Summary
Pronuclear (PN) injektion af den grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) og CRISPR-forbundet protein-9 nukleasen (CRISPR/Cas9) system er en yderst effektiv metode til fremstilling af gensplejsede gyldne syriske hamstere. Heri, beskriver vi detaljeret PN injektion protokollen til produktion af genet knockout hamstere med CRISPR/Cas9-systemet.
Abstract
Pronuclear (PN) injektionsteknik blev først etableret i mus at indføre udenlandske genetiske materiale i pronuclei af én-celle stadium embryoner. Det indførte genetiske materiale kan integrere i den embryonale genom og generere transgene dyr med udenlandske genetiske oplysninger efter overførsel af de injicerede embryoner for at fremme mødre. Efter succesen i mus, PN injektion er blevet anvendt med succes i mange andre dyrearter. For nylig, PN injektion er blevet med held ansat at indføre reagenser med gen-ændring aktiviteter, som CRISPR/Cas9-systemet til at opnå lokationsspecifikke genetiske modifikationer i flere laboratorium og gård dyrearter. Ud over at beherske den særlige sæt af mikroinjektion færdigheder til at producere genetisk modificerede dyr ved PN injektion, skal forskere forstå reproduktion fysiologi og adfærd af målarter, fordi hver art præsenterer unikke udfordringer. For eksempel, gyldne syriske hamster embryoner har unikke håndtering af krav i vitro således at PN injektionsteknik ikke var muligt i denne art indtil de seneste gennembrud af vores gruppe. Med vores arter-modificerede PN injektion protokol lykkedes det producerer flere gen knockout (KO) og knockin (KI) hamstere, som har været anvendt med succes til model menneskelige sygdomme. Beskriver her vi PN injektion procedure til at levere CRISPR/Cas9 komplekse til zygotes af hamster, embryo håndtering betingelser, embryo transfer procedurer, og dyrehold kræves for at producere genetisk modificerede hamstere.
Introduction
Den gyldne syriske hamster (Mesocricetus auratus) er en af de mest udbredte gnavere for biomedicinsk forskning. Ifølge det amerikanske Department of Agriculture, blev ca 100.000 hamstere brugt i USA i 2015, svarende til 13% af samlede laboratorium animalsk skik blandt de arter, der er omfattet af den animalsk velfærd opføre (http://www.aphis.usda.gov; adgang til Marts 10, 2017).
Hamster tilbyder flere fordele sammenlignet med andre gnavere i studiet af en række menneskelige sygdomme. For eksempel histopatologi af N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) induceret i bugspytkirtlen duktalt adenocarcinomer i hamster er svarende til menneskelige Pankreas tumorer, mens BOP behandling primært inducerer skjoldbruskkirtlen tumorer hos rotter og lunge og lever tumorer i mus1. Fordi hamstere er kun små gnavere fundet støtte replikering af adenovirus, er de også model valg for afprøvning af adenovirus-baserede oncolytic vektorer og anti-adenovirus narkotika2,3,4. Et andet eksempel hvori hamster model tilbyder en fordel frem for mus og rotter er i studiet af hyperlipidæmi. Mennesker og hamstere udviser store ligheder i lipid stofskifteveje og begge arter bærer genet kodning cholesteryl ester overførsel protein (CETP), som spiller en central rolle i lipid metabolismer, mens CETP er fraværende i mus og rotter5. Derudover udvikle hamstere hæmoragisk sygdom mere repræsentativt for den menneskelige manifestation efter udsættelse for Ebola virus6. Hamstere er også modeller af valg for at studere åreforkalkning7og mundtlige karcinomer8inflammatoriske myopatier9. Det har for nylig også påvist, at hamstere er meget modtagelige for Andes virusinfektion og udvikle hantavirus pulmonal syndrom-lignende sygdom, giver den kun gnaver model af Andes virus infektion10.
