Summary
Man (PN) Injektion von den gruppierten dazwischen regelmäßig kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) und CRISPR-assoziierten Protein-9 Nuklease (CRISPR/Cas9) System ist ein hocheffizientes Verfahren zur Herstellung gentechnisch veränderter syrischen Goldhamster. Hier beschreiben wir die detaillierte PN Injektion Protokoll zur Herstellung von gen-Knockout-Hamster mit dem CRISPR/Cas9-System.
Abstract
Die man (PN) Injektionstechnik entstand zuerst bei Mäusen, fremden genetischen Materials in die Vorkerne von einzelligen Embryonen einzuführen. Die eingebrachte genetische Material kann das embryonale Genom integrieren und transgene Tiere zu erzeugen, mit fremden genetischen Information nach der Übertragung der injizierten Embryonen um Mütter zu fördern. Nach dem Erfolg bei Mäusen hat PN Injektion erfolgreich bei vielen anderen Tierarten angewendet. Vor kurzem, PN Injektion erfolgreich eingesetzte Reagenzien mit gen-modifizierende einzuführen Aktivitäten wie das CRISPR/Cas9 System, ortsspezifische Genveränderungen in mehreren Labors und Tierarten auf dem Bauernhof. Neben der Beherrschung der Sonderserie der Mikroinjektion Fähigkeiten genetisch veränderter Tiere per PN Injektion zu produzieren, müssen Forscher die Reproduktion Physiologie und das Verhalten der Zielarten, verstehen, weil jede Art einzigartig präsentiert Herausforderungen. Z. B. syrischen Goldhamster Embryonen haben einzigartige Anforderungen in-vitro- Handhabung, so dass PN Injektionstechniken bis neue Durchbrüche von unserer Fraktion nicht möglich in dieser Art waren. Mit unserer Spezies modifiziert PN Injektion Protokoll ist es uns gelungen in der Produktion mehrere gen Knockout (KO) und Profi (KI) Hamster, die zu Modell menschlicher Krankheiten erfolgreich eingesetzt werden. Hier beschreiben wir die PN-Injektion für die Zustellung der CRISPR/Cas9-Komplex an die Zygoten der Hamster, der Embryo Handhabung, Embryo-Transfer-Verfahren und Tierhaltung müssen genetisch geändert Hamster.
Introduction
Die syrischen Goldhamster (Mesocricetus Auratus) ist eines der am weitesten verbreitete Nagetiere für die biomedizinische Forschung. Nach dem US Department of Agriculture wurden ungefähr 100.000 Hamster in den Vereinigten Staaten im Jahr 2015, was 13 % der gesamten Labor tierische Nutzung unter dem Tierschutzgesetz (Http://www.aphis.usda.gov; zugegriffen fallenden Arten verwendet. 10. März 2017).
Der Hamster bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Nagetieren in der Studie eine Reihe von Krankheiten beim Menschen. Zum Beispiel die Histopathologie von N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) induzierte pankreatischen duktalen Adenokarzinome in Hamster ähnelt menschlichen Tumoren der Bauchspeicheldrüse, während BOP Behandlung vor allem Schilddrüse Tumoren bei Ratten und Lunge und Tumoren in der Leber induziert Mäuse-1. Da Hamster das nur kleine Nagetier gefunden, um die Replikation von Adenoviren unterstützen, sind sie auch das Modell der Wahl zu Testzwecken onkolytische Adenoviren-basierte Vektoren und Anti-Adenovirus Drogen2,3,4. Ein weiteres Beispiel, wobei das Hamster-Modell einen Vorteil gegenüber Mäusen und Ratten bietet, ist in der Studie von Hyperlipidämie. Menschen und Hamster weisen große Ähnlichkeiten in Lipid Stoffwechselwege und beide Arten tragen das Gen Kodierung Cholesteryl Ester-Transfer-Protein (CETP), das spielt eine zentrale Rolle in Lipid, Stoffwechsel, während CETP ist abwesend bei Mäusen und Ratten5. Darüber hinaus entwickeln Hamster repräsentativer für die menschliche Manifestation nach Exposition gegenüber Ebola-Virus6Hämorrhagische Krankheit. Hamster sind auch die Modelle der Wahl für Atherosklerose7, orale Karzinome8und entzündliche Myopathien9zu studieren. Vor kurzem wurde auch nachgewiesen, dass Hamster sehr anfällig für Virus-Infektion Anden sind und Hantavirus-Syndrom-ähnliche Lungenerkrankung, die nur Nagetier Modell der Anden Virus Infektion10zu entwickeln.
