Summary
Bu makalede, pulmoner metastaz tahlil (PuMA) Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama sağlamak için hedeftir. Bu model araştırmacılar metastatik osteosarkom (OS) hücre büyümesini widefield floresan veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak akciğer dokusunda çalışmaya izin verir.
Abstract
Pulmoner metastaz tahlil (PuMA) bir ex vivo akciğer explant ve araştırmacılar tarafından Floresans mikroskobu osteosarkom (OS) akciğer kolonizasyon Biyoloji çalışmaya izin verir kapalı hücre kültür sistemi olduğunu. Bu makalede Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama ve metastatik büyüme widefield veya confocal floresan mikroskopi platformlar kullanarak bağlı görüntü veri alma örnekleri ele alınmaktadır. PuMA modeli esnekliğini araştırmacılar akciğer microenvironment içinde işletim sistemi hücrelerinin büyümesini sadece eğitim için aynı zamanda zaman içinde Anti-metastatik tedavi etkilerini değerlendirmek için izin verir. Akciğer parankimi ile OS hücre etkileşimlerin görülmemiş, yüksek çözünürlükte görüntüleme için confocal mikroskobu sağlar. Ayrıca, PuMA modeli floresan boyalar veya floresan protein genetik gazetecilere ile birleştirildiğinde, araştırmacılar akciğer microenvironment, hücresel ve hücre altı yapıları, gen fonksiyon ve metastatik OS hücrelerdeki organizatörü etkinlik eğitim görebilirsiniz. PuMA modeli osteosarkom araştırmacılar yeni metastaz Biyoloji keşfetmek ve roman Anti-metastatik, hedeflenen tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için yeni bir araç sağlar.
Introduction
Pediatrik hastalarda metastatik osteosarkom (OS) için geliştirilmiş sonuçları hala kritik karşılanmamış klinik ihtiyaç 1kalır. Bu yeni tatlı hedefli tedaviler geliştirmenin önemi vurgular. Hedef tümör hücre çoğalması metastatik hastalık ve böylece roman stratejileri tedavisinde etkili olduğu kanıtlanmış değil geleneksel chemotherapeutics metastatik işlemi 2hedeflemesi gerekir. Geçerli makalenin ex vivo akciğer metastazı modeli, yeni keşfetmek yararlı bir araç sağlayan Mendoza ve iş arkadaşları3tarafından geliştirilen pulmoner metastaz tahlil (PuMA) nispeten yeni bir tür pratik yönlerini ele almaktadır. Moleküler sürücüleri akciğer metastazı ilerleme OS 4,5. Devam etmeden önce ancak, kısaca metastaz çeşitli geçerli modeller dokunmak ihtiyatlı olur ve deneyleri nasıl PuMA modeli geleneksel vitro birkaç avantaj sunar.
Metastaz çalışırdım en deneysel modeller belirli bir adımı veya metastatik art arda birkaç adımını özetlemek vitro ve in vivo sistemleri oluşturmaktadır. Bu adımlar içerir: 1) tümör hücreleri birincil tümör, 2) intravasation uzak içine Yakındaki gemiler (kan veya lenf) ve dolaşım içinde transit geçiş 3) tutukla ikincil site, 4) ekstravazasyonu ve hayatta kalma ikincil alanında 5) oluşumu micrometastases ve 6) büyüme içine bozukluklarına Metastazlari (şekil 1). Metastaz vitro modelleri 2-boyutlu (2D) geçiş içerebilir ve hangi içinde gözden 3 boyutlu (3D) Matrigel işgali deneyleri, başka bir yerde 6detay. Vivo modellerinde, iki yaygın olarak kullanılan model sistemleri içerir: 1) spontan metastaz modeli nerede bir tümör hücreleri orthotopically kendiliğinden metastatik hücreleri tutuyor yerel bir tümör oluşturmak için belirli doku türü enjekte olmasıdır uzak sitelere; 2) deneysel metastaz modeli nerede tümör hücrelerinin damar akıntıya karşı hedef organ enjekte edilmiş olur. Örneğin, bir kuyruk ven enjeksiyon tümör hücreleri sonuçları geliştirme akciğer Metastazlari5,7,8. Diğer deneysel metastaz modelleri dalak ya da karaciğer metastaz9,10gelişiminde sonuçları Mezenterik ven içine tümör hücrelerinin enjeksiyon içerir. Bu vivo içinde modellerin pratik hususlar Welch 11tarafından ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Metastaz Pediatrik sarkomları içinde çalışmak için kullanılan başka bir vivo içinde modeli yerel tümör oluşumu ve spontan metastaz için akciğerler 12,13sonuçları böbrek böbrek subkapsüler tümör implantasyon modelidir. Teknik açıdan daha zorlu bir tekniği gibi intravital videomicroscopy can doğrudan görselleştirmek, buna metastatik kanser hücreleri ve metastatik bir site microvasculature gerçek zamanlı, Hofstede (yani. akciğer veya karaciğer)14 MacDonald tarafından açıklandığı gibi ve Entenberg15veya kanser hücre ekstravazasyonu chorioallantoic zarda Kim 16tarafından tanımlandığı gibi.
PuMA modelin bir ex vivo, Akciğer doku explant, kapalı kültür sistemi olduğunu nerede floresan tümör hücrelerinin büyümesini boyuna Floresans mikroskobu ile bir ay boyunca görülebilir ( şekil 2Abakınız). Bu model akciğer kolonizasyon (Adım 3-5) metastatik cascade başlangıç evresinde beyannamedir. Geleneksel vitro modelleri PuMA modelinin büyük bazı avantajları vardır: 1) içinde boyuna metastatik kanser hücre büyüme akciğer microenvironment özelliklerinin çoğu korur bir 3D microenvironment ölçmek için bir fırsat sağlar vivo 3; 2) puMA nakavt aday gen veya uyuşturucu tedavi Anti-metastatik etkinlik 3D akciğer microenvironment bağlamında olup olmadığını değerlendirmek araştırmacı sağlar; 3) Floresans mikroskobu platformlar (2B rakam) widefield Floresans mikroskobu ya da confocal mikroskobu lazer tarama birçok türde ile esnek PuMA modelidir, şekil 2C & Diçinde her örnekler gösterilir, anılan sıraya göre. Bu makalede PuMA modeli gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) metastatik büyüme üzerine boyuna görüntüleme verileri elde etmek için nasıl kullanılacağı ele alınacak-ifade, insan yüksek ve düşük metastatik osteosarkom hücreleri (MNNG ve HOS hücreleri, sırasıyla) kullanarak düşük-büyütme widefield floresan. Akciğer parankimi etiketleri floresan boya ve mitokondri içinde OS etiketleri genetik muhabir PuMA model confocal mikroskobu lazer tarama kullanarak hücreleri kırmızı-floresan protein Imaging örnekler de ele alınmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hangi görüntüleme veri elde tüm hayvan iletişim kurallarını hayvan bakım ve kullanım Komitesi Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri onayı ile gerçekleştirilmiştir. Tartışılan ve video makalede tasvir tüm hayvan iletişim kuralları British Columbia Üniversitesi hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış olması.
