Summary
Эта рукопись описывает zWEDGI (данио рерио Wounding и захвата устройство для роста и изображений), который является разобщенным устройство, предназначенное для ориентации и сдерживать данио рерио личинки. Конструкция позволяет хвост перерезка и долгосрочной коллекции изображений с высоким разрешением флуоресцентной микроскопии заживление и регенерацию.
Abstract
Данио рерио личинка — организм важной моделью для развития биологии и заживление ран. Кроме того данио рерио личинка является ценным системой для живой разрешением микроскопических изображений динамических биологических явлений в пространстве и времени с сотовой резолюции. Однако традиционный метод инкапсуляции агарозы для живых изображений могут препятствовать развития личинок и подроста тканей. Таким образом, эта рукопись описывает zWEDGI (данио рерио Wounding и захвата устройство для роста и изображений), который был разработан и изготовлены как функционально разобщенным устройство ориентации личинок для микроскопии высокого разрешения допуская хвостовой плавник перерезка в устройство и последующих безудержной хвост развития ре роста. Это устройство позволяет ранения и долгосрочное изображений при сохранении жизнеспособности. Учитывая, что форма zWEDGI 3D печати, настраиваемость его геометрии сделать его легко модифицирован для разнообразных данио рерио графических приложений. Кроме того zWEDGI предлагает многочисленные преимущества, такие как доступ к личинки во время экспериментов за ранение или для применения реагентов, параллельно ориентации несколько личинок для упорядоченной обработки изображений и повторного использования устройства.
Introduction
Регенеративной способностью личинок данио рерио данио рерио делают их организма идеальная модель для изучения ответ раны, а также исцеления и отрастания1,2,3,4. Доступ к массиву данио рерио трансгенных линий и данио рерио анатомические прозрачности дальше повышения их полезности в vivo исследований рану ответ события, а также долгосрочные восстановительные процессы4. Изучение этих биологических процессов, с помощью микроскопии высокого разрешения замедленной флуоресценции поэтому требует живой изображений данио рерио устройство, которое позволяет для высокой стабильности и минимальное движение личинок данио рерио при сохранении жизнеспособности. Это ключ, что устройство позволяет эффективного ранены во время заживления и регенерации происходит не зависит от устройства.
Стандартный живой изображений стабилизации метод встраивания личинка в агарозном во время живых изображений ограничивает рост и заживление регенерации5 и может увеличить уровень смертности, поскольку личинки начинают показывать знак сердца стресс и ткани некроза после четырех 4часов. Таким образом удаление агарозы из регионов интерес часто является необходимым для обеспечения нормального развития и регенерации6, подвергая личинки потенциальный ущерб как агарозы отрезать. Кроме того с агарозы, встраивание технику, пользователь должен ориентировать личинок в короткое время прежде чем агарозы затвердевает5,6,7. Быстро манипулирования личинка требует не только мастерство пользователя, также опасность повреждения личинок. Хотя были описаны методы стабилизации личинка для живых изображений обойти эти недостатки, такие как ребристых агар Уэллс3 или divets8, использование силиконовые вакуумные смазка для создания изображений камеры с трубопроводом ПВХ или других материалы6и вращения труб9, многие из этих методов являются труда интенсивный, грязный, часто не используемые повторно и не позволяют экологических манипуляций (наркотиков лечения, ранив и т.д.) после монтажа рыбы.
Таким образом zWEDGI устройство (рис. 1) была разработана для преодоления некоторых из недостатков, агар, крепление для долгосрочных живых изображений данио рерио личинок допуская манипуляции образца. ZWEDGI состоит из трех полуоткрытые разобщенным камер (рис. 1A), чтобы разрешить для загрузки, сдержанность, ранив и визуализация 2-4 дней после оплодотворения данио рерио личинок. Устройство изготовлено из полидиметилсилоксан (PDMS) и помещен на крышку выскальзования изображений блюдо дно стекла 60 мм. Дизайн, здесь представлены предназначен для заживления раны исследований, однако использование модульной конструкции и изготовление стандартных технологий сделать дизайн zWEDGI, изменяемые и поддаются различных экспериментальных процедур, особенно для процедур, требуется минимальная сдержанность с экспериментальной манипуляции и долгосрочное изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: для данио рерио личинки, которые являются 2-4 дней после оплодотворения (dpf) и следовать указаниям из животных ресурсов университета Висконсин-Мэдисон исследовательского центра был разработан дизайн базовый zWEDGI.
