Summary
Inyección pronuclear de (PN) del cluster regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) y sistema CRISPR asociados 9 proteína nucleasa (CRISPR/Cas9) es un método altamente eficiente para la producción de transgénicos hámsters sirios dorados. Adjunto, describimos el protocolo detallado de la inyección del PN para la producción de hamsters de gene knockout con el sistema CRISPR/Cas9.
Abstract
La técnica de inyección pronuclear (PN) fue establecida en ratones para introducir material genético extraño en los pronúcleos de embriones en estadío de una célula. El material genético introducido puede integrar en el genoma embrionario y generar animales transgénicos con información genética extranjera después de transferencia de los embriones inyectados para favorecer a las madres. Tras el éxito en ratones, inyección de PN se ha aplicado con éxito en muchas otras especies animales. Recientemente, inyección de PN se ha empleado con éxito para introducir reactivos gene-modificar actividades, tales como el sistema CRISPR/Cas9, para lograr modificaciones genéticas específicas en varios laboratorios y especies animales de la granja. Además de dominar el conjunto especial de microinyección habilidades para producir animales genéticamente modificados mediante la inyección de PN, los investigadores deben entender la fisiología de la reproducción y el comportamiento de las especies objetivo, debido a que cada especie presenta único desafíos. Por ejemplo, embriones de hámster sirio dorado tienen único manejo requisitos en vitro que técnicas de inyección de PN no fueron posibles en esta especie hasta descubrimientos recientes de nuestro grupo. Con nuestro protocolo de inyección de PN de especies modificadas, hemos tenido éxito en producir varios knockout del gen (KO) y knockin hámsteres (KI), que se han utilizado con éxito para enfermedades humanas modelo. Aquí describimos el procedimiento de inyección de PN para entregar el CRISPR/Cas9 complejo a los cigotos del hámster, condiciones de manejo de embriones, procedimientos de transferencia de embrión, y cría necesaria para producir genéticamente modificado hámsteres.
Introduction
El hámster sirio dorado (Mesocricetus auratus) es uno de los roedores más ampliamente utilizados para la investigación biomédica. Según el Departamento de agricultura de Estados Unidos, se utilizaron hámsters aproximadamente 100.000 en los Estados Unidos en 2015, representando el 13% de uso animal, laboratorio total entre las especies cubiertas por la ley de Bienestar Animal (http://www.aphis.usda.gov; acceso 10 de marzo de 2017).
El hámster ofrece varias ventajas sobre otros roedores en el estudio de un número de enfermedades humanas. Por ejemplo, los adenocarcinomas ductal pancreático histopatología de amina N-nitrosobis(2-oxopropyl) (BOP) inducida en hámster es similar a los tumores pancreáticos humanos, BOP tratamiento principalmente induce tumores de la glándula de tiroides en ratas y de pulmón y tumores del hígado en ratones1. Porque los hámsteres son lo solamente pequeño roedor encontrado para apoyar la replicación del adenovirus, son también el modelo de elección para las pruebas de vectores basados en adenovirus oncolíticos y drogas contra adenovirus2,3,4. Otro ejemplo en donde el modelo de hámster ofrece una ventaja sobre las ratas y ratones es en el estudio de la hiperlipidemia. Los seres humanos y hámsters presentan grandes semejanzas en vías metabólicas de lípidos y ambas especies llevan el gen que codifica la acumulación de colesteril éster transferencia proteína (CETP), que desempeña un papel central en lípido metabolismo, mientras que el CETP está ausente en los ratones y ratas5. Además, hámsteres desarrollan enfermedad hemorrágica más representativa de la manifestación humana después de la exposición al virus de Ebola6. Hámsters son también los modelos de elección para el estudio de ateroesclerosis7, carcinomas orales8y9de Miopatías inflamatorias. Recientemente, también ha sido demostrado que hámsteres son altamente susceptibles a la infección del virus Andes y hantavirus pulmonar síndrome-como enfermedad, proporcionando el modelo sólo roedor de los Andes virus infección10.
