Summary
מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הפרוטוקול וזמינותו גרורות בריאות (פומה). מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד אוסטאוסרקומה גרורתי (OS) גידול תאים של רקמת הריאה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.
Abstract
גרורות בריאות וזמינותו (פומה) הוא שמחוץ ריאות explant מערכת התרבות תאים סגורים שמקנה לחוקרים ללמוד את הביולוגיה של כיבוש ריאות אוסטאוסרקומה (OS) על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מאמר זה מספק תיאור מפורט של הפרוטוקול ודן דוגמאות של קבלת נתוני תמונה על גידול גרורתי באמצעות widefield או פלטפורמות מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. הגמישות של המודל פומה שמקנה לחוקרים ללמוד לא רק את הצמיחה של תאים OS microenvironment הריאה, אלא גם כדי להעריך את ההשפעות של הרפוי אנטי גרורתי לאורך זמן. מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשר הדמיה חסרת תקדים, ברזולוציה גבוהה של מערכת ההפעלה תא אינטראקציות עם parenchyma הריאה. יתר על כן, כאשר המודל פומה משולב עם צבעי פלורסנט או כתבים גנטי חלבון פלואורסצנטי, חוקרים יכולים ללמוד את microenvironment הריאה, מבנים הסלולר subcellular, תפקוד הגן, יזם פעילות בתאים OS גרורתי. המודל פומה מספק כלי חדש עבור אוסטאוסרקומה חוקרים לגלות ביולוגיה גרורות חדשות, להעריך את הפעילות של טיפולים אנטי גרורתי, ממוקד.
Introduction
תוצאות משופרות עבור ילדים חולים עם גרורות אוסטאוסרקומה (OS) נשאר עדיין צורך קליני קריטי 1. זה מדגיש את החשיבות של לפתח טיפולים חדשים ממוקדות מולקולרי. Chemotherapeutics המקובלת כי התפשטות תאים סרטניים היעד לא הוכיחו להיות יעיל בטיפול במחלה גרורתית, ובכך אסטרטגיות הרומן חייב לכוון תהליך גרורתי עצמו 2. המאמר הנוכחי דן בהיבטים של סוג חדש יחסית של ex-vivo מודל ריאות גרורות, וזמינותו גרורות בריאות (פומה) שפותחה על ידי מנדוזה ועמיתיו3, אשר מספק כלי שימושי גילוי חדש מנהלי התקנים מולקולריים בהתקדמות גרורות ריאה OS 4,5. לפני שתמשיך, עם זאת, יהיה נבון. לגעת בקצרה על מספר המודלים הנוכחיים של גרורות, מבחני איך המודל פומה מציעה מספר יתרונות על-קונבנציונאלי במבחנה .
ביותר ניסיוניות המשמשות ללימוד גרורות המרכיבים של מערכות במבחנה , ויוו מסכם את הדברים צעד מסוים או מספר שלבים של המפל גרורתי. השלבים הבאים כוללים: תאים סרטניים 1) מעביר הגידול העיקרי, 2) intravasation לתוך כלי הסמוך (הדם או הלימפה), המעבר בתוך מחזור הדם, 3) לעצור באתר משני, 4) extravasation ו הישרדות באתר משני, היווצרות 5) של micrometastases, ו- 6) הצמיחה לתוך vascularized גרורות (איור 1). במבחנה מודלים של גרורות ניתן לכלול העברה (2D) 2-ממדי, תלת-ממדי (3D) Matrigel הפלישה מבחני אשר נבדקות ב פירוט במקום 6. עבור מודלים ויוו , לכלול שתי המערכות מודל נפוץ: 1) דגם גרורות ספונטני הוא איפה תאים סרטניים orthotopically מוזרק לתוך סוג רקמות ספציפיות כדי בצורת גידול מקומי אשר באופן ספונטני משיל תאים גרורתי לאתרים מרוחקים; 2) דגם ניסיוני גרורות הוא שבו תאים סרטניים מוזרקים לתוך כלי הדם במעלה הזרם של האיבר היעד. לדוגמה, זנב הווריד הזרקה של תאי הגידול בתוצאות פיתוח ריאות גרורות5,7,8. דגמים אחרים גרורה ניסיוני כוללים הזרקה של תאים סרטניים לתוך הטחול או וריד מצע המעי העליון אשר גורמת להתפתחות גרורות בכבד9,10. שיקולים מעשיים של מודלים אלה ויוו נדונים בפירוט על ידי ולש 11. עוד ויוו דגם המשמשות ללימוד גרורות ב סרקומות של ילדים הוא המודל השרשה הגידול subcapsular כליה כליות שתוצאתה היווצרות הגידול המקומי, גרורות ספונטנית הריאות 12,13. טכניקה יותר מבחינה טכנית תובעניים כגון intravital videomicroscopy יכול ישירות להמחיש, בזמן אמת, אינטראקציות בין תאי סרטן גרורתי של microvasculature של אתר גרורתי (כלומר. הריאות או הכבד) כפי שתואר על ידי מקדונלד14 Entenberg15, או סרטן extravasation תא ממברנה chorioallantoic כפי שמתואר על ידי קים 16.
המודל הפומה הוא ex-vivo, explant רקמת הריאה, מערכת תרבות סגורה איפה הצמיחה של תאים סרטניים פלורסנט יכול להיות longitudinally שנצפו באמצעות מיקרוסקופ זריחה על פני תקופה של חודש (ראה איור 2 א). מודל זה recapitulates בשלבים הראשונים של הריאה קולוניזציה (שלבים 3 עד 5) בהמפל גרורתי. הם כמה מהיתרונות העיקריים של המודל פומה על-קונבנציונאלי במבחנה מודלים: 1) היא מספקת הזדמנות למדוד longitudinally צמיחת תאים של סרטן גרורתי ב- microenvironment תלת-ממד זה שומר על תכונות רבות של הריאות microenvironment ב ויוו 3; 2) פומה מאפשר החוקר להעריך נוקאאוט של טיפול גנטי או סמים למועמד יש פעילות אנטי-גרורתי בהקשר של microenvironment הריאה תלת-ממד; 3) המודל הפומה הוא גמיש עם סוגים רבים של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ פלטפורמות (איור 2B) כגון widefield קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ או סריקה בלייזר קונפוקלית, דוגמאות של כל אחד מוצגים באיור 2C & D, בהתאמה. במאמר זה נדון כיצד להשתמש במודל של פומה כדי לקבל נתונים הדמיה האורך על גידול גרורתי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) משופרת-המבטאת תאי האדם אוסטאוסרקומה גרורתי גבוה ונמוך (MNNG וזונות תאים, בהתאמה) באמצעות קרינה פלואורסצנטית ההגדלה נמוך widefield. דוגמאות של הדמיה של הפלורסנט אשר תוויות parenchyma הריאה, חלבון אדום-פלורסנט כתב גנטי, אשר מתייג המיטוכונדריה ב OS תאים במודל פומה באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופיה קונפוקלית נדונות גם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים בעלי חיים שממנו התקבלו נתונים הדמיה בוצעו עם אישור של טיפול בעלי חיים, שימוש הוועד של המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות. כל הפרוטוקולים בעלי חיים שנדונו ואת מתוארים במאמר וידאו אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים אוניברסיטת בריטיש קולומביה.