1. дизайн и 3D печать формы
- модель PDMS компонент устройства с желаемой геометрией и атрибуты в 3D моделирования программного обеспечения 5. Создайте сборку пустой формы и части PDMS и генерировать негативные формы для PDMS части, создав полость в плесени, соответствующий части PDSM. Сохраните форму как файл .stl для 3D печати ( Рисунок 2, шаг 1.1).
Примечание: Файл формата (.stl) стереолитографии плесень дизайна, представленные здесь ( рис. 1) доступен для загрузки на https://morgridge.org/designs/. - Печать формы с помощью фотополимерных 3D принтер ( Рисунок 2, шаг 1.2). Сделать несколько форм в одной печати, если это возможно, так что более чем одно устройство можно формовать с единого пакета PDMS.
Примечание: В приведенном примере был напечатан в высоком разрешении режиме с 0,075 мм луч диаметром и 0,05 мм толщина слоя, с помощью фотополимерных смолы 5.- Чистой формы с помощью тонкой кистью, денатурированный спирт в бутылку спрей и сжатый воздух аккуратно вымыть и удалить неотвержденного смолы. Удалять любой материал из регионов микроканальные.
- После лечения формы в УФ пост лечения аппарат для 60 мин с каждой стороны, как неотвержденных отставку является токсичным для данио рерио личинки 10.
- Песок стороне полости формы с 200 зернистости наждачную бумагу на ровной поверхности, до тех пор, пока все уплотнительные поверхности находятся в контакте с наждачной бумагой (Загрузка геометрии канала и mold периметра). Слегка песок 400 и 600 абразивной бумагой песка, постепенно, производить потолочные поверхности во всех геометрии обкладками ( Рисунок 2, шаг 1.3). Измерьте глубину полости после шлифования с циферблатный индикатор для проверки, что это близко к разработан глубины.
- Чистой формы и покрытие дисков (1 ¾ дюйма диаметр x ¼ дюйма толщиной боросиликатное стекло или акрил; один стакан покрытия за плесень), поместив в ультразвуковой очиститель заполнены с водой для 30 мин или промывка в проточной воде.
- Сушить с сжатым воздухом и очистите обе формы и охватывает с изопропиловым спиртом и отфильтрованных сжатого воздуха. Используйте чистую скамейке как место для изготовления устройств для сведения к минимуму загрязнения от воздушно-космического мусора. Отпуск, уборка плесени и стекла охватывает в чистой скамейке или покрыты Петри, до тех пор, пока требуется.
2. PDMS изготовление zWEDGI устройство
- делать PDMS путем лить 184 силиконовые эластомера полидиметилсилоксан (PDMS) в соотношении 5:1 (базы на активатор) в пластиковых стаканчиков. Смесь хорошо для 2 мин с палкой деревянные ремесло, помешивая геля над на себя, как месить хлеб. Для 5 формы используйте 10 g базы и 2 g активатора.
- Де газовой смеси в вакуумный сушильный шкаф для 25-45 мин до тех пор, пока все пузырьки исчезли.
- Заполнить полость каждого из 3D печатной формы с приблизительно 0,75 мл PDMS, используя шприц 10 мл до тех пор, пока форма слегка переполняется мениска ( Рисунок 2, шаг 2.1).
- Де газ заполненные формы для 45 мин для удаления дополнительных пузыри, которые могут быть сформированы при заполнении.
- Применить стекла Крышка диска на вершине PDMS заполненные формы, нажав на диск вниз под углом, чтобы предотвратить пузыри от захваченных ( рис. 2, шаг 2.2). Разрешить превышение PDMS высылается как обложку диска стекло применяется.
- Использование малых храповик зажим жестко придерживаться Обложка диска плесень.