Para abordar la necesidad insatisfecha de novela genéticas modelos animales estudiar las enfermedades humanas donde no está disponible confiable modelo roedor pequeño, recientemente han tenido éxito en la aplicación del sistema CRISPR/Cas9 para el hámster y han producido varias líneas de genética Ingeniería de hámsteres11. Cigotos de hámster son muy sensibles a medios ambientales que los protocolos de inyección PN desarrollados en otras especies no son adecuados. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo de inyección de PN para el hámster que se adapta a los requisitos especiales para la manipulación de embriones de hámster in vitro. Aquí, describimos el procedimiento de inyección PN detallado utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y las medidas de acompañamiento, desde la preparación del guía solo RNA (sgRNA) para la transferencia de embriones inyectados en hembras receptoras.
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Protocol
Los procedimientos descritos en este protocolo fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de Utah State University (protocolo IACUC: 2484). Hamsters en este protocolo son el adultos (6-10 semanas de edad) LVG cepa hámsters sirios dorados. Los hámsteres están alojados en el vivero en el centro de Bioinnovation, Utah State University. Temperatura ambiente se encuentra a 23 ° C, humedad se establece en 40-50%, y se establece el ciclo de luz 14:00 (luz: oscuridad). Siempre que sea posible, procedimientos de manipulación y surugical de embriones deben realizarse con técnicas estériles.
1. sgRNA y Cas9/sgRNA ribonucleoproteínas (RNP) preparación
- Sintetizar sgRNAs siguiendo los procedimientos de transcripción en vitro descritos en el manual del kit de síntesis (tabla de materiales, suplemento 1).
- Montar ribonucleoproteínas, mezclar 2 μg de Cas9 con 1 μg de sgRNA y incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Para la inyección de la PN, hacer una solución de trabajo en la concentración de 100 ng/μl Cas9 y 50 ng/μl sgRNA con 10 mM de tampón con TE (libre de Rnasa, Tabla de materiales).
2. vasectomía preparación
Nota: La vasectomía se realiza en hamsters macho a 6-8 semanas de edad. La cirugía debe realizarse 10-14 días antes del primer apareamiento. Esterilidad es confirmada por embarazos fallidos de apareamiento con las hembras fértiles. Machos vasectomizados pueden utilizarse normalmente para un año antes de que sean menos sexualmente activos.
- Anestesiar los machos por inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina/xilacina con una dosis de 40 mg/kg (ketamina) y 10 mg/kg (xilacina). Confirmar la anestesia por la falta de un reflejo pedal (pellizco del dedo del pie).
- Pone el hámster sedado en recumbency dorsal sobre un papel seco. Enjuague el abdomen con tres rondas de tratamientos antisépticos alternando quirúrgico friegue soluciones entre alcohol al 70% y povidona yodada.
- Haga una incisión vertical con tijeras quirúrgicas a partir de 1,5 cm craneal al prepucio que se extiende 1 cm a cada lado de la línea media (Figura 1a). Haga una incisión en la piel, tejido subcutáneo y linea alba para acceder el espacio peritoneal (Figura 1b).
- Aplique presión suave sobre el aspecto caudal del escroto a la fuerza los testículos y el tejido graso hacia fuera. Sujete el conducto deferente suavemente con unas pinzas y con cuidado separar los vasos sanguíneos del conducto deferente con un segundo juego de fórceps (figura 1C).
- Mantenga los conductos deferentes con el fórceps para formar un bucle. Calentar la punta del otro fórceps en la llama hasta que esté rojo y luego lo use para quitar el lazo de los conductos deferentes. Inserte el tejido graso y los testículos hacia el abdomen. Quite el conducto deferente en el lado opuesto con los mismos procedimientos.
- Sutura de la musculatura del primero seguida de sutura de la piel. Coloque el animal en una almohadilla caliente en una jaula durante 30 minutos hasta que el animal se recupere. Observar al animal hasta que reanude la actividad normal.
3. programa de preparación de hámster donante/receptor
- Monitor y registro de ciclos estruales.
Nota: Hamsters hembra tienen un ciclo estral de 4-días estable que se mantiene inmediatamente después del parto. Las mujeres en el primer día del estro pueden identificarse por la opaca, amarillenta y pegajosa descarga vaginal (Figura 2a). Las hembras en el día 4 del estro pueden identificarse por el moco transparente y pegajoso (figura 2b). - Para la superovulación de hámster de donantes, superovulate las hembras sexualmente maduras (> 6 semanas) en el primer día del ciclo estral por la inyección del IP de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG, disuelta en PBS como 50 IU/mL) (tabla 1) entre 9-12 AM.
