Summary
Det här protokollet beskriver en allmän strategi för att regenerera kommersiella klädd guld mikroelektroder utrustade för en etikett-fri cell analyzer syftar till att spara på de höga löpande kostnader ofmicrochip-baserade analyserna. Regenereringsprocessen inkluderar trypsin matsmältningen, sköljning med etanol och vatten, och en snurrande steg, vilket gör att upprepad användning av mikrochips.
Abstract
Etikett-fri cell-baserad analysen är fördelaktiga för biokemiska studien på grund av det inte kräver användning av försöksdjur. På grund av dess förmåga att ge mer dynamisk information om celler under fysiologiska betingelser än klassiskt biokemiska analyser, denna etikett-gratis realtid cell analys bygger på elektrisk impedans principen är att locka mer uppmärksamhet under senaste årtiondet. Dess praktiska användning kan dock begränsas på grund av den relativt dyra kostnaden för mätning, där kostsamma förbrukningsbart disponibla guld mikrochips används för cellen analysatorn. I detta protokoll, har vi utvecklat en allmän strategi för att regenerera klädd guld mikroelektroder utrustade för en kommersiell etikett-fri cell analyzer. Regenereringsprocessen inkluderar trypsin matsmältningen, sköljning med etanol och vatten, och en snurrande steg. Den föreslagna metoden har testats och visat sig vara effektivt för regenerering och upprepad användning av kommersiella elektroniska plattor minst tre gånger, vilket hjälper forskare Spara på hög löpande kostnaden för realtid cell analyser.
Introduction
På grund av dess effektiva och mindre arbetsintensiva experimentell process, har etikett-fri cell-baserad teknik upplevt snabb tillväxt under det senaste årtiondet för analytisk samt screening ändamål såsom i aspekten av proteomik1,2 , drog leverans3, etc.4,5 jämfört med traditionella biokemiska metoder syftar till att cellen analys, etikett-gratis realtid cell assay med prototypen utvecklats av Giaever och medarbetare tidigare6 är baserad på principen om inspelning av elektrisk signalförändringar på ytan av cell-anslutna mikrochips, som möjliggör en kontinuerlig mätning av celltillväxt eller migration på ett kvantitativt sätt. Efter denna strategi, en realtid cell elektronisk avkänning (RT-CES) system med elektrisk impedans-baserad detektion principen var introducerade7,8 och mer nyligen en kommersiell realtid cell analyzer (RTCA) lanserades för laboratorium forskning9.
Den kommersiella realtid cell analyzer läser främst cellernas evoked signaler om elektrisk impedans, vilket resultera från de fysiologiska förändringarna av ruvade celler inklusive cellproliferation, migration, livskraft, morfologi och följsamhet på den ytan av mikrochips10,11. Sådana elektriska signaler omvandlas vidare i Analyzer till en dimensionslös parameter som heter Cell Index (CI) att bedöma cell status. Ändringen av impedansen av mikrochips speglar främst Joniska närmiljön täckta celler på gränssnittet elektrod/lösning. Därför är den analytiska prestandan av cell analyzer starkt beroende av enheten core fjärranalys, den disponibla mikrochips (dvs, så kallade elektroniska plattor, t.ex., 96/16/8-brunn), som består av klädd guld mikroelektroder lithographically skrivs ut längst ned på inkubation brunnar. De guld mikroelektroder montera i en cirkel-on-line-format (figur 1) och täcker större delen av ytan av inkubering brunnar, som möjliggör dynamisk och känslig detektion av kopplade celler3,12,13 ,14. CI kommer att öka när det gäller mer yttäckning av celler på chip, och minskar när celler utsätts för en för människor som leder till apoptos. Även i realtid cell analyzer har ofta använts för att fastställa cytotoxicitet11 och neurotoxicitet15 och ger mer kinetic information än klassiskt slutpunkter metod, är de elektroniska engångstallrikar den mest kostsamma förbrukningsmaterial.