Примечание: Это создает плоскую поверхность после PDMS лечится и производит через отверстия, где 3D печатной геометрии заподлицо с стекла Крышка выскальзования. В качестве альтернативы чтобы увеличить количество устройств, которые могут быть вылечены в одно время, построить несколько зажим устройство (например. Рисунок 2, шаг 2.3). - Вылечить PDMS устройство в зажимается плесени в 100 o C в духовке 90 мин ( Рисунок 2, шаг 2.4). Удаление формы из духовки и дайте ему остыть до тех пор, пока они могут быть легко обработаны. Если зажимное устройство металла, удалить плесень и обложка диска сборку из зажим для предотвращения металла от продолжения лечения PDMS из-за остаточного тепла.
Примечание: Устройство проще удалить из формы, в то время как все еще слегка теплой и не полностью вылечить. Однако как только форма будет удален из духовки и обложки диска удаляется, устройство может сидеть за пару дней, прежде чем приступать к распалубка. Если устройство demolded вскоре после удаления из печи полимеризации, поместите его в крытой Петри к минимуму загрязняющих веществ во время позволяя ей полностью вылечить.
3. ZWEDGI плазмы спекание стекла блюдо
- зажим формы, содержащей PDMS устройство в Верстачные тиски так что плесень ' s геометрии стоят вверх, параллельно на скамейке рабочей станции.
- Начала удалить устройство PDMS, выпустив PDMS язычок от плесени, с плоским наконечником пинцеты. Работа по периметру плесень пинцетом (такие как удаление торт из pan ( Рисунок 2, шаг 3.1)).
- Использования фильтрации сжатого воздуха и Пинцеты для осторожно потяните устройство из формы, держась за язычок и выдува воздуха под устройство. Работа медленно, позволяя воздух, чтобы помочь отдельным PDMS от плесени, принимая особого ухода с советами пинцет вокруг разделов тонкие туннеля.
- Место PDMS устройство вверх ногами на внутренней стороне крышки стекла дном блюдо так, что запретительный клинья туннель соприкасаются пластик ( Рисунок 2, 3.2 шаг).
- Место крышку блюдо с zWEDGI вверх вниз и соответствующий стекла дном блюдо в плазме более чистых с внутреннего стекла вверх ( рис. 2, шаг 3.3).
- Эвакуировать плазменной очистки камеры до тех пор, пока давление достигает 500 mTorr.
- Набор радиочастотного (RF) мощность до максимума. Подвергать устройство и блюдо для RF частоты для около 2 мин медленно де давление камере и вернуть устройство и блюдо для чистой комнаты Худ.
- Удалить устройство PDMS из блюдо крышкой. Переверните PDMS zWEDGI для правильной ориентации на стекле, поместив его внимательно на центр хорошо блюдо дно стекла ( рис. 2, шаг 3.4)
- с помощью заднего конца пинцетом, слегка надавите на PDMS устройство для обеспечения воздушных пузырьков не попали под. Приложите давление вокруг минуту геометрию микро каналы и зачищают PDMS к краям ( рис. 5 c).
Примечание: Полный контакт между PDMS и стеклом обеспечивает лучшее соблюдение от плазмы склеивание. ZWEDGI устройство может быть плазмы, тычковой на другие стекла дном блюдо форматов, таких как стекло дном 6-ну платe ( рис. 2 c). - Место крышку над устройства блюдо перед удалением из чистой комнате Худ.
Примечание: После того, как устройства были исправлены для стекла, протокол может быть приостановлена до тех пор, пока они были готовы к использованию.
- с помощью заднего конца пинцетом, слегка надавите на PDMS устройство для обеспечения воздушных пузырьков не попали под. Приложите давление вокруг минуту геометрию микро каналы и зачищают PDMS к краям ( рис. 5 c).
4. Подготовка и загрузка личинки
Примечание: Генеральной данио рерио животноводства было проведено за данио рерио книга, доступны онлайн на http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Как было описано ранее 1 были сохранены взрослых рыбок данио и эмбрионов. Дикого типа AB штамм был использован. Следовать за учреждение ’ s животное уход протокол для специфических относительно требований для визуализации живых личинок.