Bewältigung der ungedeckten Bedarf für neuartige genetische Tiermodellen, die Krankheiten des Menschen zu studieren, wo keine zuverlässige kleines Nagetier-Modell zur Verfügung steht, die wir vor kurzem gelungen, das CRISPR/Cas9 System anwenden, um den Hamster und haben mehrere Linien der gentechnisch hergestellt Hamster-11entwickelt. Hamster Zygoten reagieren empfindlich auf ökologischen Milieus, so dass die PN Injektion Protokolle entwickelt, bei anderen Spezies nicht geeignet sind. Daher entwickelten wir ein PN-Injektion-Protokoll für die Hamster, der die speziellen Anforderungen für den Umgang mit Hamster Embryonen in Vitrobeherbergt. Hier beschreiben wir die detaillierte PN-Injektion mit der CRISPR/Cas9-System und die dazugehörigen Schritte, von der Vorbereitung der einzelnen Führer RNA (SgRNA) zum Transfer von Embryonen injiziert in Empfänger Weibchen.
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Protocol
In diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Utah State University (IACUC Protokoll: 2484). Hamster in diesem Protokoll verwendeten sind Erwachsene (6-10 Wochen alt) LVG belasten syrischen Goldhamster. Alle Hamster sind in das Vivarium im Bioinnovation Center, Utah State University untergebracht. Raumtemperatur bei 23 ° C, Luftfeuchtigkeit bei 40-50 % eingestellt ist, und Licht-Zyklus ist festgelegt 14:00 (Licht: dunkel). Wann immer möglich, sollte Embryo Manipulation und Surugical Verfahren mit sterile Techniken durchgeführt werden.
(1) SgRNA und Cas9/SgRNA Ribonucleoproteins (RNP) Vorbereitung
- SgRNAs nach der in-vitro- Transkription beschriebenen Verfahren in der Bedienungsanleitung des Synthese-Kit (Materialtabelle, Supplement 1) zu synthetisieren.
- Ribonucleoproteins zusammensetzen, 2 µg Cas9 mit 1 µg der SgRNA mischen und die Mischung bei Raumtemperatur für 10-15 min inkubieren. Injektionslösung PN machen Sie eine funktionierende Lösung bei der Konzentration von 100 ng/µL Cas9 und 50 ng/µL SgRNA mit 10 mM-TE-Puffer (RNase frei, Materialtabelle).
(2) Vasektomie Vorbereitung
Hinweis: Vasektomie erfolgt auf männliche Hamster im Alter 6-8 Wochen. Die Operation sollte 10-14 Tage vor der ersten Paarung durchgeführt werden. Sterilität wird durch fehlgeschlagene Schwangerschaften aus Verpaarung mit fruchtbaren Frauen bestätigt. Vasektomierten Männer können normalerweise verwendet werden, für ein Jahr, bevor sie weniger sexuell aktiv werden.
- Männchen von intraperitoneal (i.p.) Injektion von Ketamin/Xylazin mit einer Dosis von 40 mg/kg (Ketamin) und 10 mg/kg (Xylazin) zu betäuben. Betäubung durch Mangel an einem Pedal Reflex (Zehe Prise) bestätigen.