For at løse den udækket behov for nye genetiske dyremodeller for at studere de menneskelige sygdomme hvor ingen pålidelig lille gnaver model er tilgængelig, vi for nylig lykkedes at anvende ordningen for CRISPR/Cas9 til hamster og har produceret flere linjer af genetisk manipuleret hamstere11. Hamster zygotes er meget følsomme over for miljømæssige miljøer, således at PN injektion protokoller udviklet i andre arter er uegnede. Derfor, har vi udviklet en PN injektion protokol til hamster, der rummer de særlige krav til håndtering af hamster embryoner in vitro. Her, beskriver vi de detaljerede PN injektion metode bruger CRISPR/Cas9-system og den ledsagende foranstaltninger, fra forberedelse af enkelt guide RNA (sgRNA) til overførsel af injicerede embryoner til modtagerens hunner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurerne i denne protokol godkendtes af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Utah State University (IACUC protokol: 2484). Hamstere bruges i denne protokol er voksne (6-10 uger gammel) LVG stamme gyldne syriske hamstere. Alle hamstere er opstaldet i vivarium på byens Bioinnovation, Utah State University. Stuetemperatur er beliggende på 23 ° C, luftfugtighed er fastsat til 40-50% og lys cyklus ligger 14L: 10D (lys: mørke). Når det er muligt, skal embryonet manipulation og surugical procedurer udføres med steril teknik.
1. sgRNA og Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) forberedelse
- Syntetisere sgRNAs henhold til in vitro- transskription procedurerne beskrevet i manualen om syntese kit (materialer tabel, tillæg 1).
- At samle ribonucleoproteins, mix 2 µg af Cas9 med 1 µg for sgRNA og inkuberes mix ved stuetemperatur i 10-15 min. For PN injektion, skal du gøre en brugsopløsning på koncentrationen af 100 ng/µL Cas9 og 50 ng/µL sgRNA med 10 mM TE buffer (RNase gratis, Materialer tabel).
2. vasektomi forberedelse
Bemærk: Vasektomi er udført på mandlige hamstere på 6-8 ugens i alder. Operationen skal udføres 10-14 dage før den første parring. Sterilitet er bekræftet af mislykkede graviditeter fra parring med fertile hunner. Vasectomized hanner kan normalt anvendes til et år, før de bliver mindre seksuelt aktive.
- Bedøver hanner ved intraperitoneal (i.p.) injektion af ketamin/xylazin med en dosis på 40 mg/kg (ketamin) og 10 mg/kg (xylazin). Bekræfte anæstesi af mangel på en pedal refleks (tå knivspids).
- Lå bedøvet hamster i dorsal recumbency på en tør silkepapir. Skyl maven med tre runder af antiseptiske behandlinger ved vekslende kirurgisk krat løsninger mellem 70% alkohol og povidon-jod.
- Gøre et lodret snit med kirurgisk saks begynder 1,5 cm kranie til forhud udvide 1 cm til hver side fra midten af linje (figur 1a). Incise hud, subkutane væv, og linea alba hen til adgang den peritoneale plads (figur 1b).
- Gælde den caudale aspekt af pungen at tvinge testiklerne og fedtvæv ud blide tryk. Forstå sædlederen forsigtigt med pincet og forsigtigt adskille blodkar fra tyverialarmen med et andet sæt af pincet (figur 1 c).
- Hold sædlederen med pincet til at danne en løkke. Varme spidsen af en anden pincet i flammen, indtil den er rød, og derefter bruge det til at fjerne loop af sædlederen. Indsæt fedtvæv og testiklerne tilbage til maven. Fjerne sædlederen på den modsatte side med de samme procedurer.
- Sutur muskulaturen først efterfulgt af sutur i huden. Placere dyret på en varm pad i et bur i 30 min, indtil dyret genopretter. Observere dyret, før det genoptager normal aktivitet.
3. donor/Recipient Hamster forberedelse tidsplan
- Overvåge og registrere estrous cyklus.
Bemærk: Kvindelige hamstere har en stabil 4-dage estrous cyklus, der er vedligeholdt umiddelbart efter fødsel. Hundyr på den første dag af duft kan identificeres af de uigennemsigtige, gullig og klæbrig udflåd (figur 2a). Hundyr på dag 4 af duft kan identificeres ved hjælp af gennemsigtige, klæbrig slim (figur 2b). - For superovulation af donor hamster, superovulate de kønsmodne hunner (> 6 uger) på den første dag i den estrous cyklussen af IP injektion af gravide mare serum gonadotropin (PMSG; opløst i PBS som 50 IE/mL) (tabel 1) mellem 9-12 AM.