1. הכנה של תאים סרטניים הזרקת וחומרים עבור דגם פומה
הערה: כמות התאים והפתרונות יהיה מספיק בשביל העכבר 1. קנה המידה של הצורך אם עכברים יותר משמשים במחקר. לקבלת מתכונים המדיה, עיין טבלה 1 ו- 2 בטבלה.
- לחמם 5 מ של A-מדיה 15 מ"ל צינור חרוטי באמבט מים 37 oC.
- ממיסים 1.2% נמוך נמס agarose הפתרון (במים סטריליים) באמצעות המיקרוגל מעבדה.
- להעביר 5 מיליליטר agarose מותכת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, לחמם בתוך אמבט מים 37 oC. ודא agarose נמס ב 37 oC ונוזלים לפני השלב insufflation ריאות.
- מראש מקררים 30 מ של התא-תרבות כיתה PBS בתוספת 1 X עט/דלקת בתוך דלי קרח.
- ב טוב אחד של צלחת 6-ובכן, מראש משרים בספוג ג'לטין ב- 1.5 מ של B-מדיה. הספוג יהיה העוגן תמיכה הפרוסות ריאות.
- ודא שהתאים OS כ- 70-90% confluent ביום של ההליך. אל תשתמש תאים שהם confluent יתר או אם התקשורת הוא כתום לצהוב מאז התאים בדרך כלל לחוצה ואני יש פחת הכדאיות בשלב זה. עבור שורות תאים אוסטאוסרקומה, MNNG, זונות, 5 x 105 בנפח של 100 μL ישמש להחדיר לתוך וריד הזנב העכבר 1. יוקרתית בהתאם אם עכברים יותר משמשים לצורך המחקר.
- לקצור את תאי הגידול באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA (3 מ"ל בקבוקון T75 או 2 מ לצלחת תרבות 10 ס מ). כאשר התאים מתחילים להרים את הצלחת, לנטרל טריפסין-EDTA עם מדיה מלאה. ספין למטה תאים ולשטוף פעם תרבית תאים בציון PBS. Resuspend צנפה ב 5 מ של PBS.
- לבצע ספירת תאים על ידי בשיטות הרגילות. . זה הטוב ביותר להפוך התליה תא יותר מאשר מה נדרש למעשה מאז אובדן של השעיה תא לעיתים קרובות מתרחשת במהלך המחט צייר-up, הזרקת נסיונות שנכשלו.
- ביצוע וזמינותו אי-הכללה של Trypan-כחול על מדגם של התליה תא להערכת הכדאיות של התאים. המשך רק אם התא להראות יכולת הקיום של 90% ומעלה.
- להזריק 5 x 105 תאים נפח של 100 μL. כדי להכין עודף של 2 X סכום זה, עונה 1 פרק 106 תאים צריך להיות טוו למטה, resuspended ב 0.2 מ של HBSS.
- מקום התליה תא דלי קרח בעת הכנת העכברים להזרקה.
2. זנב בהזרקה לווריד, ריאות Insufflation
הערה: הסכום של פתרונות ותאים בסעיף זה יהיה מספיק בשביל העכבר 1. קנה המידה של הצורך אם עכברים יותר משמשים במחקר. לקבלת רשימה של חומרים וציוד, כלי ניתוח שימוש בשלבים הבאים, עיין בטבלה 3 ו- 4 בטבלה.
- חמים עכבר הנשי (גיל 6-8 שבועות) תחת מנורת חימום למשך 5 דקות על מנת להפוך את הזנב שלהם הווריד יותר בצואה. עבור תאים K7M2 או K12 מאתר, להשתמש Balb/c עכברים; לשימוש תאים אנושיים של MG63.3, MG63, MNNG, זונות, severe משולבים כשל חיסוני עכברים.
- ודא שהתליה תא הוא אחיד ע י ניעור בעדינות את הצינור. צייר בקפידה את התליה תא לתוך המזרק 1 מ"ל ללא המחט. מכסה המזרק עם 27 להעריך את המחט. ודא שיקוע המחט נמצא באותו צד כמו הסימנים נפח על המחט.
- הצב את העכבר restrainer, לנקות את הזנב עם המחיקה אלכוהול.
- להמשיך לבצע זריקה וריד הזנב ולהזריק את μL 100 של התליה תא. 5 דקות אחרי הזריקה, מקם את העכבר בתוך תא2 CO ולהתחיל את המתת חסד סטנדרטי (כמו חלוקה לרמות על-ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים שלך). נקע בצוואר הרחם אמור לא לשמש כאמצעי המתת חסד מאז ההליך יגרום נזק קנה הנשימה.
- לאחר העכבר הוא מורדמים, להתחיל הכנה של למינארי insufflation של הריאות העכבר עם הפתרון agarose/A-מדיה. בתוך למינארי, כיוונון ופינת עבודה עם הפנקס סטרילי. על גבי משטח זה יהיה מקום שלך בכלים סטיריליים, צנתר הרביעי, הרביעי סיומת set והכבידה זלוף המנגנון (ראה תוספת איור 1).
- מקם את העכבר recumbancy הגבי. עם מספריים קטנות סטרילי, בזהירות לנתח את עצם החזה כדי לחשוף את החזה. לטפל כדי לא לנקב את הריאה מאז פתרון agarose/A-מדיה שישמש insufflate הריאה.
- כאשר לנתח את החזה, לנתח מעבר לים בית החזה משני הצדדים קנה הנשימה. חושפים את קנה הנשימה על ידי לנתח של הרקמות הרכות שמסביב.