Det har hittills inga tillgängliga metoder för regenerering av elektroniska plattan, vilket förmodligen beror på att hårda regenerering villkor, såsom piranha lösning eller ättiksyra är inblandade16,17, 18, som kan förändra elektriska status av guld mikrochips. En mild och effektiv metod att ta bort de vidhäftande cellerna och andra ämnen från ytan av gold chips kommer därför önskvärt för elektronisk platta regenereringsprocessen. Vi har nyligen utvecklat ett protokoll som syftar till förnyelse av elektroniska engångstallrikar med icke-korrosiva reagens och regenererad marker präglades av elektrokemiska samt optiska metoder19. Med hjälp av lättillgängliga och måttlig laboratoriereagenser inklusive trypsin och etanol, har vi etablerat en allmän metod för att återskapa den kommersiella elektroniska plattan utan biverkningar, som har tillämpats korrekt för att regenerera de två huvudtyperna av elektronisk platta (både 16 och L8) används för RTCA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: I allmänhet regenereringsprocessen innehåller trypsin matsmältningen och skölja steg med etanol och vatten. Koktiden ändras beroende på antalet celler som används och den typ och antal celler som används kan variera beroende på de experimentella syften. Det är klokt att kontrollera den regenererade mikrochips med optiska och elektrokemiska metoder för att optimera de regenerering villkor. Under experimentet, lösliga och olösliga kemikalier kan vara inblandade, och här dessa två typfall av regenerering förfaranden är detaljerade.
1. beredning av regenerering lösningar
Obs: Förbereda och hantera alla lösningar under sterila förhållanden.
- Bered färskt 0,25% (g/v) trypsin. Trypsin kan köpas eller nyberedd enligt följande.
- Lös 0,25 g trypsin i 100 mL pH 7,4 fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Rör om lösningen tills trypsin är helt upplöst på 4 oC. rör lösningen vid låg hastighet för att undvika någon bubbla bildandet.
- Filtrera lösningen med 0,22 µm filter i biosäkerhet huven.
- Förbereda 75% etanol använder absolut etanol. Häll 75 mL absolut etanol i en mätkolv och Tillsätt avjoniserat vatten tills volymen nått 100 mL. Utföra ytterligare sterilisering vid behov.
2. inkubation och spridningen av A549 celler i elektroniska skyltar
Obs: Elektronisk platta typer 16 och L8 är båda gjorda av klädd guld mikroelektroder lithographically tryckt på botten av inkubering brunnar. Elektronisk skylt 16 har 16 brunnar medan elektroniska plattan L8 har 8 brunnar. Brunnarna av elektronisk platta 16 är runda medan brunnarna av elektronisk platta L8 är rundade rektanglar. Volymen av varje elektronisk platta 8 är väl ca 830 µL och varje elektronisk platta 16 är väl ungefär 270 µL.
- A549 cellkultur
- Kultur A549 celler i Roswell Park Memorial Institute-1640 medium (RPMI-1640) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% Penicillin-streptomycin i cellkulturen maträtt.
- Passagen cellerna när cell densiteten når ~ 75% och sedan tvätta det vidhäftande celllagrar med 1 × PBS och trypsinize med 0,25% trypsin lösning för 1 min på 37 oC. centrifug cellerna vid 179 × g i 5 min att ta bort trypsin. Att resuspendera cellerna i 10 mL medium för ytterligare kultur eller andra experiment.
Obs: Lösningen av celler resuspended i mediet betecknas här som cellen suspension bufferten. - Ta ut 10 µL och räkna antalet cell med en hemocytometer. Använd RPMI-1640 mediet att ytterligare späda cell suspension bufferten för att förbereda 30 000-80 000 celler/mL cell suspension buffert för experiment.
-
Spridning/cytotoxicitet experiment och datainskaffning
- Tillsätt 50 µL (150 µL för elektroniska tallrik L8) cell medium till varje inkubation väl av den elektroniska plattan 16 och lämna det i 30 min i biosäkerhet huva för Jämviktstiden. Manuellt in den elektroniska plattan 16 i realtid cell analysatorn i CO2 inkubatorn på 37 oC.
- Starta programmet realtid cell analyzer drift på datorn. På dess standard experimentera sida med mönster, Välj ”Experiment modell” och namnge kör analysen.
- Dess Layout på sidan Välj motsvarande brunnarna som ingår i experimentet och mata in informationen som cellen typ, nummer och drog namnen i rutorna. På dess schema till experimentella stegen och sedan välja den rinnande tiden (t.ex. 12, 24 eller 48 timmar) av varje steg och intervall av realtidsdata förvärv.
Obs: Här, intervallet för steg 1 och 2 är 1 min och 15 min efteråt. - Spara filen och klicka på ”Start” knappen för att mäta den bakgrund impedansen av media på sin Cell indexsidan; resulterande data dras automatiskt. På dess väl Graf sidan, kan alla väl kurvor besökas. På dess tomt sidan, lägga till brunnar och grafen av tid-cell index kommer att vara visade.