- Промыть каналы с минимум 100 мкл 70% этанола на канал, с помощью микропипеткой для полоскания через сдерживание туннеля. Удаление этанола и промыть 2 или 3 раза с двойной дистиллированной водой. Дайте высохнуть на воздухе.
- Заполнить каналы с обезжиренным молоком (в концентрации 1%, растворяется в воде) для 10 мин при комнатной температуре, чтобы свести к минимуму приверженность личинок coverslip стеклянной посуды. Затем осторожно опускайте прибор несколько раз в двойной дистиллированной воды для полоскания. Дайте высохнуть на воздухе дном.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Эта подготовка zWEDGI устройства может быть сделано несколько дней до использования. Магазина охватывают при комнатной температуре. - Подготовка 1% низких плавления агарозы (LMP), объединив 100 мкл 2% растаял LMP агарозы с 100 мкл 2 x Tricaine (0,4 мг/мл Tricaine - этил 3-аминобензоат) в E3 буфера 11 предварительно разогретую до 38 o C. поддерживать 1% агарозы/tricaine решение на 38 o C в блоке горячей предотвратить гелеобразующего.
Примечание: Для многофотонную микроскопии 11, используйте либо снимите пигментированной данио рерио варианты (например, Каспер 12) или поддерживать личинок в E3 содержащие 0,2 мм N-фенилтиомочевины, чтобы предотвратить образование пигмента 11 к минимуму поглощения вблизи инфракрасных волн пигмент.
Предупреждение: N-фенилтиомочевины является токсичным. Следовать за учреждение ' s правила утилизации. - Anesthetize личинок в E3 буфера содержащие 0,2 мг/мл tricaine (Tricaine/E3) 11. Подождите пока личинки неподвижно и не отвечают на прикосновение раздражитель.
- Предварительно Намочите каналы с нескольких микролитров Tricaine/E3.
- Выбрать вверх один личинка с помощью кончика пипетки широкие отверстия. Депонировать личинки на загрузку канала ( рис. 3A). С помощью кончика пипетки или аналогичный инструмент, Ориент личинка в камере загрузки, таким образом, что спинной стороне сталкивается прямее края грузового пространства и хвост лица направлении запретительных туннеля ( рис. 3B).
- Тщательно снять жидкости из ранив камеры, позволяя личинка поступать в запретительный туннеля ( рис. 3 c). Удалите большую часть жидкости при сохранении влаги вокруг личинок ( рис. 3D). Этот процесс может оказываться, наклоняя блюдо слегка к палате ранив.
- Место LMP агарозы 1% в Tricaine/E3 (~ 38 o C) над личинка ' s голова, заполнение грузового пространства ( Рисунок 3E). Разрешить агарозы для закрепления с личинки в правильном положении. Добавьте Tricaine/E3 ранив камеры при необходимости для поддержания гидратации. Повторите этот процесс оставшиеся 2 каналов для загрузки.
- Иглой шприца, осторожно удалите любые агарозы, которая просочилась через туннель запретительного в зале ранения ( Рисунок 3F). Добавьте дополнительные tricaine/E3, либо чуть более агарозы (для ранения, короткий срок изображений или изоляции лечение ране) или заполнить культуры блюдо (за долгосрочное изображений). Замените крышку культуры блюдо для предотвращения испарения. Личинки могут отражаться в этой точке (разматывать) или раненых.
5. Ранения и изображений личинки
- с помощью стерильным скальпель лезвие, разрез хвостовой плавник кзади хорда 11 в зале ранения ( Рисунок 3 G, H). При необходимости добавьте дополнительные tricaine/E3 и заменить крышку культуры блюдо.
Примечание: в качестве альтернативы, в зависимости от развития время окна интерес, личинки можно раненых, разрешено восстановить в E3 и поддерживается в инкубаторе (28,5 o C) до желаемого времени изображений, в какой-то момент они могут быть загружены в каналы как вышеописанные. - Установить zWEDGI устройство с наркотизированных личинок на инвертированным микроскопом в стадии вставки, которая приспособит блюдо дно стеклянной 60 мм. Найдите хвост личинка в верхнем большинство канале, вращающихся блюдо, как необходимо получить хвост в нужном положении. Изображения, необходимые для конкретного эксперимента.