- נקרר קנה הנשימה עם צנתר הרביעי מד 20. ברפיון לקשור קשר כירורגי באמצעות תפרים לאללה סטרילי סביב cannulated קנה הנשימה.
- צרף הרחבה הרביעי של קנה הנשימה catheterized מוגדר המזרק 10 מ"ל של המנגנון זלוף הכבידה.
- לשלב טרום ומחוממת 37 oC agarose (5 מ"ל) A-מדיה (5 מ"ל) לתערובת 1:1. יוצקים את הפתרון agarose/A-מדיה נוזלי לתוך המזרק 10 מ"ל של המכשיר זלוף הכבידה. לפני insufflation של הריאות עם פתרון agarose/A-מדיה, להבטיח כי לכל אורכה של ערכת הרחבה יש כבר בשלה עם agarose/A-מדיה, ובכך שלילת בהיסח הדעת insufflation של הריאה דגימות אוויר.
- למלא את הריאה הפתרון agarose/A-מדיה עד הריאות מלא הוא insufflated.
- ברגע הריאות מלא insufflated, הסר את הצינורית, תקשור בחוזקה הקשר כירורגית למניעת דליפה של הפתרון agarase/A-מדיה דרך קנה הנשימה.
- המשך שווייץ התעוזה (קנה הנשימה, הלב והריאות) מ בחלל החזה. לדאוג לא לנקב או נזק המשטח של הריאה.
- המקום התעוזה (בללא כיוון מסוים) ב- mL 30 מראש צוננת של PBS בתוספת עט X 1/דלקת, ולאפשר agarose/A-התקשורת לגבש כעשרים דקות.
- באמצעות מספריים בסדר, פינצטה, לחתוך חתיכות קטנות של הריאות (3 מ"מ x 1.5 מ"מ), כפי שמוצג באיור 1A. לפרוסות דקות ריאות יכול בקלות לדימות באמצעות מטרה X 2.5. פרוסות מרובות ניתן לחתוך לכל תנאי הניסוי, בדרך כלל 4-10 פרוסות לכל קבוצה.
הערה: עבור כל קבוצה ניסיונית, מניחים את פרוסות ריאות לבאר נפרד (6-ובכן צלחת) המכיל בספוג ג'לטין 2 x 2 ס"מ מראש טבולים ב'-מדיה. כמות מדיה לכל טוב צריך להיות 1.5 מ. לשנות את המדיה כל 2-3 ימים. ללימודים סמים, התדירות של שינוי המדיה/התרופה הוא משתמש נקבע.
3. Widefield זריחה הדמיה של הריאה פרוסות וניתוח
הערה: עבור זריחה widefield פרוסות הדמיה, קטן יותר, נחתכים (3 מ מ x 1.5 מ"מ x 1 מ"מ) על מנת להתאים את המקטע ריאות 1 תמונה באמצעות מטרה X 2.5.
ייבוא תמונות במיקרוסקופ זריחה widefield:
- בדרך כלל עם תמונה ריאות פרוסות-0, 3, 7 ו- 14 ימים לאחר ההזרקה. בסביבה סטרילית של הקבינט ביולוגי, בזהירות להעביר את הפרוסות ריאות של הג'לטין ספוגים כדי זכוכית סטריליים 35 מ מתחתון סביב צלחת. . שמור על עצמך אנגב את הנוזל העודף מן הפרוסה ריאות כמו עודפי הנוזלים כמראה, משקפים אור ניאון מגיע לתאי הגידול.
- לסדר את פרוסות הריאה באופן דומה מתואר באיור 1A. כל עמודה מייצגים תנאי הניסוי שונה. לטפל כדי לא לחצות-לזהם את הריאות עם הפינצטה. לשטוף עם 70% אתנול ויבש לפני טיפול ריאות פרוסות מקבוצת נסיוני נוסף.
- למטב את הפרמטרים הדמיה (כלומר. רווח, היסט, חשיפה זמן, binning) המספקת את הניגודיות הטובה ביותר בין תאים סרטניים פלורסנט רקמת הריאה הרקע של הפקד (הרכב לא מטופל) קבוצה. השתמש באותם פרמטרים מקבוצת הבקרה כדי תמונה הקבוצות ניסיוני. שמירת תמונה בתבנית tiff.
- הפניה סולם, לצלם תמונה דיגיטלית של מיקרומטר על אותה מטרה.
- מאז ריאות אוטומטי-זריחה משתנה לאורך זמן, הפרמטרים הדמיה התוקף שתישמר לריאות שליטה בכל מפגש הדמיה. הפרמטרים הדמיה לטיפול אחד לא יהיה בהכרח אופטימליים להפעלות הדמיה עוקבות.
ניתוח התמונה:
הערה: השלבים הבאים של עיבוד תמונה נעשים עם חבילת התוכנה של ImageJ 1.51h 17.
- לפתוח קובץ תמונה ב- ImageJ (איור 3 א).
- להחסיר רקע: תהליך > רקע לחסר > רדיוס הכדור מתגלגל (התחל עם 50 פיקסלים), בטל את הסימון של "אור רקע" (איור 3B).
- המרת התמונה לתבנית 8 סיביות: תמונה > סוג > 8 - bit (איור 3C).
- הגדר יחידות פיקסלים: תמונות > Enter "פיקסלים" יחידת אורך, הזן 1 "פיקסלים רוחב", "פיקסל גובה", "Voxel עומק". סמן תיבה "גלובל" כדי להחיל על תמונות עוקבות.
- באמצעות הכלי בחירה מצולע, במיתאר של הצורה של הפרוסה הריאה כולה וקובעים את האזור (פיקסל2) של הפרוסה הריאות הכולל. ערך זה ישמש כדי לחשב את נטל הגידול באחוזים של הריאה.
- סף תמונה: תמונות > התאם > הסף > לסמן "ברירת מחדל" ו- "B & W" > השתמש במחוון לסף התמונה כזה כי הרוב המכריע של תאים סרטניים מסומנים באופן מדויק. לחיצה על "החל" יביא תמונה שחור-לבן שבו הריאות היא שחורה לגמרי, הפצעים פלורסנט הן לבן (דמות תלת-ממד). הקשה שניה על "החל" יתהפכו התמונה כל המבנים פלורסנט איפה עכשיו צורות שחורות (איור 3E).
- כימות מספר וצורה של נגעים:
לנתח > לקבוע מידות > בדיקת "האזור". בטל את הסימון של כל תיבות אחרות.