1. hazırlanması tümör hücreleri PuMA modeli için malzeme ve enjeksiyon için
Not: Çözümler ve hücre miktarı 1 fare için yeterli olacaktır. Daha fazla fare çalışmada kullandıysanız gerektiği şekilde büyütmek. Ortam için yemek tarifleri, Tablo 1 ve Tablo 2bakın.
- Bir Media 5 mL 15 mL konik tüp 37 oC su banyosu içinde önceden ısıtmak.
- Laboratuvar mikrodalga kullanarak % 1.2 düşük erime özel çözümde (steril su) eritin.
- 15 mL konik tüpe 5 mL de erimiş özel aktarım ve bir 37 oC su banyosunda sıcak tutun. 37 oC ve akciğer üfleme adım önce sıvı, erimiş özel olduğundan emin olun.
- Hücre kültürü grade 1 X kalem/strep nedense odamızda buz kovası ile takıma PBS önceden sakin 30 mL.
- 6-şey plaka bir kuyuda bir jelatin sünger B-medya 1,5 ml önceden ıslatın. Sünger akciğer dilimleri için destek çapa olacaktır.
- İşletim sistemi hücreleri yaklaşık % 70-90 emin olmak Konfluent yordamı gününde. Aşırı birleşmesi veya ortamdır hücreleri genellikle vurguladı ve canlılık bu noktada azalmış beri sarı turuncu olan hücreler kullanmayın. Osteosarkom hücre hatlarında, MNNG ve HOS, 5 x 105 ' te 100 μL hacmi 1 fare kuyruğu damar içine enjekte etmek için kullanılır. Daha fazla fare çalışma için kullanılmışsa buna göre lüks.
- % 0.25 tripsin-EDTA (3 mL T75 şişesi veya 10 cm kültür tabak 2 mL) kullanarak tümör hücreleri hasat. Ne zaman hücre tabağını kaldırın başlıyor, tripsin-EDTA ile komple bir medya etkisiz hale getirin. Hücreleri aşağı spin ve bir kez hücre kültürü sınıf PBS ile durulayın. Pelet PBS 5 mL resuspend.
- Bir hücre sayısı standart yöntemlerle gerçekleştirmek. Daha fazla hücre süspansiyon hücre süspansiyon kaybı sık sık iğne çizmek-up sırasında oluşur ve enjeksiyon girişimleri başarısız oldu çünkü aslında gereken şey daha yapmak en iyisidir.
- Trypan-mavi dışlama tahlil hücrelerin canlılık değerlendirmek için hücre süspansiyon bir örnek üzerinde gerçekleştirin. Yalnızca hücre % 90 canlılığı göster, devam veya daha yüksek.
- 100 μL hacmi 5 x 105 hücrelere enjekte. 2 X bu miktarın aşırı hazırlamak için 1 x 106 hücre aşağı döndü ve 0.2 mL HBSS resuspended.
- Hücre süspansiyon enjeksiyon için fareler hazırlarken bir buz kovası yerleştirin.
2. kuyruk ven enjeksiyon ve akciğer üfleme
Not: Çözümler ve bu bölümdeki hücrelerin miktarı 1 fare için yeterli olacaktır. Daha fazla fare çalışmada kullandıysanız gerektiği şekilde büyütmek. Ekipman, malzeme ve aşağıdaki adımlarda kullanılan cerrahi aletler listesi için Tablo 3 ve Tablo 4bakın.
- Dişi fare (yaş 6-8 hafta) 5 min için Isıtma lambası altında damar kuyruğunu gözle görülür daha belirgin hale getirmek için sıcak. Fare K7M2 veya K12 hücreleri için Balb/c fare kullanma; insan MG63.3, MG63, MNNG ve HOS hücreleri için ağır kombine immün yetmezlik fare kullanın.
- Hücre süspansiyon tüpü hafifçe sallayarak düzgün olduğundan emin olun. Dikkatle iğne olmadan 1 mL şırınga içine hücre süspansiyon kadar çizin. Kap bir 27 şırınga iğne ölçmek. İğne eğim iğne üzerindeki birim işaretleri olarak aynı tarafta olduğundan emin olun.
- Restrainer fareyi getirin ve kuyruk bir alkol bezle temizleyin.
- Bir kuyruk ven enjeksiyon gerçekleştirmek ve hücre süspansiyon 100 μL enjekte için devam edin. 5 dk sonra enjeksiyon, fareyi bir CO2 odaya yerleştirin ve ötenazi standart işletim prosedürü (anahat kurumsal hayvan bakımı Komitesi tarafından) başlayıp. Yordamı nefes borusu zarar verir bu yana servikal çıkığı ötenazi aracı olarak kullanılmamalıdır.
- Bir kez fare ötenazi, laminar akış hood hazırlanması için özel/bir-media çözüm ile fare akciğerin üfleme başlar. Laminar akış başlık içinde steril pad ile bir çalışma alanı oluşturun. Bu yastık sterilize cihazlar, IV kateter, IV uzantısı küme ve yerçekimi perfüzyon aygıtlar ( tamamlayıcı şekil 1bakınız) yerleştirir.