- Legen Sie sedierten Hamster im dorsalen liegen auf einem trockenen Papiertuch. Spülen Sie den Bauch mit drei Runden der antiseptischen Behandlungen durch abwechselnde chirurgische schrubben Lösungen zwischen 70 % Alkohol und Povidon-Jod.
- Machen Sie einen vertikalen Schnitt mit Chirurgische Scheren ab 1,5 cm kranial an der Vorhaut reicht 1 cm an jeder Seite von Mittellinie (Abbildung 1a). Einschneiden der Haut, Unterhaut und Linea Alba auf den peritonealen Raum (Abbildung 1 b) zugreifen.
- Üben Sie sanften Druck auf den kaudalen Aspekt der Hodensack die Hoden und Fettgewebe heraus zu zwingen. Greifen Sie die Samenleiter vorsichtig mit einer Pinzette und trennen Sie vorsichtig das Blutgefäß aus der Vas mit einer zweiten Zange (Abb. 1 c).
- Halten Sie die Samenleiter mit Zange, eine Schleife zu bilden. Erhitzen Sie die Spitze des anderen Zangen in Flamme, bis er rot ist, und dann verwenden Sie, um die Schleife der Samenleiter zu entfernen. Einfügen von Fettgewebe und Hoden zurück zum Bauch. Der Samenleiter auf der gegenüberliegenden Seite mit dem gleichen Verfahren zu entfernen.
- Naht der Muskulatur zunächst gefolgt durch Vernähen der Haut. Legen Sie das Tier auf einer warmen Unterlage in einem Käfig für 30 min, bis das Tier erholt sich. Beobachten Sie das Tier, bis es normalen Aktivität wieder aufnimmt.
(3) Empfängerin/Hamster Vorbereitung Zeitplan
- Überwachen und aufzeichnen Estrous Zyklen.
Hinweis: Weibliche Hamster haben einen stabile 4-Tage Estrous Zyklus, der sofort nach der Entbindung erhalten bleibt. Frauen am ersten Tag des estrous können durch die undurchsichtig, gelblich und klebrigen Ausfluss (Abbildung 2a) identifiziert werden. Weibchen am 4. Tag des estrous können durch den durchsichtigen, klebrigen Schleim (Abb. 2 b) identifiziert werden. - Für Superovulation Spender Hamster, superovulate die geschlechtsreifen Weibchen (> 6 Wochen) am ersten Tag des Estrous Zyklus durch IP-Injektion von trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG; aufgelöst in PBS als 50 IU/mL) (Tabelle 1) zwischen 9 und 12 Uhr.
Hinweis: PMSG ist zur Induktion Superovulation aber nicht für die Synchronisierung Estrous Zyklus. - 80 - 84 h nach Injektion von PMSG (Tag 4, 6-8 Uhr), legen die Weibchen in Käfigen mit Männchen zur Paarung. Gewährleisten Sie Hamster, die Paarungen nicht Kopulation führen Stecker, erfolgreiche Paarungen durch die Beobachtung der Paarungen.
- Bereiten Sie pseudopregnant Weibchen bei der Paarung geschlechtsreifen Weibchen am 4. Tag des estrous mit vasektomierten Männer vor. Der Zeitplan für die Zubereitung von Spender und Empfänger Weibchen sind in Tabelle 2dargestellt.
Hinweis: Wahre trächtige Weibchen können auch verwendet werden, als Empfänger, d. h., Weibchen mit einer Fellfarbe von der goldenen Farbe mattiert mit der gleichen Farbe fruchtbaren Männchen zu unterscheiden. Welpen aus Embryotransfer abgeleitet können anhand der Fellfarbe identifiziert werden. Ein potenzieller Vorteil bei der Verwendung echter trächtige Weibchen ist, dass endogen produzierte Embryonen erfolgreiche Schwangerschaften gewährleisten und PN injiziert Embryonen zu implantieren helfen würde; ein potenzieller Nachteil wahre trächtige Weibchen als Empfänger zu verwenden ist, dass PN injiziert Embryonen mit endogen konkurrieren müssen Embryonen produziert.