Примечание: ZWEDGI широко применяется для высокого разрешения световой микроскопии, включая widefield флуоресценции и лазерной сканирующей микроскопии. Существует ряд параметров соображений при визуализации данио рерио личинок, но конкретные параметры визуализации инструмент, выборки и эксперимент зависимых. Здесь, личинок хвост был воспроизведен образ на настраиваемого построения multiphoton микроскопа 5 , 11 используя следующие параметры: 40 X долго рабочей расстояние воды погружение цель, 890 Нм лазер возбуждения, 445/20 нм фильтра выбросов и резолюции 512 x 512.
6. Конце эксперимента
- Удалить zWEDGI блюдо от Микроскоп. Усыпить личинки, поместив zWEDGI Ванна ледяной водой или по 4 o C на по крайней мере 20 мин и оценить отсутствие сердцебиения и циркуляцию.
Примечание: Поскольку личинки сохраняются в отдельных отсеков, личинки могут быть индивидуально восстановлены, осторожно потянув на агаре с щипцами или пипетки. Агар могут быть удалены из головы региона и личинка используется для дополнительных процедур, таких как фиксации для пятнать антитела или обработаны для извлечение RNA или протеина. - После удаления личинок и агар, очистить zWEDGI с этанолом и дистиллированной воды, как описано в шаге 4.1 и установить вверх дном воздух сухой. Магазина охватывают в прохладном, сухом месте. Повторно пальто с обезжиренным молоком (шаг 4.2), при необходимости до следующего использования.
Примечание: zWEDGIs может быть повторно использован несколько раз, до тех пор, пока PDMS начинает уходить стекла.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZWEDGI PDMS microfluidic устройство является устройством функционально разобщенным, предназначенные для размещения четырех основных функций (перечислены ниже), связанные с живой изображений хвостового плавника, ранив исцеления и волоски в zebrafish личинки. PDMS был выбран для изготовления zWEDGI, потому что это не только легко доступны и отраслевым стандартом для биосовместимости, но также хорошо работает в формы. Кроме того PDMS делает устройства многоразовые и пустота твердых или острых краев после того, как образуется устройства. ZWEDGI конкретно разрешает 1) Загрузка личинок в устройство, 2) сдержанность на правильную ориентацию для визуализации, 3) ранив хвостового плавника, и 4) микроскопических изображений, подробно описаны ниже.
Загрузка
ZWEDGI конструкция состоит из 3 каналов, каждый из которых предназначен для сдерживания одна личинка (Рисунок 1B). Для загрузки и первоначальное ориентации личинка открытых грузового пространства является шириной 3 мм (рис. 1A) для размещения большого отверстия пипеткой подсказка для напыления личинки (рис. 3A). Кроме того длины и ширины предоставляют достаточно места, чтобы разрешить последующие манипуляции личинка в правильной ориентации, с хвостом направлении запретительных туннеля и спинной стороне верхней (рис. 3B).
Сдержанность
После загрузки в канал личинка может быть Рисованные хвост первый в запретительный туннель путем удаления жидкости из ранив камеры или слегка сдвинуть на место с кончика пипетки или аналогичного инструмента (рис. 3 c). Воронкообразные геометрия загрузки камеры (рис. 1а), от 3 мм до 0,45 мм, руководства личинка в желаемой поперечной ориентации (рис. 3 c). Ориентация личинка на его стороне сдерживает хвост примерно параллельно с стекла дно тарелки для улучшения визуализации. В отличие от microfluidic приборы с использованием кремниевых пластин геометрия 3D печатной формы не нужно быть последовательным в z направлении. Таким образом туннель запретительных покрыты и конические в оси z, таким образом, что высота входа больше, чем выход от 0,5 мм до 0,3 мм (рис. 1B, изометрическая туннеля). Этот сужающийся облегчает руководством личинка и уплощение хвост к визуализации поверхности стекла. Эта функция устраняет необходимость для пользователя, чтобы ориентировать образца при затвердении агарозы.