לנתח חלקיקים > גודל (פיקסל2): 0-אינסוף מייצג את מגוון צורות ImageJ למנות. מדעית לקבוע הנגע הכי קטן זה כדין תא גידול יחיד בתמונות הרכב יום 0. להשתמש האזור של תא יחיד גידול זה הגבול התחתון לתמונות הנותרים בערכת הנתונים. עבור העבודה שהוצגו במאמר זה, פיקסל 112 מוגדרת בתור הגבול התחתון. עבור העבודה המוצג בדוגמה וידאו, פיקסל 242 מוגדרת בתור הגבול התחתון. להשאיר "מעגליות" בטווח 0-1. "הצג" ניתן להגדיר את "כלום". לחלופין, אם נבחר "הצג" ו- "מתאר", ציור של כל הצורות מחולקת לרמות נוצר. בדוק "הצג תוצאות" חלון נפרד של מדידות לצוץ. לחלופין, יש תיבת "הוספת מנהל" בדק יחסוך כל הצורות לכמת למנהל רועי, אשר ניתן לשמור לשימוש עתידי. לאחר לחיצה על אישור, יופיע חלון "תוצאות" המכיל את כל הצורות הממוספרות ומדידות השטח (איור 3F). - העתק והדבק את הנתונים מן החלון "תוצאות" גיליון אלקטרוני. השתמש בפונקציה SUM מתמטיות ב- Excel כדי לסכם את כל האזורים של נגעים גרורתי את הפרוסה ריאות מסוים. כדי להעריך את נטל הגידול ריאות אחוז של הריאה פרוסה, לחלק את הסכום של האזורים של נגעים גרורתי על-ידי האזור הכולל של הפרוסה ריאות. פרמטר זה נקרא גם אזור השבר (A) אשר מתואר יותר על ידי אנדרווד 18.
נטל גידול בריאה = סכום של הנגע גרורתי אזורים/סה כ שטח של הריאה פרוסה - לחשב את נטל הגידול ריאות עבור שאר הסעיפים ריאות קבוצת הביקורת, נותרו קבוצות. להתוות את נטל הגידול הריאות הממוצע לכל קבוצה 0, 3, 7, 14 ימים. תמונות פלורסנט widefield נציג של גבוה ונמוך גרורתי תאים אנושיים OS גדל במודל פומה בנקודות זמן מתקדם מוצגים (איור 4A). קו גרף המציג את הקיפול-השינוי (מנורמל ליום 0) ב אחוז גידול גרורתי נטל לאורך זמן מוצג (איור 4B).
4. קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית הדמיה של המודל פומה
הערה: עבור הדמיה קונאפוקלית, ברקמה דומה לזה בסעיף הקודם חוץ מזה פרוסות ריאות גדולים נחתכים (מלאה רוחבי סעיפים, 1-2 מ מ עובי) כדי לאפשר יותר ROIs לדימות.
Labelling של parenchyma הריאה עם DAR4M:
- לטבול פרוסות ריאות ב 10 μμM של DAR4M (ב HBSS) למשך 45 דקות ב 37 º C. DAR4M תוויות חנקן ונבדקים מינים בתוך התאים של הריאה.
- אחרי 45 דקות של דגירה, לשטוף את הפרוסות ריאות עם HBSS טריים.
- מקם את הפרוסה ריאות 35 מ מ זכוכית-תחתון סביב צלחת, ותמונה על מיקרוסקופ קונפוקלי.
- הפרמטרים הדמיה לתמונות בדוגמה המוצגת באיור 5 מפורטים בטבלה5.
- רוכשים ערימה-Z עבור אזור של עניין. השתמש את עובי הפרוסה Z המוצע עבור הדגימה של נייקוויסט. סרט נציג במחסנית 3D מציג תאים OS ניאון ירוק בתוך רקמת הריאה התווית על-ידי DAR4M ניתנת סרט 1 ו- 1 סרט משלימה.
עבור תמונות קונאפוקלית בדוגמה המוצגת באיור5, הפעלת הדמיה היה חולה סופני אם נדרשת הדמיה האורך, השימוש של פוטון 2 או פוטון מרובה מאובזר LSM מיקרוסקופ קונפוקלי עבור הדמיה מומלץ משום שיש פחות נזקי חיים רקמות19,20.
הדמיה mito-RFP לביטוי MG63 תאים במודל פומה:
- לבצע את פרוטוקול פומה כמיתאר שלב 1 ו- 2 באמצעות תאים MG63 לבטא הבונה mito-RFP.
- מקם את הפרוסה ריאות 35 מ מ זכוכית-תחתון סביב צלחת, ותמונה על מיקרוסקופ קונפוקלי.
- הפרמטרים הדמיה לתמונות בדוגמה המוצגת באיור 6 רשומים לפי טבלה 6. סרט נציג במחסנית 3D מציג תאים OS ניאון ירוק אדום המיטוכונדריה פלורסנט מסופק סרט 2 ו- 2 סרט משלימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוסקופ פלורסצנטיות ההגדלה נמוך widefield
עבור widefield קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ של פומה ריאות פרוסות, להחליפן בתמונות, כימות הנתונים מוצגים באיור 2C, ואת דמות 4A ו- B. מספק שלעצמו גרורתי עבור שורות תאים גבוה ונמוך גרורתי ניכרים באופן חזותי על נקודות זמן מתקדמת. תאים MNNG יכול ליישב ביעילות רקמת הריאה ואילו תאים זונות לא יכול לגדול בכלל. מניתוח תמונה, ניתן להשיג נתונים כמותיים כדי להעריך צמיחה לאורך זמן, כמו בגרף של איור 4B. רכישת בהגדלה נמוך (2.5 X) מהווה יעד מועדף על מנת ללכוד את הפרוסה הריאה כולה בתמונה אחת. שיטה זו מאפשרת הדמיה אצווה הפרוסות פומה מספר גדול.