- Fareyi sırt recumbancy getirin. Steril küçük makas ile göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için sternum dikkatle incelemek. Özel/bir-media çözümünü akciğer insufflate için kullanılan bu yana akciğer ponksiyon değil için dikkat ediniz.
- Her iki tarafta göğüs giriş geçmiş zaman göğüs kemiği anatomi, Trakea incelemek. Trakea uzak çevresindeki yumuşak doku dissekan tarafından maruz.
- Nefes borusu 20 gauge IV kateter ile cannulate. Gevşek cannulated Trakea etrafında steril akorduna dikiş kullanarak bir cerrahi düğüm.
- Bir IV uzantısı catheterized Trakea yerçekimi perfüzyon aparatı 10 mL şırınga ayarlanabilen iliştirin.
- Önceden ısıtılmış 37 oC özel (5 mL) ve bir-media (5 mL) 1:1 karışım içine birleştirmek. Sıvı özel/bir-media çözüm yerçekimi perfüzyon cihazın 10 mL şırınga dökün. Önce üfleme özel/bir-media çözüm ile akciğer uzantısı küme tüm uzunluğu özel/bir-media, böylece yanlışlıkla üfleme hava ile akciğer örneklerinin inkâr ile hazır olun.
- Özel/bir-media çözüm akciğer akciğer tam insufflated dolduramazsınız.
- Akciğer tam olarak insufflated bir zamanlar kanül çıkarın ve nefes borusu ile agarase/bir-media çözüme kaçağı önlemek için cerrahi düğüm sıkıca bağla.
- Göğüs boşluğu üzerinden (Trakea, kalp ve akciğer) Yiğitlik dışarı incelemek için devam edin. Değil delik için dikkat çekmek veya akciğer yüzeyine zarar verebilir.
- Yer (belirli hiçbir yönde) yiğitlik PBS önceden soğutulmuş 30 ml 1 X kalem/strep ile desteklenmiş ve 20 dk kuvvetlendirmek özel/bir-media sağlar.
- İyi makas ve şekil 1A' gösterildiği gibi akciğer (3 x 1.5 mm) küçük parçalar koparıp cımbız kullanarak. Küçük akciğer dilimleri kolayca 2.5 X amacı istimal yansıması. Genellikle 4-10 dilim grubu başına deneysel koşul birden çok dilim kesebilir.
Not: her deney grubu için B-medyada önceden ıslatılmış bir 2 x 2 cm jelatin sünger içeren akciğer dilimleri ayrı bir kuyuya (6-şey plaka) yerleştirin. Medya iyi ücret miktarı 1,5 mL olmalıdır. Medya her 2-3 gün değiştirin. İlaç araştırmaları için medya/uyuşturucu değişen belirlenen kullanıcı sıklığıdır.
3. Widefield floresan görüntüleme akciğer dilimleri ve analiz
Not: widefield floresan için (3 x 1.5 x 1 mm) akciğer Bölüm 1 Resim 2.5 X amacı istimal sığabilmesi için görüntüleme, daha küçük dilimler kesilir.
Resim alma widefield floresan mikroskop Tarih:
- Akciğer dilimleri genellikle 0, 3, 7 ve 14 gün sonrası enjeksiyon görüntüsü. Biyolojik kabine steril ortamda dikkatle akciğer dilimleri aktarım jelatin sünger bir steril 35 mm cam alt çanak yuvarlak. Akciğer dilim üzerinden aşırı sıvı kapalı olarak fazla sıvı bir ayna olarak hareket ve tümör hücreleri Floresan ışık yansıtacak kurulamak için dikkat ediniz.
- Şekil 1A' tasvir benzer bir şekilde akciğer dilimleri düzenleyin. Her sütun farklı bir deneysel durumu temsil eder. Çapraz-akciğerleri cımbız ile kirletmek değil kendine iyi bak. % 70 etanol ile durulayın ve akciğer dilimleri başka bir deney grubu üzerinden tutmadan önce kurumasını bekleyin.
- Görüntüleme parametrelerini optimize etmek (yani. kazanç, ofset, pozlama zaman, binning) arka plan Akciğer doku (tedavi edilmezse araç) denetiminde ve floresan tümör hücreleri arasında en iyi kontrast sağlayan grup. Kontrol grubundan aynı parametreler deneysel grupları görüntü için kullanın. TIFF görüntü formatında kaydedebilirsiniz.
- Bir ölçek başvurusu için aynı amacı bir mikrometre dijital bir resim çekmek.
- Akciğer auto-floresan zaman içerisinde değişen beri görüntü parametreleri denetim akciğerlere görüntüleme her oturum ayarlanması gerekir. Bir oturum için görüntüleme parametreleri mutlaka sonraki görüntüleme oturumlar için en uygun olmayabilir.
Görüntü analizi:
Not: Aşağıdaki görüntü işleme adımlarını ImageJ 1,51 h yazılım paketi 17ile yapılır.
- Bir görüntü dosyası ImageJ (şekil 3A) açın.
- Arka plan çıkarmak: işlem > arka plan çıkarmak > Rolling ball RADIUS (50 piksel başlamasıyla), "Işık arka plan" (şekil 3B) işaretini kaldırın.
- Resim 8-bit biçimine dönüştürme: Görüntü > türü > 8 - bit (şekil 3 c).
- Birimleri piksel olarak ayarlayın: Görüntü > Enter "Piksel" 1 "Piksel genişliği", "Piksel Yükseklik", "Voxel derinlik" uzunluğu birimi girin. Sonraki görüntülere uygulamak için "Global" onay kutusunu işaretleyin.
- Çokgen seçim aracını kullanarak, tüm akciğer dilim Şeklin anahattını ve toplam akciğer dilim alanının (piksel2) belirlemek. Bu değer yüzde tümör yükünü akciğerin hesaplamak için kullanılır.
- Eşik görüntü: Görüntü > ayar > eşik > "Varsayılan" ve "siyah-beyaz" vurgulamak > tümör hücrelerinin çoğunluğu doğru bir şekilde vurgulanmış şekilde eşik görüntü kaydırıcıyı kullanmak. "Uygula" tuşuna basarak bir siyah beyaz görüntü burada akciğer tüm siyah ve beyaz floresan lezyonlardir sonuçlanır (şekil 3D). İkinci kez "Uygula" tuşuna basarak tüm floresan yapıları şimdi siyah şekilleri (şekil 3E) nerede görüntü ters çevirmek.