Nota: PMSG es para inducir la superovulación pero no para la sincronización del ciclo estral. - 80 - 84 h después de la inyección de PMSG (día 4, 6-8 PM), colocar las hembras en jaulas con los machos para el apareamiento. Como hámster apareamientos no resultan en cópula enchufes, asegúrese de apareamientos exitosos observando los apareamientos.
- Preparar las hembras seudopreñadas apareamiento las hembras sexualmente maduras en el día 4 de estro con machos vasectomizados. El calendario para la preparación de las hembras donantes y receptores se muestran en la tabla 2.
Nota: Verdaderas hembras preñadas pueden utilizarse también como destinatarios, es decir, las hembras con un color de capa distinguible del color de oro mate con el mismo color fértiles los machos. Cachorros derivados de la transferencia de embriones pueden ser identificados basado en colores de capa. Una ventaja potencial en el uso de verdaderas hembras preñadas es que embriones producidos endógenamente asegurar embarazos exitosos y ayudar a embriones PN inyectado implantar; una desventaja potencial en el uso de verdaderas hembras preñadas como destinatarios es que PN inyectado embriones deban competir con endógeno producido embriones para su implantación.
4. cigoto aislamiento
- Preparar medio de cultivo (HECM-9; receta se describe en el suplemento 2), como se describe anteriormente en McKiernan y Bavister12.
- Un día antes de la inyección de la PN, preparar cigoto manejo de platos (25 μl/gota) y una gota de la inyección del PN (100 μL) de la tapa de una placa de 35 mm con HECM-9. Luego cubrir las gotas medianas con aceite mineral. Medio de equilibrio en una incubadora durante la noche bajo las siguientes condiciones: 37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 y 100% de humedad.
- En el día programado para la inyección de PN, preparar platos lavado de embriones (1 hámster de plato o donante) con HECM-9 y guardar todos los platos en la incubadora hasta su uso.
- Eutanasia a hámsteres superovuladas con CO2.
- Aislamiento de oviducto
- Coloque un hámster hembra eutanasia en recumbency dorsal en un papel tejido o paño quirúrgico y preparar el abdomen con un spray de etanol 70%.
- Con firmeza mantener piel y capa muscular abdominal en la línea media y haga una incisión. Haga una incisión en el peritoneo para exponer los órganos abdominales.
- Tome uno de los cuernos uterinos con una pinza fina y retire el tejido del abdomen. Separar el útero el tejido mesometrium y grasa. Hacer un corte entre el oviducto y ovario y un segundo corte adyacente a la ensambladura del oviducto y útero (incluye una pequeña parte del útero). Coloque los dos oviductos en el mismo recipiente al ras.
- Ras y recoger cigotos
- Bajo el microscopio de disección, sujete el lado del cuerno uterino con una pinza de Dumont #5 Inserte una aguja casera (figura 3) en el lumen del oviducto del extremo infundibuliforme y lave el oviducto con 300-400 μL de medio de HECM-9.
- Recoger inmediatamente los cigotos y lavar dos veces con medio de HECM-9 en el plato de manejo. En esta etapa de desarrollo, todos los cigotos deben ser denudados de células del cúmulo.
- Coloque los cigotos en una incubadora (37,5 ° C, 10% CO2, 5% O de2, 85% N2 y 100% humedad) inmediatamente después de su obtención para minimizar la exposición a la luz.
5. PN inyección
- Descongelar el RNP Cas9/sgRNA en hielo y mantener el complejo en el hielo durante todo el proceso de inyección de la PN.
- Las agujas de inyección con solución Cas9/sgRNA RNP inmediatamente antes de los experimentos de inyección de la carga. Coloque el extremo posterior de las agujas de inyección en el tubo que contiene la solución Cas9/sgRNA RNP y deje que la solución de Cas9/sgRNA RNP llenar la aguja por la acción capilar.
- Preparar el plato de inyección y las agujas. Llenar la pipeta del porta con aceite mineral dentro de ~ 3 m m de la curva de la aguja de titular. Coloque el soporte en la microinyectora con la punta de la aguja horizontal en la parte inferior del plato y llenar la punta de la aguja con medio por succión. Ponga la aguja de inyección en un ángulo de 10-15 º frente al titular.
- Inyección de PN
- Identificar un cigoto y succione bien con la aguja de titular. Idealmente, los pronúcleos masculinos y femeninos están dentro del mismo rango focal y alineado paralelo al soporte.
