Summary
Bu iletişim kuralı ticari dizilmiş altın microelectrodes ofmicrochip tabanlı yüksek çalışan maliyeti deneyleri tasarruf amaçlı bir hücre etiket ücretsiz analyzer için donatılmış yeniden oluşturmak için genel bir strateji açıklar. Rejenerasyon işlemi tripsin sindirim, etanol ve su ve mikroçip tekrarlanan kullanımı sağlar bir iplik adım ile durulama içerir.
Abstract
Çünkü biyokimyasal çalışma deneysel hayvan kullanımını gerektirmez için etiket içermeyen hücre tabanlı tahlil avantajlıdır. Klasik biyokimyasal deneyleri daha hücreleri fizyolojik koşullar altında hakkında daha dinamik bilgi sağlamak yeteneği nedeniyle, elektrik empedans ilkesine dayanarak bu etiket ücretsiz gerçek zamanlı hücre tahlil geçmişte sırasında daha fazla ilgi topluyor on yıl. Ancak, onun pratik kullanımı nispeten pahalı maliyet pahalı sarf tek kullanımlık altın mikroçip hücre analyzer için kullanılan ölçü nedeniyle sınırlı olabilir. Bu protokol için bir ticari etiket içermeyen hücre analyzer için donatılmış dizilmiş altın microelectrodes yeniden oluşturmak için genel bir strateji geliştirdik. Rejenerasyon işlemi tripsin sindirim, etanol ve su ve bir iplik adım ile durulama içerir. Önerilen yöntem test edilmiş ve en az üç kez, yenilenme ve ticari elektronik plakaların tekrarlanan kullanımı için etkili olduğu gösterilmiştir hangi gerçek zamanlı hücre deneyleri yüksek çalışan maliyeti üzerinde Kaydet araştırmacılar yardımcı olacaktır.
Introduction
Sayesinde onun verimli ve daha az emek yoğun deneysel işlem, etiket içermeyen hücre tabanlı teknoloji proteomik1,2 açıdan gibi analitik hem de eleme amaçlı son on yılda hızlı büyüme tanıklık etmiş , ilaç teslim3, vb4,5 ile karşılaştırıldığında geleneksel biyokimyasal yöntemlerle hücre analizi, etiket ücretsiz gerçek zamanlı hücre tahlil Giaever ve arkadaşları tarafından daha önce geliştirilen prototip6 ile yönelik elektrik sinyal değişiklikleri nicel bir şekilde sürekli ölçümü hücre büyümesini veya geçiş izni hücre bağlı mikroçip yüzeyinde kayıt prensibi temel alır. Bu stratejiyi, gerçek zamanlı hücre tanıttı7,8 ve son zamanlarda bir ticari gerçek zamanlı hücre analyzer (RTCA) (RT-CES) sistem elektrik empedans tabanlı algılama ilkesini kullanarak oldu algılama elektronik başlatıldı Laboratuvar araştırma9için.
Ticari gerçek zamanlı hücre analyzer ağırlıklı olarak hangi inkübe hücre hücre çoğalması, geçiş, canlılığı, morfoloji ve bağlılık dahil fizyolojik değişiklikler sonucu hücre uyarılmış sinyalleri, elektrik empedans, okur. yüzey mikroçip10,11. Böyle elektrik sinyalleri daha fazla hücre dizin (hücre durumu değerlendirmek için CI) adlı bir boyutsuz parametre Çözümleyicisi tarafından dönüştürülür. Empedans mikroçip değişikliği esas olarak kapalı hücre elektrot/çözüm arabirimi, yerel iyonik ortam yansıtır. Bu nedenle, hücre analyzer analitik performansını dayanır ağır çekirdek algılama birimi üzerinde dizilmiş altın microelectrodes kılan tek kullanımlık kristallerden mikroçipler (Yani, sözde elektronik plakaları, örneğin, 96/16/8-iyi), lithographically kuluçka kuyu dibinde basılmış. Altın microelectrodes daire-on-line biçiminde (şekil 1) birleştirin ve ekli hücreleri3,12,13 dinamik ve hassas tespiti için izin kuluçka Wells yüzey alanının en kapsayacak ,14. CI çip hücrelerinin daha fazla yüzey kapsama alanı söz konusu olduğunda artırın ve hücre içinde apoptosis kaynaklanan bir toxicant maruz azaltın. Her ne kadar gerçek zamanlı hücre analyzer sitotoksisite11 ve nörotoksisite15 belirlemek ve klasik bitiş noktaları yöntemi daha fazla Kinetik bilgi sağlamak için sık sık kullanılmıştır, tek kullanımlık elektronik costliest tabaklar tüketim maddesi.