- För cell spridning experimentet, först klicka på ”paus” knappen för att pausa programmet. Ta sedan ut elektroniska plattan och tillsätt 100 µL A549 cell suspension buffert per brunn vid rumstemperatur. Låt plattan för 30 min i biosäkerhet huven att låta cellerna bosätta sig till botten av inkubering brunnar.
- Manuellt infoga elektronisk plattan i realtid cell analyzer station. Klicka på knappen ”Start” för att fortsätta experimentet.
Obs: På sidan tomt analysatorn kontinuerligt poster Cell indexvärden eller kurvor i hela experimentet. - När experimentet är klar, ange tomt sidan och öppna filen experiment. Välj sedan alla de testa inkubation brunnarna och de resulterande cellen Index kurvor som kan i genomsnitt eller normaliserade för sista gången innan lägga till läkemedel eller ändra medium för att minska variationer mellan analyser. På sidan dataanalys kan EC50 eller IC50 beräknas
3. förnyelse av elektroniska skyltar
Obs: För varje skölja steg lösningen i elektroniska plattan var blandas grundligt (5 - 10 gånger) med pipett.
-
Fall 1: för cytotoxicitet utvärdering av anti -läkemedel mot cancer
- Frö A549 celler på elektroniska plattan som beskrivs i avsnitt 2.
- Lös den anti-cancer läkemedel doxorubicinhydroklorid (DOX) i cell medium först. Tillsätt långsamt DOX till cellerna (slutlig koncentration av DOX är 30 µg/mL) med pipett. Spela in CI som beskrivs i avsnitt 2.
Obs: Elektroniska plattan används var regenereras omedelbart efter experimentet var komplett. I detta fall, eftersom DOX är en löslig kemisk, förnyelse av elektroniska plattan efter protokollet är relativt lätt att hantera och behövs ingen ytterligare steg. -
Förnyelse
- Ta ut elektroniska plattan som innehåller celler från realtid cell analyzer stationen. Placera använt elektroniska plattan i en steril biosäkerhet huva i rumstemperatur och blanda odlingssubstratet noggrant med hjälp av en pipett. Pipettera ut alla medium.
- Skölj de elektroniska plattorna med 200 µL avjoniserat vatten för 3 gånger vid rumstemperatur.
- Smälta de resterande cellerna på elektroniska plattorna med 0,25% nylagade trypsin för 1-2 h (200 µL per brunn) i en inkubator på 37 oC. När matsmältningen är klar, blanda inkubation lösningen 5 - 10 gånger med hjälp av en pipett och pipett ut all lösning i biosäkerhet huven vid rumstemperatur.
- Skölj de elektroniska plattorna med 200 µL etanol och 200 µL vatten, respektive, enligt följande: avjoniserat vatten 2 gånger, 100% etanol 2 gånger; 75% etanol 2 gånger; avjoniserat vatten 2 gånger. Vänd på elektroniska plattan på en steril kompress eller silkespapper att Dekantera det återstående vattnet vid rumstemperatur.
- Ultraviolett sterilisera regenererad elektroniska plattan för 1-2 h i biosäkerhet huven vid rumstemperatur.
Obs: Dubbla volymen av alla lösningar för regenerering av elektroniska plattan L8.
-
Fall 2: drogen leverans med hjälp av mesoporous material.
- Använda rod-liknande mesoporous kiseldioxid material med en genomsnittlig porstorlek på 5,6 nm som drogen leverans matriser, som tidigare rapporterats20.
Obs: Här, elektroniska plattan var anställd att övervaka läkemedelsfrisättning effekten på celler.- Tillsätt mesoporous material i inkubation lösningen i varje brunn av elektroniska skyltar. Som kiseldioxid material inte är lösliga och fällning i den elektroniska plattan, skölj plattan enligt följande:
- Utför steg 3.1.3.1-3.1.3.3 som beskrivs för fall 1.
- Skölj mikrochips med 200 µL avjoniserat vatten en gång i biosäkerhet huven vid rumstemperatur.
- Skölj mikrochips med 200 µL absolut etanol 2 gånger vid rumstemperatur.
- Skölj mikrochips med 200 µL 75% etanol en gång vid rumstemperatur.
- Tillsätt 250 µL av 75% etanol i varje brunn och försegla elektroniska plattan med tätning filmen vid rumstemperatur.
- Snurra på 114 x g i 2 min och Töm elektroniska plattan. Vänd på elektroniska plattan på en steril kompress eller silkespapper att Dekantera det återstående vattnet vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 3.2.5-3.2.7 en gång.