- Penetrar en la zona y pronúcleos masculinos (posición 3:00) con la aguja de inyección.
- Retirar rápidamente la aguja de inyección una vez que el pronúcleo se hincha para impedir que el núcleo adherido a la aguja y para evitar dañar el pronúcleo.
6. cigotos transferir a hámsteres seudopreñadas
- Anestesiar un hámster seudopreñado (la misma forma que se describe en la sección vasectomía) y colocarlos sobre un paño quirúrgico o papel seco en recumbency ventral.
- Aplicar lubricantes de ojo en los ojos del animal para evitar la sequedad de ojos y cubre la cabeza con un paño o papel para proteger los ojos de la luz. Preparar el aspecto lateral del cuerpo de afeitar por un área de piel de 4 cm x 4 cm sobre cada lado del cuerpo seguido de 3 veces la aplicación de povidona-iodada y peelings de etanol 70% 3 veces. Haga una incisión vertical de 2 cm 2 cm caudal a la última costilla (como se muestra en las figuras 4a, 4b) a cada lado de la espalda del animal.
- Sujete la almohadilla de grasa con fórceps y tirar suavemente hasta que el oviducto y el útero son accesibles. Fije la almohadilla de grasa con una pinzas hemostáticas y reflejar la almohadilla de grasa dorsal en la columna vertebral (figura 4C). La posición del tracto reproductivo tal que el tubo uterino puede ser penetrado con una aguja de 30 calibre para transferencia de embriones (figura 4 d).
- Lave los cigotos inyectados con HECM-9 en un plato nuevo. Utilice una nueva pipeta de vidrio (diámetro: ~ 150-200 μm) para cargar cigotos de 10-15. Arreglar los cigotos como una cadena de perlas seguido por varias burbujas de aire. Introduzca la pipeta en el tubo abierto penetrado de paso 6.3 y sople suavemente en la pipeta de transferencia de los cigotos en el oviducto. Siguen soplando hasta que se libera la primera burbuja de aire en la zona del oviducto (Figura 4e).
- Suelte la almohadilla de grasa y retomar el tejido del abdomen. Aproximadamente el mismo número (10-15) la transferencia de embriones inyectados a otra zona del oviducto por los mismos procesos.
- La sutura de la musculatura y la piel en 2 capas. Administre buprenorfina-HCL (0.5 mg/kg) por vía subcutánea como analgesia post-operatoria. Retomar el hámster en una jaula y poner la jaula en una almohadilla caliente para la recuperación. Volver a la jaula a la sala de animales cuando el animal está totalmente recuperado de la anestesia. Analgésicos después de la operación se dan otra vez seis horas más tarde.
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Representative Results
La eficiencia del protocolo descrito en la producción de transgénicos hamsters depende de los resultados de los siguientes dos pasos críticos: la tasa de nacidos vivos de hembras receptoras y del número de cachorros vivos con el previsto modificaciones genéticas. La tasa de nacidos vivos es resultado directo de la calidad del embrión y la habilidad de la persona realizando la inyección de PN y procedimientos de transferencia de embrión. Para asegurarse de que no se comprometa el potencial de desarrollo de los embriones manipulados, gran cuidado es necesario durante la manipulación en vitro de los embriones de hámster. Regularmente logramos una tasa de nacidos vivos de 60-80% con seudopreñadas hembras receptoras. La tabla 3 ilustra las tasas de nacidos vivos desde el experimento de nocaut de RAG1 (seudopreñadas hembras fueron utilizadas) y el experimento de nocaut STAT2 (se utilizaron hembras negro verdadero; tasa de nacidos vivos en este caso se calculó como la porcentaje de camadas había producido cachorros golden).
El porcentaje de crías genéticamente producidos a partir de embriones PN inyectado depende tanto la eficiencia de los sgRNA en la introducción de la inyección acertada de las ribonucleoproteínas Cas9/sgRNA y indels en los pronúcleos. Encontramos que los sgRNA eficiencia varía entre objetivos gene (observaciones no publicadas). Como se muestra en la tabla 3, lo sgRNA diseñado para STAT2 dio lugar a un gene targeting eficiencia de 88.9%, mientras que los sgRNA de RAG1 era sólo 28.6% de eficiencia. Figura 5 se proporciona un ejemplo de la genotipificación resultados de un ensayo PCR restricción fragmento longitud polimorfismo (PCR-RFLP) de cachorros de RAG1 gene targeting. Es importante tener en cuenta que algunos indels pueden ocurrir fuera de la secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción, que PCR-RFLP puede subestimar el gene targeting eficiencia. Subcloning los productos PCR en vectores de clonación TA seguido por Sanger secuenciación de la PCR son necesario exactamente gene de medida dirigidos a la eficiencia y revelar la naturaleza de indels.