- Miktar sayısını ve lezyonlar şeklinde:
Analiz > ölçümleri ayarla > kontrol "Alan". Tüm diğer kutuların.
Parçacıklar analiz > boyutu (piksel2): 0-Infinity ImageJ Numaralandırılacak şekiller aralığını temsil eder. Ampirik olarak gün 0 araç görüntüleri tek tümör hücresinde sayılan en küçük lezyon belirlemek. Bu tek tümör hücre alanının kalan görüntüler veri kümesi için alt sınır kullanın. Bu raporda sunulan çalışma için 11 piksel2 alt sınır ayarlanır. Video örnekte sunulan iş için 24 piksel2 alt sınır ayarlanır. "Döngü" aralığı 0-1 olarak bırakın. "Show" ayarlanabilir "Hiçbir şey". Alternatif olarak, "Göster" ve "Ana hatlarıyla" Seçili, tüm özetlenen şekillerin çizimi oluşturulur. "Göstermek-den sonuçlanmak" ayrı bir pencere açılır ölçümlerin denetleyin. İsteğe bağlı olarak, "yöneticisine Ekle" kutusunu kontrol sahip ilerisi için kaydedilebilir bir yatırım Getirisi Yöneticisi için sayısal şekiller kurtaracak. Tamam bastıktan sonra tüm numaralandırılmış şekillerin ve alan ölçüleri (şekil 3F) içeren bir "Sonuçlar" pencere açılır. - Kopyalayabilir ve veri "Sonuçlar" penceresinden bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz. O belirli akciğer dilim için metastatik lezyonlar tüm alanlarında özetlemek için Excel'de topla matematiksel işlevini kullanın. Akciğer dilim yüzde akciğer tümör yükünü değerlendirmek için metastatik lezyonlar alanlara göre akciğer dilim toplam yüzölçümü toplamı bölün. Bu parametre de açıklanan alan kesir (birA) denir Underwood 18tarafından daha fazla.
Akciğer tümör yükünü metastatik lezyon alanları/toplam akciğer dilim alanının toplamı = - Akciğer tümör yükünü kontrol grubu ve gruplar kalan akciğer bölümlere kalanında hesaplayın. Ortalama akciğer tümör yükünü grubu başına 0, 3, 7 ve 14 gün içinde arsa. Yüksek ve düşük metastatik insan OS hücre ilerici zaman noktalarda PuMA modelindeki büyüyen temsilcisi widefield floresan resimler (şekil 4A) gösterilir. Kat değiştirme (0 gün normalize) yüzde metastatik tümör yükünü zaman içinde gösterilen bir çizgi grafiği (şekil 4B) gösterilir.
4. confocal floresan görüntüleme PuMA modeli
Not: yansıması daha fazla ROIs için izin vermek için kesilmiş büyük akciğer dilimler (tam transvers kesitler, 1-2 mm kalınlığında) dışında confocal görüntüleme için doku işleme önceki bölümde buna benzer.
Akciğer parankimi ile DAR4M, etiketleme:
- Akciğer dilim içinde 10 μμM DAR4M (HBSS) olarak 37 ° C'de 45 dk için bırakın DAR4M hücreleri içinde reaktif azot türleri akciğer Etiketler.
- Taze HBSS akciğer dilimlerle, kuluçka 45 dk sonra yıkayın.
- Akciğer dilim bir 35 mm cam alt yuvarlak çanak ve confocal mikroskop görüntüsünde yerleştirin.
- Şekil 5 ' te gösterilen örnek görüntüler için görüntü parametreleri Tablo 5' te listelenen.
- İlgi bir bölge için bir Z-yığını elde etmek. Önerilen Z dilim kalınlığı Nyquist örnekleme için kullanın. Yeşil flüoresan OS hücreleri DAR4M etiketli akciğer dokusunda gösterilen bir 3B yığın temsilcisi bir film film 1 ve tamamlayıcı film 1sağlanır.
Şekil 5' te gösterilen örnek confocal görüntülerde görüntüleme oturumu terminal. Boyuna görüntüleme gerekiyorsa, yaşam için daha az duyarlilik olduğundan 2-Foton veya çoklu foton donanımlı confocal LSM mikroskop görüntüleme için kullanımı tavsiye edilir doku19,20.
Mito-RFP ifade MG63 hücrelerde PuMA modeli görüntüleme:
- PuMA iletişim kuralı olarak anahat içinde adım 1 ve 2 MG63 hücreleri mito-RFP yapı ifade kullanarak gerçekleştirin.
- Akciğer dilim bir 35 mm cam alt yuvarlak çanak ve confocal mikroskop görüntüsünde yerleştirin.
- Şekil 6 ' da gösterilen örnek görüntüler için görüntü parametreleri Tablo 6' da listelenir. Film 2 ve tamamlayıcı film 2yeşil flüoresan OS hücreleri floresan mitokondri sağlanan kırmızı ile gösterilen bir 3B yığın temsilcisi bir film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Düşük-büyütme widefield Floresans mikroskobu
İçin widefield floresan mikroskopi PuMA akciğer dilimleri temsilcisi görüntüler ve miktar veri şekil 2Cve şekil 4A ve Bgösterilir. Yüksek ve düşük metastatik hücre hatları için metastatik eğilimlerini ilerici zaman puan üzerinde görsel olarak görünür. Hiç HOS hücreleri büyümek değil, ancak MNNG hücreleri verimli bir şekilde Akciğer doku kolonize. Görüntü analizi, zamanla şekil 4Bgrafikte gösterildiği gibi değerlendirmek için nicel veri elde edilebilir. Edinme düşük büyütmede (2.5 X) tüm akciğer dilim bir görüntü yakalamak için tercih edilir. Bu yöntem büyük bir sayı PuMA dilimleri toplu görüntüleme izin verir.