Жидкость из грузового пространства (рис. 3D) удаляется и заменяется с низкой температурой плавления агарозы для стабилизации головку внутри канала, а хвост поддерживается безудержным в буфер в зале ранения (Рисунок 3E). Минимальный агарозы, что может пролиться через туннель запретительного легко могут быть удалены из ранив камеры (Рисунок 3F). Отсутствие агарозы в зале ранив позволяет безудержный рост и развитие хвостовой плавник5.
Ранение
После загрузки через туннель и голова, сдерживается агарозы личинка хвостового плавника доступен для перерезка, потому что она вдается в ранив камеру. Полукруга ранив камера смещается 1.9 мм от горизонтальная симметрия. Это позволяет лезвие скальпеля вставляемый чуть выше хвостового плавника, позволяя достаточное пространство для клинка быть обращено вниз через хвост, transecting хвостового плавника (Рисунок 3 g). Части широкий полукруг диаметром 7 мм происходит, где хвост ранен для размещения этого движения. Помимо позволяя пользователю раны личинка, этот разобщенным конструкция обеспечивает возможность для регионального применения соединений на хвост региона5. Эта уникальная особенность полу изоляции позволит для локализованных тестирования воздействия различных препаратов, химических или биологических агентов на процесс заживления.
Обработка изображений
Устройство zWEDGI стремится разрешить высоким разрешением свет микроскопии изображений данио рерио хвостового плавника, беспрепятственно встраивая агарозы. По этой причине устройство PDMS приклеенная к коммерчески доступных стекла дно блюдо, предоставлять оптическое качество поверхности для микроскопии с использованием высокой NA линзы. Здесь мы представляем изображения с помощью multiphoton микроскопии для второй гармоники (SHG) изображений волокон коллагена в хвостовой плавник, чтобы проиллюстрировать возможности обработки изображений zWEDGI. Однако zWEDGI может применяться для других методов световой микроскопии, например конфокальная микроскопия, используя конфигурацию стадии с инвертированным микроскопом. С zWEDGI, в отличие от метода агарозы встраивания с последующим удалением хвостовой плавник легко быть imaged в устройства до ранения (рис. 4A), раненых внутри устройства, затем сразу же вернулся в микроскоп для после раны изображения (рис. 4B-E). Предыдущие исследования выявили изменения в Организации коллагеновые волокна во время процесса заживления раны, с помощью ГСП. 13 ГСП может использоваться для обнаружения определенных видов упорядоченных структур, включая фибриллярного коллагена, без использования экзогенных этикетки. 14 изображения, качество жизни хвостовой плавники, imaged в zWEDGI был похож на которые получены в фиксированных ткани5 но zWEDGI обеспечивает ряд преимуществ. Самое главное хвостовой плавник исцеления и отрастания началом беспрепятственный путем встраивания с личиночной выживания похож на личинки, выращенных безудержной5агарозы. Кроме того потому что были ранены может быть выполнена, пока личинка в устройство, до и после ранения изображения могут быть собраны на же хвостового плавника (рис. 4A). ZWEDGI позволяет коллекции 3 мерных данных с течением времени, обеспечивая более полное представление о динамических изменений, происходящих в структуре внеклеточного матрикса (рис. 4В). Показано здесь SHG волокна раны релаксации, в 3-х измерениях, после ранения в пределах zWEDGI. До ранения, ГСП обнаружил, что коллагеновые волокна излучать наружу от хорда кончик плавник, (Рисунок 4A). Вскоре после ранения расстояние между кончик контракт плавника и центр гоe плавник увеличивается с раной релаксации. 3D характер сбора данных позволяет пространственная реконструкция, с помощью программы рендеринга, например Imaris. Эти реконструкций и последующих вращению, иллюстрируют сокращение и расслабление плавника происходит не только в плоскости x y коллекции изображения (Рисунок 4 B, C, D), но и в направлении оси z (Рисунок 4 G-J, L-O, Q-T; Дополнительные фильмы 1, 2) как хвост сплющивает от вверх скручиваемость контракт государства. ZWEDGI может использоваться с другими визуализации формы течение более длительных периодов времени, таких как использование confocal микроскопии для изображения нейронов во время разработки хвостовой плавник над 24 h5. Потому что запретительный единиц устройства выстроены параллельно, таким образом устраняя необходимость поворота устройства при обнаружении личинки, Настройка микроскопом и перемещения между несколькими образцами для визуализации прост и может быть автоматизирован, чтобы собирать промежуток времени изображения данные нескольких личинок. Чтобы расширить количество выборок, которые могут быть образы, устройство zWEDGI PDMS могут быть помещены в другие форматы стекла дном, например 6-ну пластины (рис. 2 c).