Şimdiye kadar muhtemelen gerçeğini dahil16,17, piranha çözüm veya Asetik asit gibi sert rejenerasyon koşulların olması nedeniyle olan elektronik plaka rejenerasyon için kullanılabilir hiçbir yöntem olmuştur. Hangi altın mikroçip elektrik durumunu değiştirebilir 18. Bu nedenle, hafif ve etkili bir yöntem yapışık hücreleri ve diğer maddeler altın chips yüzeyinden kaldırmak için elektronik plaka rejenerasyon işlemi için arzu olacak. Biz son zamanlarda aşındırıcı reaktifler kullanarak tek kullanımlık elektronik plakaları yenilenme amaçlı bir protokol geliştirdik ve rejenere cips elektrokimyasal yanı sıra optik yöntemleri19tarafından karakterize. Tripsin ve etanol gibi laboratuar kolayca kullanılabilir ve ılımlı reaktifler kullanarak, biz iki ana türü yeniden oluşturmak için başarıyla uygulanan ticari elektronik plaka olmadan yan etkiler, yeniden oluşturmak için genel bir yöntem kurduk Elektronik plaka (16 ve L8) kullanılan RTCA için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: genel olarak, tripsin sindirim ve etanol ve su ile durulama adım yenilenme süreci içerir. Sindirim zaman kullanılan hücre sayısına göre değişen ve türüne ve kullanılan hücre sayısına bağlı olarak deneysel amaçlar farklı olabilir. Rejenerasyon koşulları optimize etmek için optik ve elektrokimyasal yöntemleri kullanarak rejenere mikroçip kontrol etmelerini rica ederiz. Deney sırasında çözünür ve çözünmez kimyasallar tutulabilir ve burada bu iki tipik durumda bir yenilenme prosedürü ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
1. yenileme çözümleri hazırlanması
Not: Hazırlamak ve steril koşullarda tüm çözümleri ele.
- Taze %0.25 (g/v) tripsin çözeltisi hazırlamak. Tripsin satın alınan ya da aşağıdaki gibi taze hazırlanmış.
- Tripsin pH 7.4 fosfat tamponlu tuz (PBS) 100 ml 0, 25 g geçiyoruz.
- Çözüm tripsin tam çözüm düşük hızda herhangi bir kabarcık oluşumunu önlemek için dikkat çekici 4 oC. heyecan eriyene kadar karıştırın.
- Çözüm Biyogüvenlik başlıklı 0,22 µm filtre ile filtre.
- % 75 etanol mutlak etanol kullanarak hazırlayın. 75 mL mutlak etanol volumetric flask dökün ve birimin 100 mL ulaşıncaya kadar deiyonize su ekleyin. Daha fazla sterilizasyon gerçekleştirin.
2. kuluçka ve elektronik plakaları A549 hücrelerin çoğalması
Not: Elektronik plaka türleri 16 ve L8 her ikisi de lithographically kuluçka kuyu dibinde baskılı dizilmiş altın microelectrodes yapılır. Elektronik plaka L8 8 wells varken elektronik plaka 16 16 kuyu vardır. Elektronik plaka 16 kuyu yuvarlak yuvarlak köşeli dikdörtgenler olmakla birlikte elektronik plaka L8 kuyu. Her elektronik plaka 8 hacmi de yaklaşık 830 µL ve her elektronik plaka 16 de yaklaşık 270 µL.