זריחה קונפוקלי גבוהה-הגדלה מיקרוסקופית
עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית הפרוסות ריאות פומה, להחליפן בתמונות מוצגות באיור5. תאים MG63 לבטא eGFP בודדים ניתן לראות באיור 5A ביחס parenchyma הריאה, אשר נקראת על ידי DAR4M הפלורסנט ב- 5B איור. תמונת הממוזגים מוצג באיור 5C, ועף תמונה של תא הגידול פלורסנט מגרגרי מוצג באיור 5D. קולנוע תלת-ממד של 5C איור 5 D מוצגים סרט 1 ו- 1 סרט משלימה, בהתאמה. הדמיה קונאפוקלית של מבנים subcellular כמו המיטוכונדריה מוצגות באיור איור 6- EGFP cytosolic-ביטוי מאפשרת לתאי הגידול חלוקה לרמות ב- 6A איור, המיטוכונדריה המסומנת RFP מוצגות באיור איור 6B. תמונת הממוזג הוא ראה ב- 6C איור. סרטים תלת-ממד של איור 6C מוצגים סרט 2 ו -2 הסרט משלים. הדמיה מבנים subcellular כמו המיטוכונדריה יכול להיות משולב עם שאר התוויות פלורסנט ללמוד ביולוגיה אברון בתאים OS גרורתי. בעת הוספת תוויות יותר, להבטיח קווי לייזר ואת פליטת מסננים תואמים להחלבון fluorophore/פלורסנט מסוים של עניין. הימנע הדמיה fluorophores/פלורסנט חלבונים אשר עירור, ספקטרום הפליטה מקרוב חופפים.
איור 1 : דיאגרמה המדגימה את המפל גרורתי. המפל גרורתי יכול להיות שבור למטה לתוך צעדים מספר, הגבלת קצב. (1) גידול גרורתי תאים עוזב את האתר הגידול העיקרי, חודר לתוך parenchyma מקומיים; (2) גידול תאים intravasating לתוך כלי דם/הלימפה ואת המעבר בתוך מחזור הדם; (3) הגידול תא מעצר באתר משני; (4) extravasation תא הגידול החוצה מן microvasculature הישרדות באתר משני; (5) הצמיחה לתוך micrometastases; (6) הצמיחה לתוך vascularized גידולים גרורות עבירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : הדמיה פומה ריאות פרוסות באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield ופלטפורמות מיקרוסקופ קונפוקלי קרינה פלואורסצנטית. (א) דוגמה פומה פרוסות מוצגים תבשיל 35 מ מ זכוכית-התחתון. (ב) מיקרוסקופ קונפוקלי ציוד. (ג) דוגמה תמונה נמוכה-הגדלה של פרוסה פומה עם תאים OS eGFP-ביטוי. Scalebar = 0.5 מ מ. (ד) דוגמה קונאפוקלית דימוי אכולי פרוסת פומה. Scalebar = 100 μm. (*) Parenchyma הריאה מסומן אדום על-ידי DAR4M (ראה שיבוץ) ו- (∇) הצבע על הבעת eGFP תאים MG63. Scalebar = 30 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . עיבוד תמונה נמוכה-הגדלה של פרוסה פומה באמצעות ImageJ. (א) התמונה המקורית פומה. (ב) חיסור של הרקע. (ג) המרה לתמונה 8 סיביות. (ד) קביעת סף התמונה כדי לסמן תאים סרטניים פלורסנט. (ה) היפוך של התמונה. (ו) ספירה של כימות של אזורי צורה וצורות דיסקרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . תמונות טורי נמוך ההגדלה מציג הצמיחה של OS אנושי מאוד, נמוך גרורתי תאים במודל פומה לאורך זמן. (א) תמונות טורי של תאים MNNG מאוד גרורתי ותאים נמוך זונות גרורתי מוצגים ב- 0, 3, 7 ו- 14 ימים לאחר ההזרקה. MNNG תאים מסוגלים לגדול יותר טוב microenvironment ריאות לעומת התאים זונות. Scalebar = 1 מ מ. (B) לקפל-שינוי אחוז גידול גרורתי נטל על תאים MNNG ובחורות עם הזמן מוצגים גרפים קו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : מיקרוסקופיה קונפוקלית פרוסת ריאות פומה התווית על-ידי DAR4M. תמונת קונאפוקלית נציג של ביטוי eGFP MG63 בתאי רקמת הריאה פומה המסומנת DAR4M. (א) ערוץ ירוק מציג הבעת eGFP תאים MG63 (∇). (ב) ערוץ אדום מציג את הצבע DAR4M מחייב את תגובתי חנקן מינים בתאים parenchyma הריאה. לצבוע מדגיש parenchyma הריאה (#), ומבנים הדומה כלי דם (*). הקצה של הפומה ריאות סעיף מסומן (↓). (ג) ממוזג תמונת אדום וירוק. Scalebar = 100 μm. (ד) תמונה מוגדלת של התיבה הלבנה מקווקו (מ ג) מציג תא הגידול קיבול. Scalebar = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : מיקרוסקופיה קונפוקלית של המיטוכונדריה בתאים אוסטאוסרקומה במודל פומה. תמונת קונאפוקלית נציג של המיטוכונדריה בתאים MG63 לבטא eGFP. (א) ערוץ ירוק מציג הבעת eGFP תאים MG63 (∇). (ב) ערוץ אדום מציג RFP מקומית המיטוכונדריה (*). (ג) ממוזג תמונת אדום וירוק. Scalebar = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| תרבות המדיה | מתכון |
| התקשורת מלאה (500mL) | מ •440 ל DMEM |
| •50 mL FBS | |
| •5 מ ל 10 X עט/סטרפ פתרון (10000U/mL) | |
| mL •5-גלוטמין (200 מ מ) | |
| A-מדיה (250 מ"ל) | •177.58 מ ל מים סטריליים |
| •50 מ ל 10 X M-199 מדיה | |
| • נרשמו 15 מ ל 7.5% סודיום ביקרבונט פתרון | |
| מ •2.25 ל hydrocortizone 50 מ מ | |
| •125 מ ל 0.4 מ"ג/מ"ל אצטט רטינול (במים סטריליים) | |
| •5 מ ל 10 X עט/סטרפ פתרון (10000U/mL) | |
| •50 מ"ל של אינסולין שור 10 מ"ג/מ"ל | |
| B-מדיה (500ml) | •427.6 מ ל מים סטריליים |
| •50 מ ל 10 X M-199 מדיה | |
| • נרשמו 15 מ ל 7.5% סודיום ביקרבונט פתרון | |
| מ •2.25 ל hydrocortizone 50 מ מ | |
| •125 מ ל 0.4 מ"ג/מ"ל אצטט רטינול (במים סטריליים) | |
| •5 מ ל 10 X עט/סטרפ פתרון (10000U/mL) | |
| •50 מ"ל של אינסולין שור 10 מ"ג/מ"ל |
טבלה 1. מתכונים מדיה מלאה, א-מדיה, B-מדיה. מתכונים תרבית תאים ובתקשורת וזמינותו פומה מפורטים.