Yüksek büyütme confocal Floresans mikroskobu
İçin confocal mikroskobu PuMA akciğer dilimleri temsil edici görüntüleri şekil 5' te gösterilmektedir. Tek tek eGFP ifade MG63 hücreler şekil 5A ' şekil 5BDAR4M floresan boya tarafından etiketli akciğer parankimi ile ilgili olarak görülebilir. Birleştirilen görüntüyü şekil 5Cve Yakınlaştırılmış bir gösterilir bir gemi floresan tümör hücresinde görüntüsünü şekil 5 diçinde gösterilir. Şekil 5C ve 5 D 3D film film 1 ve tamamlayıcı film 1, sırasıyla gösterilir. Mitokondri gösterildiği gibi confocal hücre altı yapıları görüntüleme şekil 6. Anahat tümör hücreleri şekil 6A' sitozolik eGFP-ifade verir ve RFP ile etiketli mitokondri şekil 6Bgösterilir. Birleştirilen görüntüyü şekil 6Cgörülür. Şekil 6C 3D film Movie 2 ve tamamlayıcı film 2gösterilir. Hücre altı yapıları gibi mitokondri görüntüleme organel Biyoloji metastatik OS hücrelerdeki çalışmaya floresan diğer etiketleri ile birleştirilebilir. Daha fazla etiket eklerken, lazer çizgileri ve emisyon filtreleri ilgi belirli fluorophore/floresan protein ile uyumlu olduğundan emin olun. Fluorophores/floresan proteinler olan uyarma ve emisyon spectra yakından örtüşmesi Imaging kaçının.
Resim 1 : Metastatik cascade gösteren diyagram. Metastatik art arda birkaç, hızı sınırlaması adıma bölünebilir. (1) metastatik tümör hücreleri birincil tümör siteden ayrılmadan ve yerel parankimi işgal etti; (2) tümör hücreleri intravasating kan/lenf damarları ve transit dolaşım içinde içine; (3) tümör hücre hapsi ikincil sitesinde; (4) tümör hücre ekstravazasyonu dışarı microvasculature ve ikincil site hayatta; (5) büyüme micrometastases içine; (6) büyüme içine bozukluklarına aleni metastatik tümörler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Widefield floresan ve confocal floresan mikroskopi platformlar kullanarak görüntüleme PuMA akciğer dilimler. (A) örnek PuMA dilimleri bir cam alt 35 mm tabak içinde gösterilir. (B) confocal mikroskop ekipman. (C) örnek düşük-büyütme resim eGFP-ifade OS hücrelerle bir PuMA dilim. Scalebar = 0.5 mm. (D) örnek confocal görüntüsünü bir bölgede bir PuMA dilim. Scalebar = 100 mikron. (*) Akciğer parankimi DAR4M tarafından kırmızı etiketli (bkz: iç metin) ve (eGFP ifade MG63 hücrelere gelin ∇). Scalebar = 30 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . ImageJ kullanarak bir PuMA dilim düşük-büyütme resim işleme. (A) orijinal PuMA resim. (B) arka plan çıkarma. (C) bir 8-bit görüntü dönüştürme. (D) floresan tümör hücreleri vurgulamak için eşik görüntü. (E) görüntü inversiyon. (F) numaralandırma ayrı şekiller ve şekil alanlarını miktar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Yüksek ve düşük metastatik insan OS büyüme hücreleri PuMA modelinde zaman içinde gösterilen düşük-büyütme seri fotoğraf. (A) seri görüntüleri son derece metastatik MNNG hücreleri ve düşük metastatik HOS hücreleri 0, 3, 7 ve 14 gün sonrası enjeksiyon gösterilir. Akciğer microenvironment HOS hücreleri aksine daha iyi büyümek mümkün MNNG hücrelerdir. Scalebar 1 mm. (B) = kat-change yüzde metastatik tümör yükünü MNNG ve HOS hücreler zamanla için çizgi grafikler gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Bir DAR4M etiketli PuMA akciğer dilim confocal mikroskobu. Bir temsilcisi confocal görüntü MG63 hücrelerde eGFP ifade PuMA Akciğer doku DAR4M ile Etiketlenmiş. (A) yeşil kanal eGFP ifade MG63 hücreleri (∇). (B) kırmızı kanalı reaktif nitrojen türler akciğer parankimi hücrelere bağlanması, DAR4M boya gösterilen. Akciğer parankimi boya vurgulamaktadır (#) ve bir kan damarı (*) benzeyen yapılar. Akciğer bölümdür PuMA kenarına (↓) gösterilir. (C) birleştirilmiş yeşil ve kırmızı görüntü. Scalebar = 100 mikron. (D) kesik çizgili beyaz kutusundan (C) bir Yakınlaştırılmış görüntü bir tümör hücre bir gemi içinde gösterir. Scalebar = 50 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : PuMA modeli osteosarkom hücrelerde mitokondri confocal mikroskobu. Bir temsilci confocal görüntü eGFP ifade MG63 hücrelerde mitokondri. (A) yeşil kanal eGFP ifade MG63 hücreleri (∇). (B) kırmızı kanalı mitokondri için (*) Lokalize RFP gösterilen. (C) birleştirilmiş yeşil ve kırmızı görüntü. Scalebar = 10 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Kültür medya | Tarifi |
| Medya (500 mL) tamamlandı | •440 mL DMEM |
| •50 mL FBS | |
| •5 mL 10 X kalem/strep çözüm (10000U/mL) | |
| •5 mL L-glutamin (200 mM) | |
| A-medya (250mL) | •177.58 mL steril su |
| •50 mL 10 X M-199 medya | |
| •15 mL % 7.5 sodyum bikarbonat çözüm | |
| 50 mM hydrocortizone •2.25 mL | |
| •125 mL 0,4 mg/ml retinol asetat (suda steril) | |
| •5 mL kalem/strep çözüm (10000U/mL) X 10 | |
| •50 mL 10mg/ml sığır insülin | |
| B-medya (500ml) | •427.6 mL steril su |
| •50 mL 10 X M-199 medya | |
| •15 mL % 7.5 sodyum bikarbonat çözüm | |
| 50 mM hydrocortizone •2.25 mL | |
| •125 mL 0,4 mg/ml retinol asetat (suda steril) | |
| •5 mL kalem/strep çözüm (10000U/mL) X 10 | |
| •50 mL 10mg/ml sığır insülin |
Tablo 1. Tam ortam için yemek tarifleri A-medya, B-medya. Hücre kültürü için yemek tarifleri ve medya PuMA tahlil için listelenir.