(4) Zygote Isolation
- Bereiten Sie Kulturmedium (HECM-9; Rezept wird in Ergänzung 2 beschrieben), bereits in McKiernan und Bavister12beschrieben.
- Bereiten Sie einen Tag vor der PN Injektion Zygote Umgang mit Gerichten (25 µL/Drop) und ein PN Injektion Tropfen (100 µL) auf den Deckel einer 35 mm-Teller mit HECM-9 vor. Dann decken Sie die mittlere Tropfen mit Mineralöl. Balance-Medium in einem Inkubator über Nacht unter den folgenden Bedingungen: 37,5 ° C, 10 % CO2, 5 % O2, 85 % N2 und 100 % Luftfeuchtigkeit.
- Am Tag für die PN-Injektion Embryo Spülung Gerichte (1 Teller/Spender Hamster) mit HECM-9 und alle Gerichte im Inkubator bis zu seiner Verwendung zu speichern.
- Einzuschläfern Sie superovulated Hamstern mit CO2.
- Eileiter Isolation
- Legen Sie einen euthanasierten weibliche Hamster in dorsal liegen auf einem chirurgischen drapieren oder Seidenpapier und bereiten Sie den Bauch mit einem 70 % Ethanol Spray.
- Fest halten Sie Haut und Bauchmuskulatur Schicht an der Mittellinie und machen Sie einen Einschnitt. Einzuschneiden Sie das Bauchfell, die Bauchorgane aussetzen.
- Erfassen Sie eines uterinen Hörner mit einer feinen Pinzette aus- und einfahren Sie des Gewebes aus dem Bauch. Trennen Sie die Gebärmutter aus dem Gewebe handelt und Fett. Machen Sie einen Schnitt zwischen Eileiter und Eierstock und einen zweiten Schnitt angrenzend an der Kreuzung der Eileiter und Gebärmutter (enthalten einen kleinen Teil der Gebärmutter). Platzieren Sie die beiden Eileiter in der Tonschüssel bündig.
- Spülen und sammeln von Zygoten
- Unter dem Mikroskop Dissektion die Seite des uterinen Horn mit einem #5 Dumont Pinzetten erfassen und hausgemachte Nadel (Abbildung 3) in das Lumen des Eileiters aus dem infundibular Ende und spülen die Eileiter mit 300-400 µL Medium HECM-9.
- Sammeln Sie die Zygoten sofort und waschen Sie sie zweimal mit HECM-9 Medium in der Handhabung-Schale. In diesem Stadium der Entwicklung sollten alle die Zygoten von Kumuluszellen entblößt.
- Legen Sie die Zygoten in einem Inkubator (37,5 ° C, 10 % CO2, 5 % O2, 85 % N2 und 100 % Luftfeuchtigkeit) sofort nach der Entnahme, Lichteinfall zu minimieren.
(5) PN Injektion
- Tauen Sie Cas9/SgRNA RNP auf Eis auf und pflegen Sie die Anlage auf dem Eis während des gesamten Prozesses der PN-Injektion.
- Laden Sie die Injektionsnadeln mit Cas9/SgRNA RNP Lösung unmittelbar vor der Injektion Experimente. Legen Sie das hintere Ende der Injektionsnadeln in das Rohr mit der Cas9/SgRNA RNP-Lösung und lassen Sie die Cas9/SgRNA RNP-Lösung, die Nadel durch Kapillarwirkung zu füllen.
- Bereiten Sie die Injektion Gericht und Nadeln. Füllen Sie die Inhaber-Pipette mit Mineralöl, ~ 3 mm vor der Kurve der Halter Nadel. Bringen Sie die Halterung in die Microinjector mit der Spitze der Nadel horizontal zum Boden der Schale und füllen Sie die Spitze der Nadel mit Medium durch Absaugen. Legen Sie die Injektionsnadel in einem Winkel von 10-15° gegenüber Halter.