| ריאגנטים תרבות תא | תיאור | מס קטלוג | החברה |
| MNNG-בחורות | מאוד גרורתי OS תא קו | CRL-1547 | בקרת האוויר |
| זונות | שורת התאים OS לקוי גרורתי | CRL-1543 | בקרת האוויר |
| MG63.3 | מאוד גרורתי OS תא קו | N/A | איימי לבלאן מעבדה (NCI) |
| MG63 | שורת התאים OS לקוי גרורתי | CRL-1427 | בקרת האוויר |
| 10 X M199 מדיה | בסיס מדיה עבור המדיה A ו- B-מדיה | 11825015 | Thermofisher |
| מים מזוקקים (עיקור) | רכיבים של A-מדיה & | 15230-147 | Thermofisher |
| B-מדיה | |||
| 7.5 הפתרון סודיום ביקרבונט % | רכיבים של A-מדיה & | 25080094 | Thermofisher |
| B-מדיה | |||
| Hydrocortizone | רכיבים של A-מדיה & | H6909 | סיגמא-Alrich |
| B-מדיה | |||
| Soluable מים אצטט רטינול | הרכיב של A-מדיה & B-מדיה | R0635 - 5 מ"ג | סיגמא-Alrich |
| פתרון פניצילין/סטרפטומיצין 10 X מרוכז (10000 U/ml) | רכיבים של A-מדיה & | 15140122 | Thermofisher |
| B-מדיה, מדיה מלאה | |||
| פתרון אינסולין שור (10mg/ml) | רכיבים של A-מדיה & | I0516 - 5 מ | סיגמא-Alrich |
| B-מדיה | |||
| DMEM, גלוקוז גבוהות | מדיה הבסיס של התקשורת מלאה | 11965092 | Thermofisher |
| -גלוטמין (200 מ מ) | רכיב של מדיה מלאה | 25030081 | Thermofisher |
| סרום שור עוברית | רכיב של מדיה מלאה | 16000044 | Thermofisher |
| באגירה פוספט של Dulbecco תמיסת מלח | בשימוש תרבית תאים | 14190144 | Thermofisher |
| של האנק Buffered מלחי פתרון, אין סידן, מגנזיום אין אין פנול אדום | נהגה resuspend תא גלולה לפני ההזרקה | 14175095 | Thermofisher |
| טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום | בשימוש תרבית תאים | 25200114 | Thermofisher |
| DAR4M | נהגה תווית parenchyma הריאה | ALX-620-069-M001 | אנזו |
בטבלה 2. תא תרבות ריאגנטים עבור A-מדיה, B-מדיה, והשלם מדיה. רכיבים עבור מדיה מתכונים, ריאגנטים, מאגרי מפורטים עם מספר קטלוג ושם החברה.
| חומרים | תיאור | מס קטלוג | החברה |
| LSM קונאפוקלית Zeiss 710 | זקוף LSM מיקרוסקופ קונפוקלי | N/A | Zeiss |
| LSM קונאפוקלית Zeiss 780 | הפוך LSM מיקרוסקופ קונפוקלי | N/A | Zeiss |
| SCID עכברים | . הנהון. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, נקבה, בגיל 6-8 שבועות | N/A | (Charles river) |
| השאיבה | לשמש תמיכה עבור מקטעים רקמת הריאה | 59-9863 | המנגנון הרווארד |
| SeaPlaque Agarose | במהלך insufflation של הריאה | 50100 | Lonza |
| מזרק 1 מ"ל עם 27 להעריך את המחט | משמש הזרקה וריד הזנב | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| מזרק 10 מ | משמש insufflation של הריאה | 309604 | BD |
| מד 20 קטטר | במהלך insufflation של הריאה | SR-OX2032CA | Terumo |
| הגדרת סיומת אבוט הרביעי (30", סטרילי) | במהלך insufflation של הריאה | 8342 | Medisca |
| מטליות אלכוהול | ניגוב הזנב הווריד לפני ההזרקה | 326895 | BD |
| כפפות כירורגי סטרילי | Asceptic מוסר של הריאות העכבר | משתנה עם גודל | Fisherscientific |
| הסרגל 30 ס מ | משמש insufflation של הריאה | סיכות | |
| תמיכה ולעמוד על שליט | משמש insufflation של הריאה | HS29022A | Pipette.com |
| צלחת תת תרבות 35 מ מ | בשימוש במהלך דימות של הריאה פרוסות | 81158 | Ibidi |
| Underpads סופג עם מחסום לחות עמיד למים | שנעשה בהם שימוש בשורה אזור עבודה סטרילית בשכונה ביולוגי | 56617-014 | VWR |
| תפר שנספג רגיל לאללה | קשרו את קנה הנשימה לצינוריות | N/A | בראון |
בטבלה 3. חומרים עבור פומה. החומרים הנדרשים עבור פרוטוקול פומה מפורטים עם מספר קטלוג ושם החברה.
| חומרים | תיאור | מס קטלוג | החברה |
| לנתח מיקרו מספריים בגודל 3.5 אינץ ' ישר שארפ/חד | עבור מקטעים ריאות חיתוך | RS-5910 | Roboz |
| 4"(10 ס מ) זמן משונן ישר עצה נוספת עדין 0.5 מ מ | עבור מקטעים ריאות מניפולציה/אחזקה | RS-5132 | Roboz |
| 4"(10 ס מ) עיקול משונן ארוך עצה 0.8 מ מ | עבור מקטעים ריאות מניפולציה/אחזקה | RS5135 | Roboz |
| . אגודל ההלבשה מלקחיים; צובטן; עדינה. 4.5 ׳׳ אורך; 1.3 מ'מ רוחב עצה | עבור ניתוח כללי | RS-8120 | Roboz |
| . אגודל ההלבשה מלקחיים 4.5 ׳׳ משונן 2.2 מ"מ רוחב עצה | עבור ניתוח כללי | RS-8100 | Roboz |
| מספריים Dissecting מיקרו דק במיוחד בגודל 3.5 אינץ ' שארפ ישר/חד, להב 20 מ מ | עבור ניתוח כללי | RS-5880 | Roboz |
| קנפ מספריים; ישר; שארפ-בלאנט; 27 מ מ אורך הלהב; 4" אורך כללי | עבור ניתוח כללי | RS-5960 | Roboz |
בטבלה 4. מכשירי ניתוח עבור פומה. מכשירים שונים של פלדת אל-חלד בשימוש בפרוטוקול מפורטים עם מספר קטלוג ושם החברה.