- A549 hücre kültürü
- Kültür A549 hücrelerin % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Enstitüsü-1640 orta (RPMI-1640) penisilin-streptomisin hücre kültüründe çanağı.
- Hücre yoğunluğu % ~ 75 ulaştığında hücreleri geçiş sonra yapisan hücre katmanı 1 × PBS ile yıkama ve % 0.25 tripsin çözüm için 1 dk 37 oC. santrifüj az ile hücreleri 179 × g tripsin kaldırmak 5 min için de trypsinize. 10 mL orta daha fazla kültür için hücrelerde veya diğer deneyler resuspend.
Not: Orta resuspended hücre çözüm burada hücre süspansiyon arabellek belirlenmiştir. - 10 µL almak ve bir hemasitometre kullanarak hücre saymak. RPMI-1640 orta daha fazla 30.000-80,000 hücre/mL hücre süspansiyon arabellek deneyler için hazırlamak için hücre süspansiyon arabellek sulandırmak için kullanın.
-
Nükleer silahların yayılmasına karşı/sitotoksisite deney ve veri alma
- 50 µL (elektronik plaka L8 için 150 µL) hücre orta her kuluçka de, bunun için 30 dk içinde Biyogüvenlik hood için denge elektronik plaka 16 ve bırakın ekleyin. El ile eklemek elektronik plaka 16 CO2 kuluçka 37 oC., gerçek zamanlı hücre Çözümleyicisindeki
- Gerçek zamanlı hücre analyzer işlem programı bilgisayarda başlatın. Desen kurulum sayfası varsayılan deneme, "deney modeli" seçin ve çalışan tahlil adlandırın.
- Onun düzen sayfasında denemeye dahil edilen ve düzenleme kutularına hücre türü, sayısı ve uyuşturucu adları gibi bilgileri Giriş karşılık gelen kuyuları seçin. Program sayfasında, deneysel adımlar ekleyin, sonra (örneğin, 12, 24 veya 48 s) çalışma süresi, her adım ve gerçek zamanlı veri toplama aralığını seçin.
Not: Adım 1 ve 2 Aralık burada 1 dk ve 15 dk sonra. - Dosyayı kaydedin ve medya onun hücre dizin sayfasında arka plan empedans ölçmek için "Başlat" düğmesini tıklatın; Sonuçta elde edilen veriler otomatik olarak düşülen. Onun iyi grafik sayfasında, tüm iyi eğrileri ziyaret edilebilir. Wells ve zaman-hücre dizin grafik gösterdi onun arsa sayfasında ekleyin.
- Hücre çoğalması deneme için öncelikle programı duraklatmak için "Ara" düğmesini tıklatın. O zaman elektronik tabak alıp iyi başına 100 µL A549 hücre süspansiyon arabellek oda sıcaklığında ekleyin. 30 dk plaka Biyogüvenlik hood kuluçka kuyu dibine yerleşmek hücreleri izin için bırakın.
- El ile eklemek elektronik plaka gerçek zamanlı hücre analyzer qurğu. Deney devam etmek için "Başlat" düğmesini tıklatın.
Not: çizim sayfasında Çözümleyicisi sürekli hücre dizin değerlerini veya eğrileri boyunca deneme kaydeder. - Deneme tamamlandığında, çizim sayfasına girin ve deneme dosyasını açın. Sonra test kuluçka wells ve ortalama veya ilaç ilaçlar ekleme veya değiştirme deneyleri arasında farklılıklar azaltmak için orta önce en son ne zaman için normalleştirilmiş elde edilen hücre dizin eğrileri seçin. Veri analiz sayfasında EC50 veya IC50 hesaplanabilir
3. elektronik plakaların rejenerasyon
Not: durulama her adım için elektronik plaka çözümde iyice karışık oldu (5 - 10 kez) kullanarak bir pipet.