Bemærk: PMSG er for at fremkalde superovulation men ikke for estrous cyklus synkronisering. - 80 - 84 h efter injektion af PMSG (dag 4, 6-8 PM), placere hunnerne i burene med hanner til parring. Hamster parringer ikke resulterer i samleje stik, sikre vellykkede parringer ved at se parringer.
- Forbered pseudopregnant hunner ved parring kønsmodne hunner på dag 4 af duft med vasectomized hanner. Med tidsplanen for udarbejdelsen af donor og recipient hunner er vist i tabel 2.
Bemærk: Ægte gravide kvinder kan også bruges som modtagere, dvs, kvinder med en pelsfarve kan skelnes fra den gyldne farve sammenfiltret med de samme farve frugtbar hanner. Pups afledt af ægoplægning kan identificeres baseret på pelsfarver. En potentiel fordel i at bruge sand drægtige hundyr er at endogent producerede embryoner ville sikre vellykkede graviditeter og hjælpe PN injiceres embryoner til implantatet; en potentiel ulempe i at bruge sand drægtige hundyr som modtagere er at PN injiceres embryoner skal konkurrere med endogent producerede embryoner til implantation.
4. zygote Isolation
- Forberede næringssubstratet (HECM-9; opskrift er beskrevet i tillæg 2), som tidligere beskrevet i McKiernan og Bavister12.
- En dag i PN injektion, forberede zygote håndtering retter (25 µL/drop) og en PN injektion dråbe (100 µL) i låget af en 35 mm fad med HECM-9. Så dække de medium dråber med mineralsk olie. Balance medium i en inkubator natten under følgende betingelser: 37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 og 100% luftfugtighed.
- Dag planlagt til PN injektion, tilberedes embryo rødmen skåle (1 fad/donor hamster) med HECM-9 og gemme alle retter i rugemaskinen indtil brug.
- Aflive superovulated hamstere med CO2.
- Oviduct isolering
- Placer en aflivede kvindelige hamster i dorsal recumbency på en kirurgisk drapere eller silkepapir og forberede maven med en 70% ethanol spray.
- Fast holde huden og mavemuskel lag på midterlinjen og gøre et snit. Incise bughinden for at udsætte den abdominale organer.
- Gribe et af de uterine horn med en god pincet og trække væv fra underlivet. Adskilt livmoderen fra mesometrium og fedt væv. Gøre et snit mellem ovidukten og æggestok og et andet snit støder op til krydset af oviduct og livmoder (omfatter en lille del af livmoderen). Placer de to æggelederne i den samme flush parabol.
- Skyl og indsamle zygotes
- Mikroskopet dissektion gribe siden af uterin horn med en #5 Dumont pincet og indsætte en hjemmelavet nål (figur 3) i lumen af oviduct fra de infundibular ende og skylle oviduct med 300-400 µL af HECM-9 medium.
- Indsamle zygotes straks og vaske dem to gange med HECM-9 medium i håndtering parabol. I denne fase af udviklingen, bør alle zygotes undveg fra cumulus celler.
- Placere zygotes i en inkubator (37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 og 100% luftfugtighed) umiddelbart efter indsamling for at minimere eksponering for lys.
5. PN injektion
- Optø Cas9/sgRNA RNP på is og opretholde komplekse på isen under hele PN indsprøjtningssystem processen.
- Indlæse injektion nåle med Cas9/sgRNA RNP løsning umiddelbart før injektion eksperimenter. Placer bagenden af injektion nåle ind i røret, der indeholder Cas9/sgRNA RNP løsning og lad Cas9/sgRNA RNP løsningen at udfylde nålen ved kapillaritet.
- Forberede injektion parabol og nåle. Fyld indehaveren pipette med mineralsk olie til ~ 3 mm af bøje af indehaveren nålen. Sæt holderen på microinjector med spidsen af nålen vandret til bunden af fadet og fylde spidsen af nålen med medium af suge. Indstille injektion nålen i en 10-15° vinkel modsat indehaveren.
- PN injektion
- Identificere en zygote og anvende et fint suge med indehaveren nålen. Ideelt, de mandlige og kvindelige pronuclei er inden for den samme brændvidde og justeret parallelt til indehaveren.