Рисунок 1 : Окончательный дизайн схема (A) Схема генплана и измерения zWEDGI устройства, подчеркнув терминологии функционально разобщенным палат. (B) изометрическая проекция PDMS устройства удалены от плесени. (C) врезные показывает туннель, отметив изменения в вход и выход высот. (D) модель личинка сдержанными в устройстве. Рисунок изменен от ранее публиковать статьи5 с Перепечатка разрешения данио рерио журнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Изготовление схемы (A) Шаг 1 начинается с дизайн устройства плесени в 3D моделирования программного обеспечения (1.1), которое затем 3D печати (1.2). Формы являются УФ света вылечить и затем шлифуют и чистить так поднял геометрии имеют даже высота (1.3). Шаг 2 включает в себя заполнение формы с смешанными и дегазации PDMS (2.1) и применяя стеклянного диска над плесени на наклонной предотвратить перехват воздушных пузырьков в устройстве PDMS (2.2). Стекла и плесень зажат вместе (2.3) для лечения в духовке на 100oC для по крайней мере час (2.4). Шаг 3 использует отфильтрованного воздуха и телевизором с плоским наконечником пинцеты для удаления устройства PDMS от плесени (3.1). Устройство помещается на верхней крышке изображений блюдо (3.2) и лечение плазмы (3.3), вместе с нижней стекла, чтобы позволить PDMS придерживаться стекла дно блюдо (3.4). (B) готовой zWEDGI устройство тычковой в блюдо дно стекла и готовых изображений. (C) несколько zWEDGI устройства могут быть размещены в 6-ну дно стеклянной пластины для изображения многие личинки же эксперимента. Рисунок изменен от ранее публиковать статьи5 с Перепечатка разрешения данио рерио журнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Загрузка и ранив личинка в zWEDGI (A) Личинка загружается в камере загрузки, с помощью пипетки широкий отверстия. (B) личинка ориентирован с спинной стороне против плоская часть загрузки камеры воронка и хвост сторону запретительного туннеля. (C) с помощью всасывания от кончика пипетки провел на входе ранив камере, личинка рисуется в туннель, поместив его в правильной ориентации для воображения. (D) жидкость удаляется из грузового пространства для проведения (E) добавлением агарозы вокруг головы региона для стабилизации личинка. Агарозы является окрашен в красный цвет здесь только для демонстрационных целей. Минимальная агарозы просачивается в зале ранения и может быть легко удалена, как показано в (F). (G) к ране, когда личинка сдержан в канале, лезвие скальпеля вставляется выше личинка и нарезанный вниз через хвостового плавника, кзади хорда. (H) личинка теперь готов к пост рану изображения. Масштаб бар (A-H) = 1 мм; Масштаб бар (F) = 1 мм; Масштаб бар (G) = 1 мм. рисунок от ранее публиковать статьи5 с Перепечатка разрешения данио рерио журнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : 3D multiphoton Замедленная съемка изображений SHG волокон в хвостовой плавник данио рерио, до и после ранения, в zWEDGI. ZWEDGI конструкция обеспечивает возможность для отображения с высоким разрешением, в этом случае SHG волокна организации предыдущих (предварительно ранение) и после хвостовой плавник перерезка (после раны). Данные были собраны как z стеки интервалы 4 мин. (A-E) показывает SHG волокон в хвостовой плавник как проекция z стеки, до и после перерезка четырех интервалов. Z-проекция была выполнена с использованием ImageJ программного обеспечения. 15 t = 0 был началом изображений, примерно 20 мин после перерезка. Двойные стрелки указывают увеличение расстояние кончика края раны (короткие белые линии) относительно расположения Хорда (длинная белая линия) во время релаксации раны после первоначального сокращения. (F-J). Наклонена 3D реконструкция исходных данных. (K-O). Поверхности отрисовки наклонена 3D реконструкции, показано в F-J. (P-T). Вид поверхности рендеринга 3D-реконструкции, иллюстрирующие, как сокращение и расслабление происходят в 3-мерном пространстве, которое может быть оценена с эти данные собраны с использованием zWEDGI где хвостовой плавник не ограничивается агарозы. Масштаб бар (A-E) = 100 мкм; Масштаб бар (F-T) =100 микрон. 