-
Durum 1: anti sitotoksisite değerlendirilmesi için-kanser ilacı
- Tohum A549 hücreler 2 bölümünde açıklandığı gibi elektronik tabakta.
- Hücre orta anti-kanser ilacı doksorubisin hidroklorür (DOX) ilk geçiyoruz. Yavaş yavaş DOX (son DOX bölgedir 30 µg/mL) hücrelere ekleme bir pipet kullanarak. CI 2 bölümünde açıklandığı gibi kaydedin.
Not: kullanılan elektronik plaka hemen deneme tam oldu sonra yeniden. Bu durumda, DOX çözünür bir kimyasal olduğu gibi elektronik plaka protokol sonrası rejenerasyon nispeten kolay ve hiçbir ek işlem gereklidir. -
Yeniden oluşturma işlemi
- Gerçek zamanlı hücre analyzer istasyonundan hücreleri içeren elektronik plaka çıkarmak. Oda sıcaklığında bir steril Biyogüvenlik hood kullanılan elektronik tabak yerleştirin ve kültür iyice bir pipet kullanarak orta karıştırın. Tüm Orta pipet.
- İçin oda sıcaklığında 3 kere elektronik plakaları 200 µL deiyonize suyla durulayın.
- 1-2 h (200 µL/de) 37 oC. adlı bir kuluçka için taze hazırlanan % 0.25 tripsin ile elektronik Tabaklarda kalan hücreleri sindirmek Sindirim tamamlandığında, Biyogüvenlik başlıklı oda sıcaklığında 5 - 10 kat bir pipet ve pipet tüm çözüm kullanarak kuluçka çözüm mix.
- Elektronik plakaları 200 µL etanol ve 200 µL su ile durulama sırasıyla, aşağıdaki gibi: deiyonize su 2 kez, % 100 etanol 2 kez; % 75 etanol 2 kez; su 2 kez deiyonize. Steril gazlı bez veya kağıt mendil kalan su oda sıcaklığında dikkatle boşaltmak için elektronik tabağa ters çevir.
- Ultraviyole sterilize etmek için 1-2 h Biyogüvenlik başlıklı oda sıcaklığında rejenere elektronik levha.
Not: elektronik plaka L8 rejenerasyon için tüm çözümler hacmi iki katına.
-
Durum 2: ilaç dağıtım mesoporous malzeme kullanarak.
- 5.6 bir ortalama gözenek büyüklüğü ile çubuk benzeri mesoporous silis malzeme kullanımı olarak ilaç teslim matrisler, daha önce bildirilen20nm.
Not: Burada, hücreleri uyuşturucu-yayın etkisi izlemek için elektronik plaka istihdam edildi.- Mesoporous malzemeleri her şey elektronik plakaların kuluçka çözüm içine ekleyin. Silis malzeme çözünür ve elektronik plaka acele değildir olarak plaka aşağıdaki gibi durulama:
- Adımları 3.1.3.1-3.1.3.3 durum 1 için açıklandığı gibi gerçekleştirin.
- Kristallerden mikroçipler 200 µL deiyonize su ile bir kez Biyogüvenlik başlıklı oda sıcaklığında durulayın.
- Kristallerden mikroçipler 200 µL mutlak etanol ile oda sıcaklığında 2 kere yıkayın.
- Kristallerden mikroçipler 200 µL % 75 etanol ile bir kez oda sıcaklığında durulayın.
- 250 µL % 75 etanol her kuyuya ekleyin ve oda sıcaklığında mühürleme film ile elektronik plaka mühür.
- 114 x g 2 min için de spin ve elektronik plaka boş. Steril gazlı bez veya kağıt mendil kalan su oda sıcaklığında dikkatle boşaltmak için elektronik tabağa ters çevir.
- Adım 3.2.5-3.2.7 bir kez yinelenir.