| Hücre kültür reaktifler | Açıklama | Katalog No | Şirket |
| MNNG-HOS | son derece metastatik OS hücre kültürünü | CRL-1547 | ATCC |
| HOS | kötü metastatik OS hücre kültürünü | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | son derece metastatik OS hücre kültürünü | N/A | Amy LeBlanc laboratuvar (ncı) |
| MG63 | kötü metastatik OS hücre kültürünü | CRL-1427 | ATCC |
| 10 X M199 medya | Bir media ve B-medya için temel medya | 11825015 | Thermofisher |
| Distile su (steril) | A-medya bileşen & | 15230-147 | Thermofisher |
| B-medya | |||
| %7.5 sodyum bikarbonat çözüm | A-medya bileşen & | 25080094 | Thermofisher |
| B-medya | |||
| Hydrocortizone | A-medya bileşen & | H6909 | Sigma-Alrich |
| B-medya | |||
| Retinol asetat-su çözünür | Bileşeni bir-media & B-medya | R0635 - 5MG | Sigma-Alrich |
| Penisilin/streptomisin 10 X konsantre (10000 U/ml) çözüm | A-medya bileşen & | 15140122 | Thermofisher |
| B-medya, medya tamamlandı | |||
| Sığır insülin çözüm (10mg/ml) | A-medya bileşen & | I0516 - 5ML | Sigma-Alrich |
| B-medya | |||
| DMEM, yüksek glikoz | Tam ortamının temel medya | 11965092 | Thermofisher |
| L-glutamin (200 mM) | Komple medya bileşeni | 25030081 | Thermofisher |
| Fetal sığır Serum | Komple medya bileşeni | 16000044 | Thermofisher |
| Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz | Hücre kültüründe kullanılan | 14190144 | Thermofisher |
| Hank tamponlu tuzlar çözüm, hiçbir kalsiyum, magnezyum yok, yok fenol red | Hücre pellet enjeksiyon önce resuspend için kullanılan | 14175095 | Thermofisher |
| Tripsin-EDTA (%0.25), fenol red | Hücre kültüründe kullanılan | 25200114 | Thermofisher |
| DAR4M | Akciğer parankimi etiketlemek için kullanılan | ALX-620-069-M001 | Enzo |
Tablo 2. Kültür reaktifler bir-media için B-medya, hücre ve medya tamamlandı. Bileşenleri medya tarifleri, reaktifler ve arabellekleri için katalog numarası ve şirket adıyla listelenir.
| Malzemeleri | Açıklama | Katalog No | Şirket |
| Zeiss 710 Confocal LSM | Dik LSM confocal mikroskop | N/A | Zeiss |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Ters LSM confocal mikroskop | N/A | Zeiss |
| SCID fareler | BAŞINI SALLA. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, kadın, Yaş 6-8 hafta | N/A | Charles River |
| Aspirasyon | Akciğer doku bölümleri için bir destek kullanılan | 59-9863 | Harvard aparatı |
| SeaPlaque özel | Akciğer üfleme sırasında kullanılan | 50100 | LONZA |
| 1 ml şırınga ile 27 ölçmek iğne | Kuyruk ven enjeksiyon için kullanılan | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| 10 ml şırınga | Akciğer üfleme için kullanılan | 309604 | BD |
| 20 gauge kateter | Akciğer üfleme sırasında kullanılan | SR-OX2032CA | TERUMO |
| Abbott IV uzantısı (30", steril) ayarla | Akciğer üfleme sırasında kullanılan | 8342 | Medisca |
| Alkol temizleme bezi | Kuyruk silme için enjeksiyon önce damar | 326895 | BD |
| Steril cerrahi eldiven | Asceptic fare akciğerler teslim | Boyutu ile değişir | Fisherscientific |
| 30 cm cetvel | Akciğer üfleme için kullanılan | Zımba | |
| Cetvel için destek stand | Akciğer üfleme için kullanılan | HS29022A | Pipette.com |
| 35 mm cam popolu kültür çanak | Akciğer dilimleri görüntüleme sırasında kullanılan | 81158 | Ibidi |
| Su geçirmez nem bariyeri ile emici koruyucu | Biyolojik hood steril çalışma alanında hizalamak için kullanılan | 56617-014 | VWR |
| Kirişe düz absorbe dikiş | Cannulated nefes borusu bağlamak için kullanılan | N/A | Braun |
Tablo 3. PuMA için malzemeler. PuMA iletişim kuralı için gerekli malzemeler ile katalog numarası ve şirket adı listelenir.
| Malzemeleri | Açıklama | Katalog No | Şirket |
| Mikro dissekan 3,5" düz keskin/keskin makas | Kesme akciğer bölümleri için | RS-5910 | Roboz |
| 4 uzun düz dişli "(10 cm) ekstra hassas 0,5 mm ipucu | Düzenleme/holding akciğer bölümleri için | RS-5132 | Roboz |
| 4"(10 cm) uzun tırtıklı hafif eğri 0.8mm ipucu | Düzenleme/holding akciğer bölümleri için | RS5135 | Roboz |
| Forseps giyinme başparmak; Tırtıklı; Hassas; 4.5" uzunluğu; 1.3 mm uç genişliği | Genel diseksiyon için | RS-8120 | Roboz |
| Forseps 4,5" tırtıklı 2.2 mm uç genişliği giyinme başparmak | Genel diseksiyon için | RS-8100 | Roboz |
| Ekstra ince mikro Dissecting makas 3,5" düz keskin/keskin, 20mm bıçak | Genel diseksiyon için | RS-5880 | Roboz |
| Knapp makas; Düz; Keskin-Blunt; 27mm bıçak uzunluğu; 4" Toplam uzunluk | Genel diseksiyon için | RS-5960 | Roboz |
Tablo 4. PuMA için cerrahi aletler. İletişim kuralında kullanılan çeşitli paslanmaz çelik aletleri ile katalog numarası ve şirket adı listelenir.