- Trænge ind i zona og mandlige pronuclei (3 klokken stilling) med indsprøjtning nålen.
- Trække injektion nålen hurtigt, når pronucleus svulmer forhindre kernen fastholdelsen af nålen og undgå at beskadige pronucleus.
6. zygotes overførsel til Pseudopregnant hamstere
- Bedøver en pseudopregnant hamster, (samme måde som beskrevet i afsnittet vasektomi ovenfor) og lægge den på en kirurgisk drapere eller tør silkepapir i ventrale recumbency.
- Anvende øje smøremidler for øjnene af dyret til at forhindre øjet tørhed og dække hovedet med en klud eller papir til at beskytte øjnene mod lyset. Forberede den laterale aspekt af kroppen ved barbering en ca 4 cm x 4 cm hudområde på hver side af kroppen efterfulgt af anvende 3 gange af povidon-jod scrubs og 3 gange 70% ethanol scrubs. Lave en 2 cm lodret snit 2 cm caudale til det sidste ribben (som vist i tal 4a, 4b) på hver side af bagsiden af dyret.
- Forstå det fedt pad med pincet og træk forsigtigt indtil oviduct og livmoderen er synlige. Klemme det fedt pad med en hemostats og afspejler det fedt pad dorsalt over rygsøjlen (fig. 4 c). Placer forplantningsorganerne, således at æggelederen kan være trængt med en 30 gauge kanyle til ægoplægningen (figur 4 d).
- Vask de injiceres zygotes med HECM-9 i en ny parabol. Brug en ny glas pipette (diameter: ~ 150-200 µm) at indlæse 10-15 zygotes. Arrangere zygotes som en kæde af perler efterfulgt af flere luftbobler. Indsæt pipetten i åben trængte røret fra trin 6.3 og forsigtigt blæse ind pipette til at overføre zygotes til ovidukten. Fortsætte blæser indtil den første luftboble er udgivet i oviduct tarmkanalen (figur 4e).
- Frigive det fedt pad og vende tilbage i vævet til maven. Overføre ca det samme antal (10-15) injiceres embryoner til en anden oviduct tarmkanalen af de samme processer.
- Sutur muskulaturen og huden i 2 lag. Administrere buprenorphin-HCL (0,5 mg/kg) subcutaneously som post-op analgesi. Returnere hamsteren til et bur og placere buret på en varm pad til nyttiggørelse. Returnere buret til den animalsk værelse, når dyret er fuldt tilbagebetalt af anæstesi. Post-op analgetika får igen seks timer senere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten af de beskrevne protokol i at producere genetisk modificerede hamstere afhænger af resultaterne af de følgende to kritiske trin: live fødselstallet af modtagerens hunner og antallet af levende unger med de påtænkte genetiske modifikationer. Live fødselstallet er en direkte resultater af embryo kvalitet og dygtighed af den enkelte udfører PN injektion og embryo transfer procedurer. For at sikre, at den udviklingsmæssige potentiale af manipulerede embryoner ikke er kompromitteret, er stor omhu nødvendig ved in vitro- håndtering af hamster embryoner. Regelmæssigt opnår vi en live fødselstallet på 60-80% med pseudopregnant modtager hunner. Tabel 3 viser live fødselstallet fra RAG1 knockout eksperiment (pseudopregnant hunner blev brugt) og STAT2 knockout eksperiment (sande gravid sorte hunner blev brugt; live fødselstallet i dette tilfælde blev beregnet som den procentdel af kuld produceret golden hvalpe).
Procentdelen af genmodificerede pups produceret fra PN injiceres embryoner afhænger af sgRNA i at indføre indels og vellykket injektion af Cas9/sgRNA ribonucleoproteins i pronuclei effektivitet. Vi fandt, at sgRNA effektivitet varierer blandt gen mål (upublicerede observationer). Som vist i tabel 3, resulterede sgRNA designet til STAT2 i et gen målretning effektivitet af 88.9%, mens sgRNA for RAG1 var kun 28,6% effektiv. Figur 5 giver et eksempel på genotypebestemmelse resultater fra en PCR begrænsning fragment længde polymorfisme (PCR-RFLP) analysen af hvalpe fra RAG1 gen målretning. Det er vigtigt at bemærke, at nogle indels kan forekomme uden for begrænsning enzym anerkendelse sekvens, at PCR-RFLP kan undervurdere genet målretning effektivitet. Subcloning PCR-produkter til TA kloning vektorer efterfulgt af Sanger sekventering af PCR skær er nødvendigt at præcist foranstaltning gen målretning effektivitet og til at afsløre karakter af indels.