- Ultraviyole sterilize etmek için 1-2 h Biyogüvenlik başlıklı oda sıcaklığında rejenere elektronik levha.
Not: elektronik L8 tabak durulama zaman tüm çözüm hacmi iki katına.
- 5.6 bir ortalama gözenek büyüklüğü ile çubuk benzeri mesoporous silis malzeme kullanımı olarak ilaç teslim matrisler, daha önce bildirilen20nm.
4. rejenerasyon etkisi değerlendirilmesi
-
Rejenere elektronik plaka yüzey optik özellikleri
- Bir çelik de taze, kuluçka alt kısmı dikkatlice sökmeye kaşık ve içeren elektronik plaka yeniden kullanım altın microelectrodes gelemiyor. Plastik eldiven giyiyor, dikkatle çelik kaşık kullanarak elektronik plaka mikroçip içeren bölümünü silin.
- Her iki parça cam mikroskop slaytlar merkezinde yer ve Raman mikroskobu ile CCD dedektörü21donatılmış tarafından elde edilen Raman spectra toplamak.
Not: Spektrometre 633 nm lazer ile donatılmıştı ve spectra 500-3500 cm-1aralığında bir dalga boyu, 30 s lazer maruz kalma bir aralıkta kaydedildi. Optik görüntüleri 10 x gözü lens ve 50 x amacı istimal Raman mikroskobu tarafından elde edilmiştir. Şekil 1A ve şekil 1 c de yüklü Raman mikroskobu cihazları kullanarak elde edilmiştir. - Anti-kanser ilacı alımını taze ve rejenere sonra ekli hücre canlılığı değerlendirmek için elektronik Kaplamalar, kullan bir confocal DOX molekülleri A549 tarafından absorbe spontan Floresans izlemek için tarama mikroskop lazer.
- Absorbe DOX spontan floresan hücreleri (taze ve rejenere elektronik pilakalar ve A549 hücreleri), kullanarak kaydetmek için bir 63 X objektif ve 485 nm uyarma dalga boyu petrol.
-
Rejenere elektrot elektrokimyasal davranışları
Not: el ile bir ticari elektronik tabak dissembling zor ve ideal yüzey elektrik durum değerlendirilmesi için kontrol gibi olduğundan, protokolünün yenilenme etkinliği bir test olarak normal altın/cam gibi karbon elektrot (GCE) kullanılarak değerlendirilmiştir platform, elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) gerçekleştirildiği. Au elektrot ve GCE çapları 3 mm. elektrokimyasal veri üç elektrot sistemi ile bir elektrokimyasal analyzer tarafından elde edilen ve 10 mV genlik alternatif akım (AC) sinyalinin kullanarak empedans ölçümleri yapılmıştır olan bir 0.01 Hz için 100 kHz frekans aralığı.- Ölçüm önce Lehçe Au elektrot ve GCE sonication su herhangi bir parçacıkları kaldırmak için ardından bir polisaj bez bir ayna gibi yüzeye bir Alümina Bulamaç ile için.
- ÖYLESİNE Au elektrot 0,5 M H2harekete geçirmek4. Çıplak Au elektrot ve GCE EIS verilerde 10 mM 1 mM K3[Fe(CN)6] içeren KCl elektrolit çözüm açıklanan22edinin.
- Hisse senedi A549 hücre çözümü 2.1.2 ve 2.1.3 göre hazırlayın. 10 µL hücre süspansiyon GCE ve Au elektrot yüzeyinde bırak. Au elektrot ve hücreleri bir 37 oC kuluçka 3 h. EIS elde veri Au elektrot için modifiye GCE ve 10 mM KCl elektrolit çözüm 1 mM K3[Fe(CN)6] içeren hücrelerde modifiye GCE kuluçkaya.
-
Elektrotlar Protokolü ve ölçü EIS kullanılarak yeniden.