- PN-Injektion
- Eine Zygote zu identifizieren und eine feine Absaugung mit der Halterung Nadel anwenden. Idealerweise sind die männlichen und weiblichen Vorkerne innerhalb der gleichen Brennweitenbereich und Parallel ausgerichteten Inhaber.
- Dringen Sie in die Zona und männliche Vorkerne (03:00-Position) mit der Injektionsnadel.
- Zurückzuziehen Sie die Injektionsnadel schnell, sobald die Vorkern zu verhindern, dass den Kern festhalten an der Nadel und zur Vermeidung von Schäden die Pronukleus schwillt.
6. Zygoten-Transfer zum Pseudopregnant Hamster
- Betäuben Sie einen pseudopregnant Hamster (die gleiche Art und Weise, wie beschrieben im Abschnitt Vasektomie) zu, und legen Sie ihn auf eine chirurgische drapieren oder trockene Seidenpapier im ventralen liegen.
- Gelten Sie Auge Schmierstoffe für die Augen des Tieres zu verhindern Augentrockenheit und bedecken den Kopf mit einem Tuch oder Papier, die Augen vor Licht zu schützen. Vorbereiten der lateralen Seite des Körpers durch das Rasieren ein ca. 4 cm x 4 cm Hautareal auf jeder Seite des Körpers, gefolgt von 3 Mal von Povidon-Jod-Peelings und 3 mal 70 % Ethanol Peelings anwenden. Nehmen Sie einen 2 cm vertikalen Schnitt 2 cm kaudalen an der letzten Rippe (siehe Abbildungen 4a, 4 b) auf jeder Seite des Rückens des Tieres.
- Greifen Sie die Fettpolster mit Zange und ziehen Sie, bis die Eileiter und Gebärmutter sichtbar sind. Klemmen Sie die Fettpolster mit einer Futterzange und reflektieren Sie die Fettlappen dorsal über der Wirbelsäule (Abb. 4 c). Positionieren Sie die Fortpflanzungsorgane so, dass die Gebärmutter Röhre mit einem 30 Gauge-Nadel für den Embryotransfer (Abbildung 4D) durchdrungen werden kann.
- Waschen Sie die injizierten Zygoten mit HECM-9 in ein neues Gericht. Verwenden Sie eine neue Glaspipette (Durchmesser: ~ 150-200 µm), 10-15 Zygoten zu laden. Ordnen Sie die Zygoten, als eine Kette von Perlen, gefolgt von mehreren Luftblasen. Legen Sie die Pipette in die offene eingedrungen Röhre aus Schritt 6.3 und sanft pusten in die Pipette die Zygoten in die Eileiter übertragen. Weiter bläst, bis die erste Luftblase in den Eileiter Trakt (Abb. 4e) freigesetzt wird.
- Lassen Sie die Fettpolster und das Gewebe auf den Bauch zurück. Übertragen Sie ungefähr die gleiche Anzahl (10-15) injizierten Embryonen zu einem anderen Eileiter-Darm-Trakt durch die gleichen Prozesse.
- Naht der Muskulatur und der Haut in 2 Schichten. Buprenorphin-HCL (0,5 mg/kg) subkutan als postoperative Analgesie zu verwalten. Den Hamster in einen Käfig zurück und legen Sie den Käfig auf einer warmen Unterlage für die Wiederherstellung. Den Käfig den Tierraum zurück, wenn das Tier aus der Narkose vollständig wiederhergestellt ist. Post-Op Analgetika sind wieder sechs Stunden später gegeben.