| Parametreleri | 488 lazer | 561 lazer | |
| Amaç | Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0,3 W (DIC) M27 | ||
| güç | % 2 | % 2 | |
| Piksel yaşamak | 1,61 | 1,61 | |
| Ortalama | 0 | 0 | |
| Yakınlaştırma | 1 | 1 | |
| Ana kazanç | 820 | 814 | |
| Dijital kazanç | 1 | 0.51 | |
| Dijital ofset | -4.5 | -9.24 | |
| İğne deliği | 51 | 57 | |
| Akort filtre | 496-553 | 570-618 | |
Tablo 5. PuMA DAR4M etiketli bölümlerinin confocal görüntüleme için parametreler. Geçerli kağıt confocal görüntüleri elde için kullanılan belirli görüntü parametreleri tabloda sunulmaktadır.
| Parametreleri | 488 lazer | 561 lazer | |
| Amaç | Planı-Apochromat 63 x / 1.40 DIC M27 petrol | ||
| güç | % 2 | % 2 | |
| Piksel yaşamak | 0,6 | 0,6 | |
| Ortalama | 2 (line) | 2 (line) | |
| Yakınlaştırma | 2.3 | 2.3 | |
| Ana kazanç | 449 | 390 | |
| Dijital kazanç | 1 | 1.23 | |
| Dijital ofset | 0 | 0 | |
| İğne deliği | 136 | 136 | |
| Akort filtre | 493-550 | 566-703 | |
Tablo 6. Mitokondri MG63 hücreleri PuMA bölümlerde confocal görüntüleme için parametreler. Geçerli kağıt confocal görüntüleri elde için kullanılan belirli görüntü parametreleri tabloda sunulmaktadır.
Tamamlayıcı şekil 1: yerçekimi perfüzyon aparatı. Yerçekimi perfüzyon aparatı ile 20 cm H20 hidrostatik basınç, sıvı özel/bir-media çözüm akciğer insufflate için kullanılır. Özel/bir-media çözüm (gösterilmez) cannulated Trakea ayarla bir IV uzantısı tarafından bağlı 10 mL şırınga içine dökülür. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Film 1: OS eGFP ifade bir 3B confocal z-yığın görüntü rotasyon hücreleri bir PuMA DAR4M etiketli akciğer dilimi. DAR4M (kırmızı kanalı) akciğer parankimi vurgulamak için kullanılır ve eGFP ifade MG63 hücreleri de görüldü (yeşil kanal) olabilir. Scalebar = 100 mikron. Bu hareket indirmek için buraya tıklayınız.
Movie 2: RFP etiketli mitokondri içinde OS eGFP ifade bir 3B confocal z-yığın görüntü rotasyon hücreleri PuMA modelinde. Mitokondri gibi hücre altı organelleri RFP (kırmızı kanalı) eGFP ifade MG63 hücrelerinde (yeşil kanal) PuMA modeli ile Etiketlenmiş gösterilir. Scalebar = 10 mikron. Bu hareket indirmek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı film 1: metastatik OS hücrede bir gemi akciğer Yakınlaştırılmış 3D film. Bir eGFP ifade MG63 hücre gemi akciğer microenvironment içinde gösterilir. Scalebar = 30 mikron. Bu hareket indirmek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Movie 2: mitokondri akciğer metastatik OS hücrede Yakınlaştırılmış 3D film. Mitokondri RFP ile etiketli akciğer microenvironment MG63 hücrelerde gösterilir. Scalebar = 5 mikron. Bu hareket indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aşağıdaki teknik makale akciğer kolonizasyon OS eğitim PuMA modeli pratik bazı yönlerini açıklar. Nerede araştırmacılar ekstra dikkat protokolündeki bazı önemli adımlar şunlardır:
a) nefes borusu cannulation. Nefes borusu çevresindeki kas ve bağ dokusu diseksiyon sırasında kolayca zarar görebilir. Buna ek olarak, iğne kateterin kolayca nefes borusu itti olabilir. Nasıl iğne eğimi Trakea kanül eklerken girdiği için dikkat edin.
b) Delme veya akciğer yüzeyine zarar. Akciğer kolayca delinmiş veya göğüs kemiği kaldırma ve göğüs boşluğu açığa makas diseksiyon ile bozuk. Göğüs boşluğu üzerinden Yiğitlik dışarı dissekan dikkatli olun. Delme veya akciğer yüzeyine zarar sıvı özel/bir-sızmaya media neden olur ve akciğer sönük.
c). görüntüleme sırasında akciğer bölümlerden aşırı medyayı çıkarın Aşırı sıvı medya akciğer bölümü çevreleyen mikroskop altında görüntülendiğinde "ayna" etkisi neden olabilir. Aşırı sıvı böylece görüntünün Floresans alanına abartarak tümör hücreleri Floresan ışık yansıtabilirsiniz. Aşırı medya sıvı kaldırılması bu artifakı görüntü engeller. Alternatif olarak, görüntü artifakı görüntüleri sonrası işleme sırasında kaldırılabilir.
d) yaşayan dokuların duyarlilik. Merkür ampul veya 1 fotonlu mikroskop lazer kullanırken, ışığa maruz zaman emin olun. Işık kaynağı yoğunluk/güç yüzdesi de azalır. Işık kaynağı için overexposure duyarlilik Akciğer doku için neden olabilir. Mikroskoplar ışık yayan diyot (LED) ile donatılmış veya boyuna görüntüleme çalışmaları sırasında daha az duyarlilik ürettikleri çünkü 2-Foton/multi-photon mikroskoplar ideal olacaktır.