- Au elektrot bırakın ve GCE değiştirilmiş hücreler ile 0,5-%2 0.25 tripsin içinde h. durulama Au elektrot ve GCE yumuşak su ile 4 kez. Elektrotlar usulca mutlak etanol ile 4 kez yıkayın. Au elektrot buğulanırsa ve % 75 etanol ~ 5 dakika süreyle GCE 4 kez % 75 etanol usulca çiplerle durulayın.
- Rejenere Au elektrot ve GCE EIS verilerde 1 mM K3[Fe(CN)6] içeren 10 mM KCl elektrolit çözüm edinin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Altın mikroçip yüzey özellikleri: Bu protokol için kullanılan rejenerasyon yordamlar şekil 1' de özetlenen. Şekil 2 mikroskobik yüzey taze resimlerini ve elektronik plakaları optik mikroskop tarafından yeniden gösterir. Şekil 2A ve şekil 2C, mikroskobik gözlemler olduğunu hemen hemen ima etti gösterildiği gibi mikroçip optik özellikleri arasında fark yoktur taze arasında yüzey ve elektronik plakaları tedavi. Doksorubisin moleküllerin hücre durum değerlendirmesi için uygun hücreye dahil spontan Floresans kullanarak, biz yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra (şekil 2B ve şekil 2B altın mikroçip kültürlü hücrelere benzer bir homojenliği gözlenen ). Ayrıca, inkübe kanser hücrelerinin iyi tanımlanmış bir hücresel Morfoloji cipsi kullanılırlığı gösteren elektronik tabak içinde görüntülenir. Şekil 3 Raman spectra taze ve rejenere elektronik plakaların gösterir. Özdeş Raman tepe dağıtımları taze ve işlenmiş elektronik plakaları arasında altın mikroçip yüzey başarılı rejenerasyon işlemi belirtilen. Raman sinyalleri A549 hücrelerle kaplı elektronik plakaların bir dereceye kadar muhtemelen nedeniyle kendiliğinden floresan A549 hücre müdahalelerden bozuk.
RTCA kullanarak sitotoksisite tahlil için mikroçip yeniden: Biz de hücre çoğalması ve malzeme sitotoksisite değerlendirme (şekil 4) bir test için yenilenme iletişim kuralı uygulanır. A549 hücreleri en uygun yoğunluğu rejenere elektronik tabağa 16 numaralı seribaşı ve büyüme Kinetik eğrileri gerçek zamanlı hücre Çözümleyicisi tarafından kaydedildi. Gösterildiği şekil 4A, yeterli tutarlılık gösterdi paralel deneysel Wells tüm elde edilen büyüme eğrileri hangi elektronik plaka 16 yüzey elektrik durumunu büyük ölçüde yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra korunur belirtti. Rejenere elektronik plaka L8 da mesoporous silis malzeme, şekil 4B' gösterildiği gibi kullanarak sitotoksisite için test edildi. Denetim deney ile karşılaştırıldığında, mesoporous malzemeler tedavi örnekleri CI bir dereceye kadar bir hafif sitotoksisite malzemelerin gösteren azalmıştır. Daha fazla saklama ve serbest bırakmak-in Dox anti-kanser ilacı mesoporous malzemeler A549 büyüme eğrisi, dramatik bir düşüş neden oldu. Bu deneysel sonuçlar tutarlılık taze elektronik plakaları kullanarak ve daha önce bildirilen iş19bu önerilen rejenerasyon protokolünün etkinliği doğrulanmadı, gösterdi.
Elektrokimyasal yöntemlerle değerlendirildi rejenerasyon verimliliği: Ticari Au elektrotlar ve cam gibi karbon elektrotlar test platformları yenilenme verimliliği değerlendirme için kullanılmıştır. Şekil 5 Au EIS elektrotlar ve kanser hücreleri ile değiştirildi GCE gösterir. Bu kuluçka A549 hücre elektrot üzerinde sonra gösterildi, çıplak elektrotlar ile karşılaştırıldığında elektron transferi direnç (Ret) belirgin bir artış gözlenmiştir. Au elektrot ve GCE şekil 5protokolünde göre tedavi edildi sonra Ret önemli ölçüde azalma. Ret hem Au elektrot ve GCE benzer değişiklikler etkili ve evrensel rejenerasyon işlemi mikroçip yüzey elektrik özellikleri ile ilgili olarak belirtilen.