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Representative Results
Die Effizienz des beschriebenen Protokolls in der Herstellung genetisch veränderter Hamster hängt die Ergebnisse der folgenden zwei kritische Schritte: die Live Geburtenrate der Empfänger Weibchen und die Zahl der live Welpen mit der beabsichtigten gentechnische Veränderungen. Die Live-Geburtenrate ist eine direkte Ergebnisse der Embryo Qualität und die Fähigkeit des Individuums, die Durchführung der PN-Injektion und Embryo-Transfer-Verfahren. Um sicherzustellen, dass das Entwicklungspotenzial von manipulierten Embryonen nicht beeinträchtigt wird, ist großer Sorgfalt bei der in-vitro- Handhabung der Hamster Embryonen notwendig. Wir erzielen regelmäßig eine Lebendgeburt Rate von 60-80 % mit pseudopregnant Empfänger Weibchen. Tabelle 3 zeigt Phasengeburtenziffern aus dem RAG1 Ko-Experiment (pseudopregnant Weibchen verwendet wurden) und STAT2 Ko-Experiment (wahre schwangere schwarze Frauen dienten; Live Geburtenrate in diesem Fall berechnet wurde, als die Prozentsatz der Würfe produziert golden Welpen).
Der Prozentsatz von gentechnisch veränderten Welpen aus PN injiziert Embryonen produziert hängt sowohl die Effizienz der SgRNA bei der Einführung Indels und die erfolgreiche Injektion von Cas9/SgRNA Ribonucleoproteins in die Vorkerne. Wir fanden, dass SgRNA Effizienz unter gen Zielen (unveröffentlichte Beobachtungen) variiert. Wie aus Tabelle 3hervorgeht, führte die SgRNA für STAT2 entwickelt ein Gene targeting-Wirkungsgrad von 88,9 %, während die SgRNA für RAG1 nur 28,6 % effizient war. Abbildung 5 stellt ein Beispiel für die Genotypisierung ergibt sich aus einer PCR Beschränkung Fragment Länge Polymorphie (PCR-RFLP) Assay Welpen vom RAG1 Gene targeting. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Indels außerhalb der Restriktionsenzym Erkennungssequenz auftreten können, so dass PCR-RFLP die Gene targeting-Effizienz unterschätzen kann. Die PCR-Produkte in TA Klonen Vektoren subcloning gefolgt von Sanger-Sequenzierung der PCR Einsätze sind notwendig, genau Maß Gene targeting-Effizienz und die Art der Indels offenbaren.
Abbildung 1: Männliche Hamster Vasektomie.
(a) und (b) ein 2 cm vertikale Einschnitt ab 1,5 cm kranial an der Vorhaut verlängern cranially; c) trennen die Vas Ehrerbietung, die zugehörigen Hoden Vene und Arterie mit zwei Paaren der Zange; d) erfassen der Samenleiter mit einer Pinzette, eine 1 cm Schleife zu bilden. Erhitzen Sie eine zweite Reihe von Zangen und Verbrauchsteuern Sie die Schleife und die Enden gleichzeitig Heilkünsten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Estrous Zyklus.
(a) der Ausfluss beobachtet am 1. Tag ist undurchsichtig, gelblich und klebrig b) den Ausfluss zu beobachten am 4. Tag ist klar und klebrig. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Vorbereitung der Nadel Embryo isoliert.
ein) Bruch eine 30 Gauge-Nadel entlang der roten Linie und Polieren die Spitze, bis es flach und glatt ist. b) bilden einen Winkel von 30-40 ° bei ~ 3 mm von der Spitze. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Zygote Transfer.