Figura 1: Hámster masculina vasectomía.
a) y b) haga una incisión vertical de 2 cm empezando 1.5 cm craneal al prepucio extender cranially; c) separar la deferencia de vas de arteria y vena testicular asociada con dos pares de pinzas; d) Sujete el conducto deferente con un fórceps para formar un lazo de 1 cm. Un segundo conjunto de pinzas de calor y suprimir el bucle mientras la cauterización de los extremos al mismo tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: el ciclo estral.
a) la secreción vaginal observada el día 1 es opaco, amarillento y pegajoso b) observable del flujo vaginal en el día 4 es claro y pegajoso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación de la aguja para el aislamiento del embrión.
un) una aguja de 30 calibre a lo largo de la línea roja de la fractura y pulir la punta hasta que quede plana y lisa. b) hacer un ángulo de 30-40 ° ~ 3 mm de la punta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Transferencia de cigoto.
a) y b) haga una incisión vertical largo 2 cm a partir de 2 cm caudal a la última costilla (línea roja); c) Fije la almohadilla de grasa con una pinzas hemostáticas y reflejar el tejido dorsal; d) ajustar la posición de la zona del oviducto y penetrar un abierto con una aguja de 30 calibre; e) arreglar los cigotos como una cadena de perlas dentro del vidrio de transferencia de embrión pipeta y transfieren en el oviducto del abierto penetrado. Barra = 1, 000 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Ensayo de PCR-RFLP de una sola camada de animales fundador de RAG1 Indels. M: 1 Kb Plus escalera. PESO: tipo de salvaje. ID 1, 3 y 7 muestran banda sin cortes constantes con indels RAG1 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Peso (g) | PMSG (IU) | PMSG (ul) |
| < 110 | 10 | 200 |
| 110-135 | 15 | 300 |
| 135-160 | 20 | 400 |
| 160-185 | 25 | 500 |
| > 185 | 30 | 600 |
| PMSG, gonadatropin de suero de yegua preñada | ||
Tabla 1. PMSG hace correspondiente al peso corporal
| Hámster | Día 1 | Día 2 | Día 3 | Día 4 | Día 5 |
| Donantes | PMSG (9-12 am) | Apareamiento (6-20:00) | Aislamiento de cigoto (12-13:00) | ||
| Inyección de PN (1-15:00) | |||||
| Destinatario | Apareamiento (6-20:00) | Transferencia de embriones (3-17:00) |
Tabla 2. Horario de realización del donante/receptor
| Genes | Jajaja Embriones (PUP) | Jajaja Camadas (destinatarios) | Jajaja Cachorros positivo (%) |
| STAT2 | 229 (54) | 14 (19) * | 48 (88.9) |
| RAG1 | 77 (21) | 3 (3) | 6 (28,6) |
| * las hembras mate con machos fértiles fueron utilizadas; el número de camadas indicado es sólo esos cachorros de oro producidos. | |||
Tabla 3. Eficiencia de Gene Targeting en el hámster sirio dorado por el sistema de Cas9/sgRNA
| Condición y manejo | Requisitos | Comentarios |
| Luz de ambiente | Apague toda la luz ambiente | Embriones de hámster son sensibles a la luz, especialmente para enfriar la luz |
| Luz durante la manipulación in vitro | Menos de 20 minutos para la inyección de PN | Manipular 15 embriones por ronda para reducir la exposición a la luz |
| Temperatura | Temperatura ambiente: 28±0.5 oC | Embriones de hámster son sensibles a las fluctuaciones de temperatura |
| Manejo de temperatura: 37,5 oC | ||
| Medio | HECM-9 | No almacene más de 3 días |
| Condición de la cultura | 37,5 oC, 10% CO2, 5% O2 y 100% de humedad | Equilibrado durante la noche en incubadora |
| Agricultura después de la transferencia de embriones | No cambie la jaula dentro de 5 días antes y después de la debida fecha | Destinatario canibalizan PUP si perturbado; proporcionar suficiente agua de alimentación |
Tabla 4. Necesidades en el manejo de embrión del hámster y la cría de
