fortynning (40 µL per prøve). Inkuber lysbildet i en fuktet kammer på 4 ° C over natten. Vask tre ganger med ss + 0,1% mellom 20 for 5 min.
- Finish visualisering med riktig sekundære antistoffer. Denne protokollen brukes geit anti-kanin IgG H & L grønn sekundær antistoff for GFAP og geit anti-mus IgG H & L rød for GS, både i en 1:500 fortynning ved romtemperatur for 1 h.
- Montere lysbildene med montering medium som inneholder DAPI og observere lysbildene under mikroskopet fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sanntid OCT: for å analysere MCs rolle i netthinnen reparasjon, vi brukte en laser skade modell indusere en godt kodedel sone skader i sebrafisk netthinnen. Stedet for skade ble avbildet med i vivo OCT for første gang (dag 0) innen 60 minutter etter skade (Figur 3). For å kompensere for optikk fisken-øye, ble en skreddersydd kontaktlinse plassert på hornhinnen. Umiddelbart etter laserbehandling, ble en diffus hyper-reflekterende signal lokalisert på ytre netthinnen (piler). Det utvidet fra netthinnen pigmentert epitel (RPE) til det ytterste plexiform laget (OPL). Et lignende signal var også synlig på dag 1. Etter dag 3 ble diffus signalet mer organisert og tett. Det var konsekvent sett i det ytterste kjernefysiske laget (bare) strekker seg inn i det photoreceptor laget. Etter den første uken (dag 7), var det en betydelig reduksjon i gjennomsnittlig lesjon størrelse og bare en liten hyper-reflekterende signal ble oppdaget. Fra dag 14 til siste tidspunktet undersøkt (uke 6), var laser flekker ikke lenger synlig i IR og OCT bilder.
Histologiske vurdering av Retinal degenerasjon/fornyelse: for å undersøke omfanget og kinetics av retinal degenerasjon/gjenfødelse, H & E flekker ble ansatt på forskjellige tidspunkt etter skade induksjon (dag 0, 1, 3, 7, 14 og uke 6) (Figur 4). Eksperimenter ble utført på tre øynene til tre fisk. Imidlertid var ingen statistisk analyse utført som målet av denne oppgaven er å vise metoden. Subtile endringer i det indre kjernefysiske laget (INL) og bare kan bli sett umiddelbart etter laser (f.eks liten ødem i bare) og redusert intercellulære plass i INL innen 60 minutter etter laserbehandling. Degenerering fulgte 6 uker etter induksjon av laser skade. Morfologiske endringer var konsekvent observert etter 1 dag med disorganization av PRs og en hulrom formasjon i bare og i feltet subretinal. Det var faktisk tap av kjerner innenfor bare i skade området mellom dager 1 og 7. Maksimal PR tapet ble funnet på dag 3. Fra 14 dager til 6 uker, hadde ytre netthinnen gjenreist dets normale morfologi.
Glial engasjement under Retinal degenerasjon/gjenfødelse: Å vurdere MC aktivering på ulike tidspunkt (dag 0, 3, 14) etter induksjon av retinal degenerasjon, vi utført immunohistochemical analyser for glial celle indikatorene GS og GFAP (figur 5). Eksperimenter ble igjen utført på tre øynene til tre fisk uten kvantitativ analyse. GS spiller en viktig rolle i å kontrollere nivået av ekstracellulære glutamat og anses å være utelukkende uttrykt i MC soma og sine prosesser19,20. GFAP er upregulated under aldring og når netthinnen er skadet eller understreket. Det er lokalisert i MC slutten-føttene og behandler21. Svak GFAP uttrykket ble også funnet i den indre delen av uskadet-kontroll netthinnen merking andre glial celletyper, f.eks astrocyttene. Autofluorescence av PR ytre segmentene også gitt et signal i bare, men dette kan være klart adskilte. GFAP signalet var upregulated på dag 3 etter skade. Dermed analyser utført på dag 3 etter laserbehandling viste GFAP-positive MCs bare i skaden nettstedet i bare av netthinnen. Fra dag 14, gjenfødelse var stort sett komplett og GFAP signalet var downregulated til grunnlinjen nivå i skade området. I motsetning til GFAP var det ingen betydelig endring i nivået av GS uttrykk. Men kan det ha vært en lokaliserte downregulation av GS på stedet av skaden.