| פרמטרים | לייזר 488 | לייזר 561 | |
| המטרה | Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0.3 W (DIC) M27 | ||
| כוח | 2% | 2% | |
| פיקסל להתעכב | 1.61 | 1.61 | |
| ממוצע | 0 | 0 | |
| זום | 1 | 1 | |
| רווח בסיס | 820 | 814 | |
| הגברה דיגיטלית | 1 | 0.51 | |
| אופסט דיגיטלי | -4.5 | -9.24 | |
| חריר | 51 | 57 | |
| מסנן tunable | 496-553 | 570-618 | |
טבלה 5. פרמטרים עבור הדמיה קונאפוקלית סעיפים פומה התווית על-ידי DAR4M. פרמטרי תמונה ספציפית להשתמש כדי להשיג את התמונות קונאפוקלית בעיתון הנוכחי הינם מסופקים בטבלה.
| פרמטרים | לייזר 488 | לייזר 561 | |
| המטרה | תוכנית-עדשה אפוכרומטית 63 x / 1.40 שמן DIC M27 | ||
| כוח | 2% | 2% | |
| פיקסל להתעכב | 0.6 | 0.6 | |
| ממוצע | 2 (קו) | 2 (קו) | |
| זום | 2.3 | 2.3 | |
| רווח בסיס | 449 | 390 | |
| הגברה דיגיטלית | 1 | 1.23 | |
| אופסט דיגיטלי | 0 | 0 | |
| חריר | 136 | 136 | |
| מסנן tunable | 493-550 | 566-703 | |
טבלה 6. פרמטרים עבור הדמיה קונאפוקלית של המיטוכונדריה MG63 תאים בסעיפים פומה. פרמטרי תמונה ספציפית להשתמש כדי להשיג את התמונות קונאפוקלית בעיתון הנוכחי הינם מסופקים בטבלה.
משלימה איור 1: כוח המשיכה זלוף מכשירים. המנגנון זלוף הכובד משמש insufflate בריאה נוזלי פתרון agarose/A-מדיה-20 ס מ בלחץ הידרוסטטי20 H. הפתרון agarose/A-מדיה ויוצקים לתוך המזרק 10 מ"ל, אשר מוצמד על ידי הארכה הרביעי להגדיר לקנה הנשימה cannulated (לא מוצג). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
סרט 1: סיבוב של תמונה תלת-ממדית קונאפוקלית z-מחסנית של מערכת ההפעלה לבטא eGFP תאים בפרוסה ריאות פומה התווית על-ידי DAR4M. DAR4M (ערוץ אדום) משמש כדי לסמן parenchyma הריאה, לבטא eGFP תאים MG63 ניתן גם לראות (ערוץ ירוק). Scalebar = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הצעד הזה.
סרט 2: סיבוב של תמונת תלת-ממד קונאפוקלית z-מחסנית של התווית על-ידי RFP המיטוכונדריה ב OS לבטא eGFP תאים במודל פומה. Organelles subcellular כמו המיטוכונדריה מוצגים שכותרתו עם RFP (ערוץ אדום) בתאים המבטאים-eGFP MG63 (ערוץ ירוק) במודל פומה. Scalebar = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הצעד הזה.
משלימה סרט 1: סרט תלת-ממד מוגדלת של תא OS גרורתי מגרגרי בריאה. תא MG63 לבטא eGFP מוצג כלי בתוך microenvironment ריאות. Scalebar = 30 μM. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הצעד הזה.
משלימה את הסרט 2: סרט תלת-ממד מוגדלת של המיטוכונדריה בתא OS גרורתי בריאה. המיטוכונדריה המסומנת RFP מוצגות בתאים MG63 microenvironment ריאות. Scalebar = 5 μM. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הצעד הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
להלן מאמר טכני המתאר כמה היבטים מעשיים של המודל פומה בלימוד קולוניזציה ריאות ב- OS. כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול איפה החוקרים צריכים להיזהר במיוחד כוללות את הפעולות הבאות:
a) תעלות של חוליות הצוואר. יכול להיפגע בקלות אל קנה הנשימה תוך כדי לנתח את השרירים שמסביב ואת רקמת חיבור. בנוסף, להיות דחף את המחט של הקטטר בקלות דרך קנה הנשימה. שים לב עד כמה השיקוע של המחט נכנסת קנה הנשימה בעת הוספת את הצינורית.
b) תקר או פגיעה השטח של הריאה. הריאה ניתן בקלות ניקב או ניזוק עם לנתח מספריים בעת הסרת עצם החזה וחשיפת בחלל החזה. היה זהיר בעת לנתח החוצה אומץ הלב בחלל החזה. ניקב או פגיעה השטח של הריאה יגרום נוזלי agarose/A-התקשורת לדלוף, הריאה להיות מנוכה המחירים.
ג) להסיר עודפי מדיה ממקטעים ריאות בעוד הדמיה. עודף מדיה נוזל סביב הריאה בסעיף יכול לגרום אפקט "מראה" כאשר מתחת למיקרוסקופ. הנוזל העודף ניתן לשקף אור ניאון מתאי הגידול ובכך מגזים אזור קרינה פלואורסצנטית בתמונה. הסרה של נוזל מדיית עודף תמנע החפץ בתמונה. לחלופין, ניתן להסיר את החפץ התמונה במהלך עיבוד שלאחר של התמונות.
ד) נזקי של רקמות החי. בעת שימוש נורת כספית או לייזרים של מיקרוסקופ פוטון 1, הקפד להגביל את משך הזמן חשוף לאור. גם יכול להיות מופחת האחוז: כוח בעוצמה של מקור האור.. חשיפת יתר מקור האור יכול לגרום נזקי לרקמת הריאה. מיקרוסקופים מצוידים אור דיודות (LED) או 2-פוטון/מולטי-photon מיקרוסקופים יהיה אידיאלי משום שהם מייצרים פחות נזקי במהלך לימודי דימות האורך.