Suplemento 1: sintetizar sgRNA GeneArt precisión síntesis kit. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Suplemento 2: receta de embrión del hámster medio de cultivo-9 (HECM-9). Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Para aprovechar mejor el potencial de hámsters sirios dorados como modelos de enfermedades humanas, hemos desarrollado un protocolo de inyección de PN para entregar un CRISPR/Cas9 complejo para el genoma de hámster. El protocolo de inyección PN optimiza varias variables claves, incluyendo el medio de cultivo de embriones, la temperatura y longitudes de onda de luz13. También existen varios procedimientos de manejo de animales hamster específicos que deben seguir para la realización con éxito de gene targeting en el hámster. Por ejemplo, hamsters hembra sexualmente madurados tienen estables ciclos estruales de 4 días que no puede sincronizarse con hormonas exógenas (por ejemplo, PMSG). Así seguimiento con precisión los ciclos estral de cada mujer es importante para la superovulación y preparación de seudoembarazo. 30 - cigotos 60 pueden ser producidos de una mujer si ella está con éxito superovulada. Para lograr superovulación exitosa, es necesario considerar sobre deposición de grasa. Hámsteres femeninos, especialmente los más de 12 semanas de edad, tienden a tener exceso de grasa abdominal que la aguja de la jeringa debe estar correctamente colocada para penetrar completamente en la almohadilla de grasa cuando se realizan inyecciones de hormonas. Hemos encontrado que el medio de penetración en la cavidad peritoneal alcanza la distancia apropiada para la entrega de la hormona. Resumimos los requerimientos únicos del PN inyección, hámster manejo y cría en la tabla 4.
Para la inyección de la PN, el número de embriones transferidos en el plato de inyección para cada ronda de inyección debe ser determinado experimentalmente para evitar tiempo de inyección prolongada. Cuanto más el tiempo los embriones permanecen en el plato, mayor será la probabilidad de que experimentan la sobreexposición a la luz. Recomendamos transferir aproximadamente 15 embriones al plato de inyección para cada ronda de inyecciones. Este número consigue un buen equilibrio entre el número de rondas de las inyecciones y la exposición tolerable de los embriones a la luz. Como las membranas citoplasmáticas y pronuclear de embriones de hámster son bastante flexibles, fuerza substancial debe ser aplicado a la aguja para penetrar la membrana del pronúcleo. Durante este tiempo, los pronúcleos deben permanecer dentro de la gama focal.
Los investigadores deben considerar los siguientes aspectos quirúrgicos cuando se realizan transferencias de embriones. En primer lugar, es importante que las incisiones a través de la pared del cuerpo se corresponden con el tamaño del cuerpo del animal. Si la incisión es muy pequeña, puede resultar en la protuberancia de los cigotos de oviducto cuando el tracto reproductivo para el abdomen. Además Tamaño de la incisión, puede minimizarse el potencial para la extrusión de cigotos del oviducto por manipulación de la almohadilla de grasa asociada más que el tejido reproductivo adecuado. En cuanto a tamaño de la incisión, también es importante considerar que incisiones más grandes pueden causar más estrés al animal y presentan una mayor probabilidad de complicaciones (p. ej. dehiscencia de la infección). En segundo lugar, para minimizar el sangrado, los investigadores deben tener cuidado para evitar punzar vasos sanguíneos importantes en el acceso al abdomen porque la pérdida de sangre excesiva puede aumentar el estrés de la cirugía para reducir el éxito de la transferencia de embriones y extender el tiempo de recuperación
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Disclosures
ZW tiene intereses financieros en Auratus Bio, LLC., una empresa de biotecnología especializada en la creación de animales modificados genéticamente para investigación biomédica y las aplicaciones agrícolas.
Acknowledgments
Investigación en esta publicación fue apoyada por los institutos nacionales de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número 1R41OD021979 (a ZW) y por una beca de investigación de última generación BioGreen 21 Programa, República de Corea, subsidio no. PJ01107704 (a ZW) y subsidio no. PJ01107703 (a IK). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud o BioGreen 21. Agradecemos a Dr. Nikolas Robl para editar el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μg/μL (~6.1 μM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
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