- Ultraviolett sterilisera regenererad elektroniska plattan för 1-2 h i biosäkerhet huven vid rumstemperatur.
Obs: Dubbla volymen av alla lösning när sköljning L8 elektroniska skyltar.
- Använda rod-liknande mesoporous kiseldioxid material med en genomsnittlig porstorlek på 5,6 nm som drogen leverans matriser, som tidigare rapporterats20.
4. bedömning av regenerering effekt
-
Optiska kännetecknen av regenererad elektroniska plattans yta
- Använd en stål sked för att försiktigt demontera nedre delen av inkubering väl av färska och regenereras elektronisk platta som innehåller klädd guld mikroelektroder. Iklädd en plast handske, torka försiktigt ut mikrochip-innehållande del från elektroniska plattan med stål sked.
- Placera båda delarna i mitten av glas objektglas och samla de resulterande Raman spectrana av Raman Mikroskop utrustat med en CCD detektor21.
Obs: Spektrometern var utrustad med en 633 nm laser och spektra spelades in med ett intervall på 30 s laser exponering vid en våglängd i intervallet 500-3500 cm-1. De optiska bilderna erhölls av Raman Mikroskop med en 10 x eye lins och 50 x-objektiv. Figur 1A och figur 1 c erhölls också använt installerade Raman Mikroskop apparatur. - För att utvärdera lönsamheten för bifogade celler efter anti-cancer läkemedel upptag på färska och regenererad laser elektroniska tallrikar, Använd en confocal scanning mikroskopet för att övervaka den spontana fluorescensen av DOX molekyler absorberas av A549.
- För att spela in spontana fluorescensen av absorberad DOX genom att celler (färsk och regenererad elektroniska plattor med A549 celler), använda olja en 63 X objektiva och 485 nm som magnetisering våglängden.
-
Elektrokemiska beteenden av regenererad elektroder
Obs: Manuell förställning kommersiella elektroniska platta är svårt och inte idealiskt för bedömningen av ytans elektriska status som kontrolleras, regenerering effektiviteten av protokollet utvärderades med hjälp av normala guld/glasartade kol elektroden (GCE) som ett test plattform, som elektroimpedansspektroskopi (EIS) utfördes. Diametrarna av både Au elektroden och GCE är 3 mm. elektrokemiska data erhölls genom en elektrokemisk analysator med ett tre-elektrod system och impedans mätningarna genomfördes med hjälp av en växelström (AC) signal 10 mV amplitud vid en brett frekvensomfång på 100 kHz till 0,01 Hz.- Innan mätningen, polska av Au elektrod och GCE till en spegelblank yta med en aluminiumoxid flytgödsel på en putsduk, följt av ultraljudsbehandling i vatten för att avlägsna partiklar.
- Aktivera Au elektroden i 0,5 M H2så4. Hämta EIS data av den kala Au elektrod och GCE i 10 mM KCl elektrolytlösning innehållande 1mM K3[Fe(CN)6] som beskrivs22.
- Förbered A549 cell stamlösning enligt 2.1.2 och 2.1.3. Släpp 10 µL cellsuspension på ytan av Au elektrod och GCE. Inkubera Au elektrod och GCE modifierad med celler i en 37 oC inkubator för 3 h. få EIS data av Au elektroden och GCE modifierad med celler i 10 mM KCl elektrolytlösning innehållande 1 mM K3[Fe(CN)6].
-
Regenerera elektroderna med hjälp av protokoll och åtgärd EIS.
- Fördjupa den Au-elektroden och GCE modifierad med celler i 0,25% trypsin för 0,5-2 h. Skölj Au elektrod och GCE mjukt med vatten 4 gånger. Skölj elektroderna mjukt med absolut etanol 4 gånger. Immerge Au elektrod och GCE i 75% etanol för ~ 5 min. Skölj marker mjukt med 75% etanol 4 gånger.