Figur 1: oppsett for induksjon av laseren skaden sebrafisk netthinnen og følge OCT analyse. (A) arrangement av Lasersystemet før behandling. (A.1) sebrafisk plassert på silikon pin holder med fundus linse i stedet bare før laserstrålen. (B) arrangement av OCT før bildebehandling. (B.1) sebrafisk plassert foran 78D slit lampe linsen før oppdagelsen av webområdene skade ved hjelp av oktober Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: oppsett for å anskaffe de IR og OCT bildene. (A) skjermbilde av vinduet programvare under bildebehandling. IR-og OCT er avbildet. (B) oversikt over panelet til bildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: IR (venstre) og OCT (høyre) bilder av skadde og uskadet nettstedene til netthinnen i samme øye på ulike tidspunkt poeng (dager 0, 1, 3, 7, 14 og uke 6) etter laser-indusert retinal degenerasjon. I IR bilder, en grønne boksen viser delen av netthinnen som har bli analysert og den grønne linjen viser plasseringen av OCT bildene på netthinnen. Pilene angir områder av laser flekker oppdaget som hyper-reflekterende signaler i baren oktober skala = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: H & E farging av den skadde og kontralateral uskadet sebrafisk øye på ulike tidspunkt poeng (dager 0, 1, 3, 7, 14 og uke 6) etter laser-indusert retinal degenerasjon. GC, ganglion celle laget. INL, indre kjernefysiske laget. BARE, ytre kjernefysiske lag. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Immunohistochemical påvisning av MC aktivisering. GFAP (grønn) og GS (rød) flekker i skadet og uskadet sebrafisk netthinnen på ulike tidspunkt poeng (dager 0, 3, 14) etter laser-indusert retinal degenerasjon. Grønne signalet i bare skyldes autofluorescence av PR oPC segmenter. Cellen kjerner er farget med DAPI (blå). Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retinal gjenfødelse/degenerasjon i sebrafisk har blitt undersøkt av ulike tilnærminger som cytotoxin-mediert celle død22, mekanisk skade23og termisk skade24. Vi ansatt en 532 nm diode laser skade sebrafisk netthinnen. Dermed tilbyr vår modell flere fordeler. For eksempel, opprettet vi raskt et veldefinert område av skade lokalisert i ytre netthinnen, spesielt i PRs laget. Videre kan denne eksperimentelle set-up endres for å produsere større områder skade å studere andre biologiske prosesser, for eksempel ved å skade Bruchs membran å indusere choroidal neovascularization. Det er minimal sivile skader og tidspunktet for regenerativ svaret kan være modulert nøyaktig og reproduserbar.
For å følge phenotypical endringene over tid, ansatt vi Heidelberg Spectralis systemet og Heidelberg øye Explorer-programvaren. Dermed ble fundus IR imaging funnet for å være spesielt nyttig i sebrafisk. I motsetning til fundus autofluorescence (AF), som viser lav kontrast mellom laser spot og omegn, er de skadede områdene lettere å lokalisere av IR tenkelig. Dette tillater oss å oppdage endringer og overvåke gjenfødelse i vivo, som ikke ville være mulig med AF modus. Som tidligere rapportert25, kan OCT brukes til å overvåke degenerative/regenerativ prosesser i sebrafisk netthinnen. I vår modell, ble netthinnen laser skade oppdaget som en hyper-reflekterende band i bare (Figur 3), som er lik hva har rapportert pattedyr26. Under regenerasjon, hyper-reflekterende signalet redusert til det helt forsvant på dag 14.
OCT bildene var korrelert med morfologiske endringer sett i laser lesjoner (Figur 4). Diffus hyper-reflekterende signalet i OCT bilder (dag 0) representerer endres etter laser sett i INL av sebrafisk euthanized innen 1 time etter laserbehandling. Subtile og godt kodedel hyper-reflekterende signalet oppdaget på dag 3 tilsvarer hulrom dannelsen i bare på grunn av rod tap. Fra dag 14, begge OCT og histologiske analyser bekrefte at ytre netthinnen hadde gjenreist dets normale morfologi.
Studien vurdert vi også MC svaret under retinal regenerasjon (figur 5). Mange grupper har allerede undersøkt aktivering av gliacellene, spesielt av MCs, som et innledende regenerativ Svar å skade. Mer spesifikt, foreslo de at patofysiologiske MC aktivisering kan indusere MCs å vedta stamcelleforskningen egenskaper, en endogen kilde nye fungerende celletyper som kan integreres i skadede områder på netthinnen27. Som forventet, fant vi at retinal laser skade stimulert MC aktivisering som indikert av oppregulering av GFAP. Faktisk økt GFAP uttrykk var bemerkelsesverdig oppdaget på 3 dager etter skade, og var begrenset til skade området. Fra dag 14, gjenfødelse var stort sett komplett og GFAP signalet var downregulated til grunnlinjen nivå i skade området. Dermed har vi vist at MCs spiller en aktiv rolle i netthinnen omorganisering, og potensielt gjenfødelse, etter skade.
Avslutningsvis laser-indusert retinal degenerasjon/gjenfødelse modellen er et allsidig verktøy for å gi rask og fokal skade sebrafisk netthinnen og følgende fornyelse kan visualiseres av ikke-invasiv OCT tenkelig. I tillegg var vi kunne vise at laser-retinal degenerasjon er ledsaget av MC aktivisering og at det påfølgende gliosis tilbakeføres ved gjenfødelse. Men må en detaljert undersøkelse av involvert celletyper (f.eks microglia, makrofager) og veier utføres. Viktige endringer kan være nødvendig, spesielt live sporing av MCs for bedre å forstå hvordan de oppfører seg under regenerativ prosessen (f.eks migrasjon fra den opprinnelige plasseringen i INL i ytre netthinnen, spesielt i PRs laget) og deres differensiering mot PR celler. Alternativt kan skade paradigmer brukes å indusere utbredt og konsekvent tap av både stang og kjegle PRs28. Men er fordelen av beskrevet modellen et mer definert skade område der en kan studere lokale interaksjoner mellom degenereres fotoreseptorer og aktivert MCs.
Generelt, tror vi at modellen vil bidra til å bedre forstå degenerative/regenerativ prosesser i Sensorisk netthinnen og kan aktivere sammenligning av denne utviklingen med pattedyr systemet. Det kan også brukes til å studere påvirkning av det medfødte immunsystemet og effekter av neuroactive stoffer. I fremtiden, kan man bruke disse resultatene til å endre degenereres menneskelige visuelle systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Martin Zinkernagel, MD, PhD og Miriam Reisenhofer, PhD for henne vitenskapelige inn på etablering modell og Federica Bisignani for hennes utmerket kundestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