המודל פומה יכול להיות מותאם ולשנות ללמוד היבטים רבים של תהליך קולוניזציה ריאות. עוד גרסה של גישה זו שמחוץ מתואר על ידי ואן דן Bijgaart ועמיתיו 21. ללימודי בוחן את ההשפעות של פעילות דפיקה למטה או גרורתי אנטי לתרופות הגן על צמיחת תאים סרטניים גידולים בריאה, דרוג בחזרה את מספר התאים מוזרק מ 5 x 105 3 x 105 מומלץ מאז ההשפעות של ההתערבות יכולה להיות רעולי פנים במהלך הגידול האקספוננציאלי של innoculum תא גדול יותר. מספר מחקרים השתמשו המודל פומה ללמוד הנהגים של ריאות גרורתי התקדמות 4,5,8,22,23,24. צבעי פלורסנט מחוון או כתב פלורסנט גנים שונים יכול לשמש כדי תאים סרטניים התווית לברר שינויים תא לפיזיולוגיה או גנים ביטוי 8 ב microenvironment הריאה.
מגבלה אחת של המודל פומה כולל מספר מצומצם של שורות תאים תואם. הקווים תא ויצר תואם assay זה מפורטים ב- מנדוזה ועמיתיו 3 . לקווים תא אוסטאוסרקומה גרורתי גבוה ונמוך, בצע זוגות של שורות תאים הקשורים clonally התגלו לגדול ולתחזק שלהם נטיה גרורתי במודל פומה: תאים אנושיים MG63.3 & MG63, MNNG & 143B, זונות תאי, מאתר K7M2 ו- K12 תאים. חוקרים עליך לקבוע מדעית או לא שורות תאים שלהם יכול להישאר בר קיימא בתקשורת-B. מגבלה נוספת שיש לקחת בחשבון הוא משך הזמן שרקמות הריאה יכול להישמר בתוך חוץ גופיתמוגבלת. רקמת הריאה יכול לשמור על מרכיביו הסלולר למשך 30 יום, מעבר הזמן ולהתחיל מרכיבי התא של הריאה למות.. לכן ללמוד את האינטראקציות בין תאים סרטניים ותאים סטרומה ריאות לא יעלה על 30 ימים.
המודל פומה מספק שיטה חסרת תקדים ללמוד איך גרורתי OS תאים לישוב רקמת הריאה. ההיבט הבולט ביותר של המודל פומה מגיע מן העובדה מספר נמוך גרורתי OS שורות תאים (זונות, MG63, K12), אשר פנוטיפים ויוו היה מאופיין במקום 25, אי אפשר לגדל במודל פומה. לעומת זאת, clonally קרובים מאוד גרורתי OS תאים (MNNG, MG63.3, K7M2) יש נטייה גדולה יותר לישוב רקמת הריאה ויוו25 ודגם של הפומה. הדבר מצביע על כי הרכיבים הסלולר, חוץ-תאית של microenvironment הריאות למנוע נמוך שורות תאים גרורתי של מערכת ההפעלה של גידול ויוו, עדיין נשמר במודל פומה למרות העדר זרימת הדם. במילים אחרות, microenvironment ריאות של המודל פומה עדיין מפעילה "לחץ לבחירה" המונעת נמוכה התאים OS גרורתי של גידול בריאה. אכן, לומד תאים OS גבוהה גרורתי צומחים פומה כבר שימושי לזיהוי מנהלי התקנים מולקולריים חדשים של פנוטיפ גרורתי 4,5. יתר על כן, למטה-אפנון גנטי של מטרות אמר בתאים מאוד גרורתי הוצגה לצמצם גרורות קיבולת במודל בשני פומה, ויוו 5. ללימודים סמים אנטי גרורתי המועמד, הפומה דגם יכול לשמש כדי לקבוע איזה טווח הריכוז. המצמצמים תוצר גרורתי ברקמות הריאה, אשר בתורו, ואז ניתן המאומת ויוו.
יישומים עתידיים של מודל זה צריך לנצל את שפע של צבעי פלורסנט זמינים מסחרית וגם הגנים כתב כדי לרדת לעומקם של הביולוגיה הבסיסי של מערכת ההפעלה גרורות התקדמות. לדוגמה, צבעי פלורסנט כגון 2', 7' diacetate - dichlorofluorescin או dihydroethidium יכול לשמש כדי להעריך את מצב חמצון-חיזור של תאים סרטניים במודל פומה. כתב פלורסנט גנים ניתן ללמוד ביולוגיה אברון או להעריך יזם פעילות כדי לקבוע איזה איתות המסלולים מופעלים בתאים OS גרורתי מאוד במהלך תהליך קולוניזציה. גישות כאלה ניתן לדמיין אם טיפול תרופתי יש פעילות בתאי הגידול גידול בריאה. פלטפורמות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לייצר פחות נזקי רקמות, כגון מיקרוסקופ מאובזר LED או מיקרוסקופ קונפוקלי 2-פוטון/multiphoton, ניתן להשתמש ללמוד איך גרורתי OS תאים נודדים, לפלוש לאורך כל רקמות הריאה. יתר על כן, ניתן לנטר אדהזיה אינטראקציות בין תאים סרטניים סטרומה ריאות תאים עם הגנים כתב פלורסנט.
לסיכום, הנייר הנוכחי דן בהיבטים מעשיים של המודל פומה, שפותחה על ידי מנדוזה ועמיתיו 3. דוגמה לשימוש ההגדלה נמוך, widefield קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה כדי להעריך את הצמיחה של תאים OS אנושי גבוה ונמוך גרורתי מוצג. תוארו מספר שלבים קריטיים של הפרוטוקול. בנוסף, היתרונות ואת המגבלות של המודל פומה כבר דנו. יישומים עתידיים של המודל פומה ללמוד את התהליך קולוניזציה ריאות שהועלו, יש לקוות כי מודל זה יהיה שימוש רחב בקהילת המחקר אוסטאוסרקומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ד ר Arnulfo מנדוזה שסיפק הכשרה בטכניקה פומה. בנוסף, ברצוננו להודות ד"ר צ'אנד Khanna, סוזן גארפילד (NCI/NIH), ואפריצ'יו סאם (סוכנות סרטן לפנה ס) על מתן השימוש שלהם מיקרוסקופים במהלך מחקר זה. מחקר זה נתמך (באופן חלקי) על-ידי התוכנית מחקר מגזר של מכוני הבריאות הלאומיים, במרכז לחקר הסרטן, סניף אונקולוגיה ילדים. M.M.L. נתמך על ידי מוסדות של בריאות מגזר ביקור עמית התכנית הלאומית (זוכה פרס 15335), כיום נתמכת על ידי מלגת פרקר ג'ואן בחקר גרורות. P.H.S. נתמך על ידי קרן סרטן קולומביה הבריטית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S.
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. Quantitative stereology. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