- Hämta EIS data av regenererad Au elektrod och GCE 10 mM KCl elektrolyt lösning innehållande 1mM K3[Fe(CN)6].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ytans egenskaper av guld mikrochips: de förnyelse-förfaranden som används i detta protokoll har beskrivits i figur 1. Figur 2 visar den mikroskopiska yta bilder av färska och regenereras elektroniska plattor av det optiska mikroskopet. Som visas i figur 2A och 2 c figur, mikroskopiska observationer visade att det var praktiskt taget ingen skillnad i de optiska egenskaperna av mikrochip ytan mellan färska och behandlade elektroniska skyltar. Använder den spontana fluorescensen av doxorubicin molekyler ingår in i cellerna som är bekvämt för bedömning av cell status, observerade vi en liknande homogenitet odlade celler på den guldiga mikrochips efter regenerering (figur 2B och figur 2D ). Dessutom visas ruvade cancercellerna en väldefinierad cellulära morfologi i elektroniska plattan visar reusabilityen av marker. Figur 3 visar Raman spectra av färska och regenererad elektroniska skyltar. Nästan identiska Raman peak fördelningarna mellan färska och behandlade elektroniska plattorna anges en framgångsrik regenereringsprocessen av guld mikrochip ytan. Raman signalerar av elektroniska plåtar täckta med A549 celler snedvrids till viss del, förmodligen på grund av inblandning från den spontana fluorescensen av A549 celler.
Regenereras mikrochips för cytotoxicitet analysen använder RTCA: Vi har också tillämpat regenerering protokollet för ett test av cell spridning och material cytotoxicitet utvärdering (figur 4). A549 celler av optimal täthet var seedad på regenererad elektroniska plattan 16 och kinetiska tillväxtkurvor spelades av realtid cell analyzer. Som visas i figur 4A, alla de resulterande tillväxtkurvorna av parallella experimentella brunnar visade tillräcklig enhetlighet, som indikerade att ytans elektriska status för elektronisk platta 16 behålls kraftigt efter regenerering. Regenererad elektroniska plattan L8 testades också för cytotoxicitet med mesoporous kiseldioxid material, vilket visas i figur 4B. Jämfört med kontroll experimentet, CI mesoporous material-behandlade prover minskade i viss utsträckning indikerar en liten cytotoxicitet av material. Ytterligare inkapsling och frisättning av anti-cancer läkemedlet av Dox av mesoporous material orsakat en dramatisk minskning av tillväxtkurvan av A549. Dessa experimentella resultat visade konsekvens med färska elektroniska plattor och med tidigare rapporterade arbetet19, som undersökt effektiviteten av detta föreslagna regenerering protokoll.
Förnyelse effektivitet utvärderas av elektrokemiska metoder: Kommersiella Au elektroder och glasartade Kolelektroder användes som test plattform för utvärdering av regenerering effektivitet. Figur 5 visar EIS av Au elektroder och GCE som har ändrats med cancerceller. Det visades att efter inkubation av A549 celler på elektroden, observerades en uppenbar ökning av elektron överföring motstånd (Ret) jämfört med kala elektroder. Ret minskade betydligt efter de Au elektrod och GCE behandlades enligt protokollet i figur 5. Liknande förändringar av Ret av både Au elektrod och GCE anges en effektiv och universella regenereringsprocessen av mikrochips angående deras ytans elektriska egenskaper.
Figur 1: regenereringen av elektroniska skyltar. I en typisk regenerering kör, var fyra huvudsteg inblandade inklusive ruva celler liksom deras lösgörande på ytan av elektroniska skyltar följt av sköljning, spinning, och ultraviolett sterilisering steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ytegenskaper av elektroniska skyltar. (A) nya elektroniska plattor (B) A549 celler var klädd på A. (C) regenererat elektroniska plattor (D) A549 celler var klädd på C. När det gäller celler fäst på guld mikrochips, användes DOX. Figur 2A och figur 2 c har ändrats från Xu, Z. o.a. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Raman spectra av olika behandlade elektroniska plattor. (A) ny elektronisk platta. (B) nya elektroniska plattan seedade med A549 celler. (C) regenereras elektroniska plattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: A549 cell tillväxtkurvor på tre-tiden regenererad elektroniska tallrikar. (A) parallella tillväxtkurvor celler seedade på elektronisk platta 16. (B) cytotoxicitet test av mesoporous kiseldioxid material på elektroniska tallrik L8 med felstaplar (standardavvikelse, STD) inspelade kurvor för varje inkubation väl. Figur 4A har ändrats från Xu, Z. o.a. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Elektrokemisk impedans spektra av olika modifierade guld elektroder och glasartade Kolelektroder (GCE) i 10 mM KCl elektrolytlösning innehållande 1 mM K3[Fe(CN)6]. (A) olika behandlade Au elektroder. (B) olika behandlade GCE. Figur 5A har varit modifierade fromXu, Z. o.a. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Chip ansökan | Regenerering buffert | Förnyelse strategi |
| Ytan plasmon resonans (SPR) | Piranha lösning (koncentrerad H2så4/30% H2O2 = 3:1, v/v)17 | remsa både analyten och sonden baserat på stark oxidation |
| Piezoelektriska Microcantilever sensorer (PEMS) | Glycin-HCl blandning23,24 | separera mål-probe komplexet och ta bort analyten |
| Kickkoncentrationer salt lösning (2M MgCl2 + 1,5 M Tris)25 | ||
| Guld film | 50mM KOH + 25% H2O226 | Oxiderade organics |
Tabell 1: En kort sammanfattning av rapporterade regenerering strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi sammanfattat flera tillgängliga metoder17,23,24,25,26 för regenerering mikrochips i tabell 1. I grund och botten, dessa metoder inblandade relativt hårda experimentella förhållanden att uppnå fullständig regenerering av chips på grund av förekomsten av starka molekyl-molekyl interaktioner såsom immun anläggningen används för SPR marker. Dessa experimentella förhållanden kan dock ytterst skadliga för ytegenskaper av klädd guld mikrochips används i RTCA. En mild och effektiv metod var därför de stora övervägandena i utvecklingen av strategin presenteras regenerering. Andra faktorer som är lika viktiga är miljöhänsyn, eftersom dessa disponibla mikrochips används ofta tillsammans med riktade cancerceller.