Figur 1: Mandlige Hamster Vasectomy.
a) og b) gøre en 2 cm lodret snit begynder 1,5 cm kranie til forhud udvide cranially; c) adskille vas ærbødighed fra tilknyttede testikel vene- og arterie med to par pincet; d) forstå sædlederen med en pincet til at danne en 1 cm sløjfe. Varme et andet sæt af tang og punktafgifter løkken mens ætsende ender samtidigt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Estrous cyklus.
en) udflåd observeret på dag 1 er uigennemsigtig, gullig og klæbrig b) udflåd kan iagttages på dag 4 er klar og klistret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forberedelse af nålen til Embryo Isolation.
en) fraktur en 30 gauge kanyle langs den røde linje og polske spidsen indtil den er flad og glat. b) laver en 30-40 ° vinkel på ~ 3 mm fra spidsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Zygote overførsel.
a) og b) gøre en 2 cm lange lodrette snit starter 2 cm caudale til den sidste ribben (rød linje); c) klemme det fedt pad med en Hemostats og afspejle vævet dorsalt; d) justere placeringen af oviduct tarmkanalen og trænge et åbent med en 30 gauge kanyle; e) arrangere zygotes som en kæde af perler i embryo transfer glas afpipetteres og overføre dem til ovidukten fra det trængte åbne. Bar = 1, 000 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. PCR-RFLP analyse af et enkelt kuld af grundlægger dyr med RAG1 Indels. M: 1 Kb Plus stige. WT: vildtype. -ID 1, 3 og 7 Vis uncut band overensstemmelse med RAG1 indels. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Vægt (g) | PMSG (IU) | PMSG (ul) |
| < 110 | 10 | 200 |
| 110-135 | 15 | 300 |
| 135-160 | 20 | 400 |
| 160-185 | 25 | 500 |
| > 185 | 30 | 600 |
| PMSG, gravide mare serum gonadatropin | ||
Tabel 1. PMSG gør svarende til kroppen vægte
| Hamster | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 |
| Donor | PMSG (9-12 am) | Parring (6-8 pm) | Zygote isolation (12-1 pm) | ||
| PN indsprøjtning (1-3 pm) | |||||
| Modtageren | Parring (6-8 pm) | Ægoplægning (3-5 pm) |
Tabel 2. Tidsplan for Donor/Recipient forberedelse
| Gener | Lol Embryoner (unger) | Lol Kuld (modtagere) | Lol Positive unger (%) |
| STAT2 | 229 (54) | 14 (19) * | 48 (88.9) |
| RAG1 | 77 (21) | 3 (3) | 6 (28,6) |
| * Hunnerne sammenfiltret med frugtbar hanner blev brugt; antallet af kuld angivet er kun de producerede golden hvalpe. | |||
Tabel 3. Effektiviteten af genet Targeting i Golden syriske Hamster af ordningen med Cas9/sgRNA
| Tilstand/håndtering | Krav | Kommentarer |
| Omgivende lys | Slå alle omgivende lys | Hamster embryoner er følsomme over for lys, især til at afkøle lys |
| Lys under in vitro-håndtering | Mindre end 20 min til PN injektion | Manipulere 15 embryoner pr. runde at reducere lys eksponering |
| Temperatur | Omgivende temperatur: 28±0.5 oC | Hamster embryoner er følsom over for temperaturudsving |
| Håndtering af temperatur: 37,5 oC | ||
| Medium | HECM-9 | Må ikke opbevares mere end 3 dage |
| Kultur tilstand | 37,5 oC, 10% CO2, 5% O2 og 100% luftfugtighed | Afbalanceret overnatning i inkubator |
| Opdræt efter ægoplægning | Ikke ændre bur senest 5 dage før/efter behørig dato | Modtageren vil kannibalisere hvalpe hvis forstyrret; give nok foder/vand |
Tabel 4. Unikke krav på Hamster Embryo håndtering og dyrehold