(a) und (b) machen einen 2 cm langen vertikalen Schnitt ab 2 cm kaudalen der letzten Rippe (rote Linie); c) die Fettpolster mit einer Futterzange spannen und spiegeln das Gewebe dorsal; d) passen Sie die Position des Eileiters Trakt und dringen in eine offene mit einem 30 Gauge-Nadel; e) ordnen die Zygoten als eine Kette von Perlen im Embryo Transfer Glas pipette und von eingedrungen offen in die Eileiter übertragen. Bar = 1, 000 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. PCR-RFLP-Assay von einem einzigen Wurf von Gründer Tiere mit RAG1 Indels. M: 1 Kb Plus Leiter. WT: Wildtyp. ID-1, 3 und 7 uncut Showband RAG1 Indels entsprechen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Gewicht (g) | PMSG (IU) | PMSG (Ul) |
| < 110 | 10 | 200 |
| 110-135 | 15 | 300 |
| 135-160 | 20 | 400 |
| 160-185 | 25 | 500 |
| > 185 | 30 | 600 |
| PMSG, trächtige Stute Serum gonadatropin | ||
Tabelle 1. PMSG tut, Körpergewicht entspricht
| Hamster | Tag1 | Tag2 | Tag3 | Tag 4 | Tag 5 |
| Spender | PMSG (9-12 Uhr) | Paarung (6-20:00) | Zygote Isolierung (12-13:00) | ||
| PN-Injektion (1-15:00) | |||||
| Empfänger | Paarung (6-20:00) | Embryo-Transfer (3-17:00) |
Tabelle 2. Zeitplan der Empfängerin/Vorbereitung
| Gene | Nein. Embryonen (Welpen) | Nein. Würfe (Empfänger) | Nein. Positiven Welpen (%) |
| STAT2 | 229 (54) | 14 (19) * | 48 (88,9) |
| RAG1 | 77 (21) | 3 (3) | 6 (28,6) |
| * mattiert mit fruchtbaren Männchen Weibchen dienten; die Anzahl der Würfe angegeben ist nur diese produzierten golden Welpen. | |||
Tabelle 3. Effizienz des Gene Targeting in syrischen Goldhamster vom Cas9/SgRNA-System
| Zustand/Handling | Anforderungen | Kommentare |
| Umgebungslicht | Schalten Sie alle Umgebungslicht | Hamster Embryonen sind empfindlich gegen Licht, vor allem, um Licht zu kühlen |
| Licht bei der in-vitro-Handhabung | Weniger als 20 min für PN-Injektion | Manipulieren von 15 Embryonen pro Runde, um die Belichtung zu verringern |
| Temperatur | Umgebungstemperatur: 28±0.5 oC | Hamster-Embryonen reagieren empfindlich auf Temperaturschwankungen |
| Umgang mit Temperatur: 37,5 oC | ||
| Medium | HECM-9 | Lagern Sie nicht mehr als 3 Tage |
| Kultur-Zustand | 37,5 oC, 10 % CO2, 5 % O2 und 100 % Luftfeuchtigkeit | Über Nacht im Brutschrank ausgeglichen |
| Tierhaltung nach Embryotransfer | Nicht Käfig innerhalb von 5 Tagen vor/nach pflichtgemäßem Ermessen ändern Datum | Empfänger werden Welpen gestört ausschlachten; sorgen Sie für genügend Futter/Wasser |
Tabelle 4. Einzigartige Anforderungen an Hamster Embryo Handling und Tierhaltung
Supplement 1: SgRNA GeneArt Präzision Synthese Kit synthetisieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzung 2: Hamster Embryo Kulturmedium-9 (HECM-9) Rezept. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Um das Potenzial der syrischen Goldhamster als Modelle für menschliche Krankheiten besser zu nutzen, entwickelten wir ein PN-Injektion-Protokoll für die Bereitstellung einer CRISPR/Cas9 Komplex um das Genom Hamster ausgerichtet. Das PN-Injektion-Protokoll optimiert mehrere entscheidende Variablen einschließlich der Embryo Kulturmedium, Temperatur und Wellenlängen von Licht13. Auch gibt es mehrere Hamster-spezifischen tierischen Umgang mit Verfahren, die für erfolgreiche Umsetzung gen gezielt in den Hamster folgen müssen. Zum Beispiel haben sexuell Reife weibliche Hamster stabile 4-Tages Estrous Zyklen, die mit exogenen Hormone (z.B. PMSG) synchronisiert werden kann. So genau verfolgen die Estrous Zyklen der jedes Weibchen ist wichtig für Superovulation und Scheinträchtigkeit Vorbereitung. 30 - 60 Zygoten können von einer Frau produziert werden, wenn sie erfolgreich superovulated ist. Um erfolgreiche Superovulation zu erreichen, ist es notwendig zu prüfen, artspezifische Ablagerung von Fett. Weibliche Hamster, insbesondere diejenigen über 12 Wochen alt sind, neigen dazu, übermäßiges Bauchfett haben, so dass die Spritzennadel richtig positioniert werden, muss um Fettpolster vollständig zu durchdringen, wenn Hormonspritzen durchführen. Wir haben festgestellt, dass halb Eindringen in die Bauchhöhle den entsprechenden Abstand für Hormon-Lieferung erreicht. Wir für Sie die besonderen Anforderungen für PN Injektion, Hamster Handhabung und Tierhaltung in Tabelle 4zusammengefasst.