Şekil 1: elektronik plakaları yenilenme sürecinin. Çalıştırmak tipik bir yenilenme içinde hücrelerin yanı sıra yüzeyi onların dekolmanı durulama, iplik ve ultraviyole sterilizasyon adımları takip elektronik plakaların kuluçka dahil olmak üzere dört ana adımları tutulmuştu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: yüzey özelliklerini elektronik plakaların. (B) A549 hücreleri A. (C) Regenerated elektronik kaplama (A) yeni elektronik plakaları tabaklar (D) A549 hücreleri c üzerinde kaplama Altın mikroçip bağlı hücreler durumunda DOX kullanıldı. Şekil 2A ve şekil 2C Xu, Z. ve ark. değiştirilmiştir 19 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Raman spectra farklı tedavi elektronik plakaları. (A) yeni elektronik plaka. (B) A549 hücrelerle yeni elektronik plaka numaralı seribaşı. (C) elektronik plaka yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: A549 hücre büyüme eğrileri üç kez rejenere elektronik Tabaklarda. (A) paralel büyüme eğrileri hücre elektronik tabakta 16 numaralı seribaşı. (B) sitotoksisite testi mesoporous silis malzeme ile hata çubukları (Standart sapma, STD), her kuluçka iyi kaydedilmiş eğrilerinin elektronik tabakta L8. Şekil 4A Xu, Z. ve ark. değiştirildi 19 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Elektrokimyasal empedans spectra farklı altın elektrotlar ve cam gibi karbon elektrotlar (GCE) 10 mM 1 mM K3[Fe(CN)6] içeren KCl elektrolit çözüm olarak değiştiren. (A) farklı tedavi Au elektrotlar. (B) farklı GCE tedavi. Şekil 5A değiştirilmiş fromXu, Z. ve ark. oldu 19 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Chip uygulaması | Rejenerasyon arabellek | Rejenerasyon strateji |
| Yüzey plasmon rezonans (SPR) | Piranha çözüm (H2çok konsantre4/30% H2O2 = 3:1, v/v)17 | analit ve güçlü oksitlenmeye tabanlı yoklama şerit |
| Piezoelektrik Microcantilever sensörler (kısaca) | Glisin-HCl karışımı23,24 | Hedef-sonda karmaşık ayırmak ve analit kaldırmak |
| Yüksek tuz konsantrasyonları çözüm (2M MgCl2 + 1,5 M Tris)25 | ||
| Altın film | 50mM KOH + % 25 H2O226 | Oksitlenmiş organics |
Tablo 1: Kısa bir özetini bildirilen rejenerasyon stratejileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz mikroçip Tablo 1' deki yeniden oluşturulması için çeşitli kullanılabilir yöntemleri17,23,24,25,26 özetlenebilir. Temel olarak, bu yöntemleri cips komple yenilenme güçlü molekül molekül immün kompleks SPR yongaları için kullanılan bu gibi etkileşimleri varlığı nedeniyle elde etmek için nispeten sert deneysel koşullar söz konusu. Ancak, bu sert deneysel koşullar dizilmiş altın mikroçip RTCA kullanılan yüzey özellikleri için son derece zararlı olabilir. Bu nedenle, hafif ve etkili bir yöntem sunulan rejenerasyon stratejisinin geliştirilmesi önemli hususlar vardı. Bu tek kullanımlık mikroçip hedeflenen kanser hücreleri ile birlikte sık sık kullanıldığından eşit derecede önemli olan diğer çevresel kaygılar, faktörlerdir.