PuMA modeli uyarlanmış ve birçok açıdan akciğer kolonizasyon sürecinin çalışmaya değiştirilebilir. Başka bir versiyonudur bu ex vivo yaklaşımın van den Bijgaart ve meslektaşları 21tarafından tanımlanır. Müdahale etkileri maskelenebilir beri çalışmalar için tümör hücre büyümesi geri 5 x 105 3 x 105 için enjekte hücre sayısı ölçekleme akciğer, gen knock-down veya anti-metastatik uyuşturucu aktivite etkilerini incelenmesi tavsiye edilir daha büyük bir hücre innoculum üstel büyüme sırasında. Çeşitli çalışmalarda PuMA model sürücüleri akciğer metastatik ilerleme 4,5,8,22,23,24eğitim için kullandık. Çeşitli floresan göstergesi boyalar veya floresan reporter genler için etiket tümör hücreleri hücre fizyolojisi veya gen ifade 8 akciğer microenvironment değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.
PuMA modelinin bir sınırlama uyumlu hücre satırlarını içerir. Bu tahlil ile uyumlu kurulan hücre hatları Mendoza ve iş arkadaşları 3 tarafından listelenir. Yüksek ve düşük metastatik osteosarkom hücre hatlarında clonally ilgili hücre hatları takip çiftlerini büyümek ve metastatik onların eğilimi PuMA modelindeki korumak tespit edilmiştir: insan MG63.3 & MG63 hücreleri, MNNG & 143B ve HOS hücreleri, fare K7M2 ve K12 hücreleri. Araştırmacılar ampirik olarak hücre hatları B-medyada canlı kalabilir olup olmadığını belirlemeniz gerekir. Göz önünde bulundurulacak başka bir akciğer dokusu-ebilmek var paraca desteklemek içinde vitrosınırlı süreyi kısıtlamadır. Akciğer dokusu hücresel bileşenleri bu süre 30 gün boyunca koruyabilirsiniz ve hücresel bileşenleri akciğerin ölmeye başlar. Bu nedenle tümör hücreleri ve akciğer stromal hücreler arasındaki etkileşimler eğitim 30 gün geçmemelidir.
PuMA modeli nasıl metastatik OS çalışmaya benzeri görülmemiş bir yöntem sağlar hücrelerin kolonize akciğer dokusu. PuMA modelinin en çarpıcı yönü olan vivo fenotipleri olmuştur başka bir yerde 25, karakterize birkaç düşük metastatik OS hücre satırı (HOS, MG63, K12), PuMA modelinde büyümek değil aslında gelir. Buna ek olarak, clonally ilgili son derece metastatik OS hücreleri (MNNG, MG63.3, K7M2) Akciğer doku vivo içinde25 kolonize ve PuMA modeli büyük bir eğilimi var. Bu düşük metastatik OS hücre hatları vivo içindebüyümesini engellemek hücresel ve ekstraselüler bileşenlerini akciğer microenvironment, hala korunur bu kan akımı olmamasına rağmen PuMA modelindeki göstermektedir. Başka bir deyişle, akciğer microenvironment PuMA modelinin hala düşük metastatik OS hücreleri akciğerde büyümesini engeller bir "seçim basınç" uygular. Gerçekten de, içinde eğitim yüksek metastatik OS hücrelerin büyümesine PuMA metastatik fenotip 4,5yeni moleküler sürücüleri belirlenmesinde yararlı olmuştur. Ayrıca, her iki PuMA modelindeki metastatik kapasite azalmaya dedi hedeflerin çok metastatik hücrelerdeki genetik aşağı modülasyon gösterildi ve içinde vivo 5. Aday Anti-metastatik ilaç araştırmaları, model konsantrasyon aralığı akciğer dokularında, metastatik akıbet azaltabilir belirlemek için kullanılabilir PuMA için hangi sırayla, sonra doğrulanmış vivo içindeolabilir.
Bu modelin gelecekteki uygulamalar ticari olarak mevcut floresan boyalar ve reporter genler bolluk OS metastaz ilerleme derin temel Biyoloji delve için yararlanmak. Örneğin, floresan boyalar 2', 7' - dichlorofluorescin diacetate veya dihydroethidium gibi tümör hücreleri PuMA modelindeki Redoks durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. Floresan reporter genler organel Biyoloji çalışma veya hangi sinyal yollar çok metastatik OS hücrelerde kolonizasyon sürecinde aktif hale gelir belirlemek için organizatörü etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tür yaklaşımlar bir ilaç tedavisi akciğer içinde büyüyen tümör hücreleri içinde faaliyet sahip olup olmadığını görmek için kullanılabilir. LED donanımlı mikroskoplar veya 2-Foton/multiphoton confocal mikroskoplar, kullanılabilir gibi daha az duyarlilik dokulara, üretmek floresan mikroskopi platformlar çalışma nasıl metastatik OS hücreler göç ve akciğer dokusu işgal. Ayrıca, tümör hücreleri ve akciğer stromal hücreler arasındaki yapışma etkileşimler floresan reporter genler ile izlenebilir.
Özetlemek gerekirse, geçerli kağıt ilk Mendoza ve iş arkadaşları 3tarafından geliştirilen PuMA modeli pratik yönlerini ele almaktadır. Düşük-büyütme, widefield floresan mikroskopi ve yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu yüksek ve düşük metastatik insan işletim sistemi hücrelerinin büyümesini değerlendirmek için kullanmanın bir örneği gösterilir. İletişim kuralı birkaç kritik adım anlatmıştık. Buna ek olarak, avantajları ve sınırlamalar PuMA modeli tartışılmıştır. Akciğer kolonizasyon sürecinin çalışmaya gelecekteki uygulamalar PuMA modelinin ortaya koymak ve bu model osteosarkom araştırma toplum içinde daha geniş bir kullanım olacak umulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
PuMA teknik eğitimde sağlanan Dr Arnulfo Mendoza teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, bu çalışma süresince kendi mikroskoplar kullanımını sağlamak için Drs. Chand Khanna, Susan Garfield (ncı/NIH) ve Sam Aparicio (BC Kanser Ajansı) kabul etmek istiyorum. Bu araştırma (kısmen) ulusal sağlık enstitüleri, kanser araştırmaları, Pediatrik Onkoloji şube Merkezi Intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir. M.M.L. ulusal kurumları, sağlık Intramural ziyaret adam Program tarafından (Ödülü 15335) destek verdi ve şu anda bir Joan Parker bursu metastaz araştırma tarafından desteklenmektedir. P.H.S. British Columbia kanser Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S.
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. Quantitative stereology. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