PN Injektionslösung muss die Anzahl der Embryonen übertragen in die Injektion Schale für jede Runde der Injektion experimentell ermittelt werden, um längere Einspritzzeit zu vermeiden. Je länger die Zeit bleiben die Embryonen in die Schüssel, desto größer die Chance, die sie Überbelichtung Licht erleben. Es wird empfohlen, ca. 15 Embryonen auf die Injektion Gericht für jede Runde von Injektionen zu übertragen. Diese Zahl erreicht ein gutes Gleichgewicht zwischen der Anzahl der Runden von Injektionen und die tolerierbare der Embryonen Lichteinfall. Da sowohl der zytoplasmatischen und man Membranen von Hamster Embryonen sehr flexibel sind, muss erhebliche Kraft auf der Injektionsnadel zu durchdringen die Membran der Pronukleus angewendet werden. Während dieser Zeit müssen die Vorkerne den Brennweitenbereich.
Forscher sollten die folgenden chirurgischen Probleme beim Embryotransfer durchführen. Erstens ist es wichtig, dass die Einschnitte durch die Körperwand der Körpergröße des Tieres entsprechen. Wenn der Schnitt zu klein ist, kann es in der Extrusion von Zygoten vom Eileiter führen, wenn die Fortpflanzungsorgane in den Bauch zurück. Neben der Schnitt Größe kann das Potenzial für die Extrusion von Zygoten aus der Eileiter durch den Umgang mit der damit verbundenen Fettlappen anstatt der richtigen reproduktives Gewebe minimiert werden. In Bezug auf Schnitt Größe ist es auch wichtig zu bedenken, dass größere Einschnitte können dazu führen, mehr Stress für dem Tier dass und eine höhere Wahrscheinlichkeit von Komplikationen (z. B. Infektionen Dehiszenz weisen). Zweitens zur Minimierung von Blutungen, sollten Forscher darauf achten, vermeiden Eingrabung großen Blutgefäße beim Zugriff auf den Bauch, weil überschüssige Blutverlust kann Chirurgie Stress zu reduzieren Sie den Erfolg der Embryo-Transfer zu erhöhen und verlängern die Recovery-Zeit
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Disclosures
ZW hat finanzielle Interessen in Auratus Bio, LLC., ein Biotechnologieunternehmen spezialisiert auf gentechnisch veränderte Tiere für biomedizinische Forschung und landwirtschaftliche Anwendungen erstellen.
Acknowledgments
Forschung, die in dieser Publikation berichtet wurde vom National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) von den National Institutes of Health unter Nummer 1R41OD021979 Award (für ZW) und ein Forschungsstipendium von der nächsten Generation BioGreen 21 unterstützt. Programm, Republik Korea, gewähren keine. PJ01107704 (zu ZW) und Nein zu gewähren. PJ01107703 (zu IK). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health oder BioGreen 21. Wir danken Dr. Nikolas Robl für das Manuskript zu bearbeiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μg/μL (~6.1 μM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