Bu protokol için ticari dizilmiş altın mikroçip RTCA için kullanılan Yenileyici genel yöntemler tanıtmak. Bizim iletişim kuralı tripsin-sindirim ve etanol ve su ile durulama temel alınarak geliştirilmiştir. İlave iplik adımları rejenerasyon işlemi için tahlil için kullanılan erimeyen parçacıklar giderilmesinde etkili olduğu kabul edilir. Daha önce bildirilen yöntemlerde kullanılan reaktifler ile karşılaştırıldığında, yenileyici reaktifler tripsin ve etanol günlük labaratuar kullanımı için kullanılabilir ve bu biyolojik ürünler/kimyasalların düşük toksisite vardır ve bu nedenle olarak kabul edilir çevre dostu olan yenilenme amacıyla tercih edilir.
Bu protokol için tripsin sindirim altın mikroçip yenilenme performansı elde etmek için kritik bir adımdır. Trypsinization, konsantrasyon ve zaman, dahil olmak üzere optimizasyonu rejenerasyon elde etmek için birinci öncelik olmalıdır. Bizim önceki rapor19' rasyonalize sindirim zaman yanı sıra, iyi bir değerlendirme için en iyi duruma getirme işlemi sadece bir optik mikroskop kullanarak yüzey özelliklerini kontrol etmektir.
Mikroçip işleme Yenileyici süreci sırasında başka bir husustur. Bir pipet sık deneylerde kullanılan gibi personeli tarafından ucunu mikroçip yüzeyi çizilmemesi önlemek için dikkat edilmeli. Ayrıca, ipuçları, gazlı bez ve rejenerasyon verimliliği sağlamak için kaşık önceden sterilize etmek faydalıdır. Son olarak, herhangi bir kirlenmesini önlemek için Biyogüvenlik mahallede rejenerasyon işlemi yapılmalıdır.
Bu yenilenme protokolünde yer yıkama işlemleri el ile hangi kaçınılmaz nedeniyle farklı personel önyargı neden olacaktır yapılmaktadır olduğunu belirtmek gerekir. Bu sınırlamayı aşmak için amaçlar durulama için otomatik veya yarı otomatik ekipman kullanılan modüler elektronik plakalar dikkate alınarak tasarlanmış özel olabilir. Buna ek olarak, rejenerasyon Protokolü hücre tabanlı deneyleri için etkili olduğu test edilmiştir. Ancak, varlığında antikor-antijen oluşumu cips, arayüz gibi güçlü moleküler etkileşimleri önerilen rejenerasyon koşullar büyük ölçüde sınırlı olabilir ve oldukça güçlü arabellek koşulları dikkate alınmalıdır.
Genel olarak, geçerli rejenerasyon Protokolü ticari altın mikroçipler, yanı sıra diğer iletken elektrot Au gibi ve cam gibi karbon elektrotlar tekrarlanan kullanımı sağlamak için test edilmiştir. Bu iletişim kuralı uygulama gerçek zamanlı çip tabanlı hücre deneyleri çalışan yüksek maliyetini kurtaracak bekliyoruz. Uzun vadede, mikroçip tabanlı deneyleri daha sık proteomik ve hücresel analiz için kullanılan olma ve durulama olabilir bu çalışmada önerilen Protokolü yeniden oluşturma işlemi, hangi otomatik veya yarı otomatik ekipman için bir seçenek sunabilir tasarlanmış ve uygulamalı olarak birikmiş tek kullanımlık cips vakaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
İş Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (U1703118), öncelik akademik Program Geliştirme, Jiangsu yüksek öğretim kurumları (PAPD), Jiangsu Shuangchuang Program, devlet anahtarının açık fonlar tarafından finanse edilen bir proje tarafından desteklenmiştir Laboratuar kemoterapi/Biosensing ve Sharky (2016015) ve Biomacromolecules Ulusal Laboratuvarı (2017kf05) ve Jiangsu Specially-Appointed Profesör projesinin, Çin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
References
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