Tillæg 1: syntetisere sgRNA af GeneArt præcision syntese Kit. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Tillæg 2: Hamster Embryo næringssubstratet-9 (HECM-9) opskrift. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at bedre udnytte potentialet i golden syriske hamstere som modeller for menneskelig sygdom, udviklede vi en PN injektion protokol for at levere en CRISPR/Cas9 komplekse at målrette hamster genom. PN injektion protokol optimerer flere nøglevariabler herunder embryo næringssubstrat, temperatur og bølgelængder af lys13. Der er også flere hamster-specifikke animalske håndtering procedurer, der skal følge til succesrig gennemførelse af genet målretning i hamster. For eksempel, har seksuelt modnet kvindelige hamstere stabile 4-dages estrous cyklus, der ikke kan synkroniseres med eksogene hormoner (f.eks. PMSG). Dermed nøjagtigt sporing estrous cyklus af hver kvinde er vigtigt for både superovulation og pseudopregnancy forberedelse. 30 - 60 zygotes kan produceres fra en kvinde, hvis hun er med succes superovulated. For at opnå succesfulde superovulation, er det nødvendigt at overveje artsspecifikke aflejring af fedt. Kvindelige hamstere, især dem slut 12 ugens i alder, tendens til at have overdreven abdominal fedt, således at sprøjte nål skal placeres korrekt for at fuldt trænge ind i fedt pad, når du udfører hormonindsprøjtninger. Vi har fundet, at indtrængen halvvejs i bughulen opnår passende afstand til hormon levering. Vi sammenfattet de unikke krav til PN injektion, hamster håndtering og dyrehold i tabel 4.
For PN injektion, skal antallet af embryoner overført til injektion fadet for hver runde af injektion bestemmes eksperimentelt at undgå udvidede injektion tid. Jo længere tid embryonerne forbliver i skålen, jo større chancen for, at de oplever overeksponering for lys. Vi anbefaler, at overføre ca 15 embryoner til injektion fadet for hver runde af injektioner. Dette nummer opnår en god balance mellem antallet af runder af injektioner og embryonerne acceptable eksponering for lys. Som begge i cytoplasmatisk og pronuclear membraner i hamster embryoner er ganske fleksibel, skal væsentlig kraft anvendes til injektion nål til at trænge igennem membranen af pronucleus. I løbet af denne tid, skal pronuclei forblive inden for den brændvidde.
Forskere bør overveje de følgende kirurgiske emner, når du udfører embryo overførsler. For det første er det vigtigt at snit gennem kroppen væggen svarer til kropsstørrelse af dyret. Hvis indsnittet er for lille, kan det resultere i ekstrudering af zygotes fra oviduct ved returnering forplantningsorganerne til maven. Ud over indsnit størrelse, kan potentialet for ekstrudering af zygotes fra ovidukten minimeres ved håndtering af de tilknyttede fedt pad i stedet for den reproduktive væv korrekt. Med hensyn til snit størrelse er det også vigtigt at overveje at større indsnit kan påføre dyret mere stress og udviser en højere sandsynlighed for komplikationer (fx infektion opspringning). For det andet, for at minimere blødning, forskere skal passe for at undgå incising store blodkar, når adgang til maven, fordi overskydende blodtab kan øge kirurgi stress for at reducere succesen af ægoplægning, og udvide restitutionstid
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ZW har økonomiske interesser i Auratus Bio, LLC., en bioteknologivirksomhed specialiseret i at skabe genetisk manipuleret dyrene biomedicinsk forskning og landbrugs-programmer.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af den nationale institutter for allergi og smitsomme sygdomme (NIAID) af National Institutes of Health under award nummer 1R41OD021979 (til ZW) og af en forskning tilskud fra næste generations BioGreen 21 Program, Republikken Korea, give nr. PJ01107704 (til ZW) og give nr. PJ01107703 (til IK). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health eller BioGreen 21. Vi takker Dr. Nikolas Robl redigeringsværktøjer håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μg/μL (~6.1 μM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