I detta protokoll introducerar vi en allmän metod för regenererande kommersiella klädd guld mikrochips används för RTCA. Våra protokoll har utvecklats baserat på trypsin-matsmältningen och sköljning med etanol och vatten. Extra spinning åtgärder anses vara effektiva för att avlägsna de olösliga partiklar som används för analysen för regenereringen. Jämfört med de reagens som används i tidigare rapporterade metoder, de regenererande reagenser trypsin och etanol är lätt tillgängliga för dagligen laboratoriebruk och dessa biologiska produkter/kemikalier med låg toxicitet, och anses därmed vara miljövänlig, vilket är önskvärt för regenerering.
I detta protokoll är det kritiska steget trypsin matsmältningen att säkerställa att regenerering av guld mikrochips. Optimering av trypsinization, inklusive koncentration och tid, bör den första prioriteringen att uppnå regeneration. Förutom koktiden som är rationaliseras i vårt föregående rapport19, är en bra bedömning för optimeringsprocessen helt enkelt att kontrollera ytegenskaper med ett optiskt mikroskop.
Ett annat bekymmer är hanteringen av mikrochips under regenererande processen. Som en pipett används ofta i experiment, bör uppmärksammas av personal att undvika repor spetsen på ytan av mikrochips. Dessutom är det fördelaktigt att pre sterilisera de tips, gasväv och sked att garantera förnyelse effektivitet. Sist men inte minst, regenereringsprocessen bör utföras i en biosäkerhet huva att undvika.
Det bör noteras att skölja processer i protokollet regenerering utförs manuellt, vilket oundvikligen kommer att orsaka bias på grund av olika personal. För att övervinna denna begränsning, kan automatisk eller halvautomatisk utrustning för sköljning ändamål vara anpassade utformade, med tanke på de modulära elektroniska plåtar används. Dessutom har protokollet förnyelse testats för att vara effektiv för cellbaserade analyser. Men i närvaro av starka molekylära interaktioner, såsom antikropp-antigen bildning på gränssnittet av chips, de föreslagna regenerering villkor kan begränsas till en stor grad och relativt stark buffert villkor bör övervägas.
Övergripande, det nuvarande förnyelse-protokollet har testats för att tillåta den upprepa användningen av kommersiella guld mikrochips, samt andra ledande elektroder såsom Au och glasartade Kolelektroder. Vi förväntar oss att tillämpningen av detta protokoll kommer att spara på de höga löpande kostnaderna för realtid chip-baserade cell analyser. I det långa loppet, mikrochip-baserade analyser blir oftare används för proteomiska och cellulära analyser och föreslagna protokollet i denna studie kan erbjuda ett alternativ för förnyelse, i vilken automatisk eller halvautomatisk utrustning för sköljning kan vara designade och tillämpas i fall av ackumulerade disponibla marker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av National Natural Science Foundation Kina (U1703118), ett projekt finansierat av prioriterade akademiska Program utveckling av Jiangsu högre utbildning institutioner (PAPD), Jiangsu Shuangchuang Program, öppna medel av nyckeln staten Laboratoriet för cellgifter/Biosensing och kemometri (2016015) och det nationella laboratoriet för biomakromolekyler (2017kf05) och Jiangsu Specially-Appointed Professor projektet, Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
References
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