3D визуализации были проведены с использованием изображений программное обеспечение. Смотрите также дополнительные фильмы 1 и 2. Рисунок изменен от ранее публиковать статьи5 с Перепечатка разрешения данио рерио журнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Критические шаги zWEDGI изготовления (A) Для обеспечения форма не пузыри, или получить в ловушке в устройстве когда зажима на стеклянной пластинке, Дега После заполнения PDMS в формы и наклонной зажима стекла при его применении к PDMS в плесени. Кроме того чтобы предотвратить «мигание» PDMS над нагрузкой и ранив камеры, убедитесь, что песок в верхней части устройства тщательно, чтобы обеспечить поверхностей геометрии при скрытой зажима на стекле. (B) когда устройство достаточно вылечить в духовке, воздушные карманы между PDMS и плесень указывают, что устройство будет легко удалить. Если устройство не легко удалить, это скорее всего объясняется недостаточное отверждение или температуры или плесень, сам не был адекватно УФ отверждения, ведет к загрязнению остаточных смолы PDMS. (C) при применении устройства в блюдо дно стекла после плазменной обработки, приложите легкое давление с заднего конца пинцетом, начиная в регионах туннеля и наружу к краю устройства. Если устройство не облигаций, а также обозначается воздушных карманов между устройством и стекла, продлить количество времени в плазме тычковый и убедитесь, что между поверхности PDMS и стекла нет пыли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные фильм 1: наклонена 3D поверхности рендеринга изображений multiphoton время перерыва SHG волокон в хвостовой плавник во время релаксации после ранения. SHG волокон в хвостовой плавник, отображаемого как zstacks со временем после ранения (начало фильма находится примерно 20 минут после ранения) в zWEDGI. Z-стеки были реконструированы и поверхности визуализируется с использованием изображений программное обеспечение. Хвост наклонена показать три размерность. Передней находится слева. Фильм соответствует неподвижные изображения в Рисунок 4 (K-O). Шкалы бар = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать фильм.
Дополнительные фильм 2: вид сбоку 3D поверхности рендеринга изображений multiphoton время перерыва SHG волокон в хвостовой плавник во время релаксации после ранения. SHG волокон в хвостовой плавник, отображаемого как zstacks со временем после ранения (начало фильма находится примерно 20 минут после ранения) в zWEDGI. Z-стеки были реконструированы и поверхности визуализируется с использованием изображений программное обеспечение. Вид сбоку показан подчеркнуть захват динамического изменения в оси z. Передней находится слева. Фильм соответствует неподвижные изображения в Рисунок 4 (P-T). Шкалы бар = 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать фильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Устройство zWEDGI предназначен для захвата 3D Замедленная съемка изображений путем стабилизации и ориентации рыбы в пределах небольшой рабочее расстояние объектив высокого разрешения Микроскоп. Выполняя эти спецификации, это также улучшение над традиционными агар основе подготовки для живых изображений. При изготовлении zWEDGI, которая, если не сделали правильно, может привести к дефектных устройств есть три важнейшие шаги (см. ниже):
PDMS подготовка (Рисунок 5A)
Чтобы предотвратить пузыри, Дега формы после того, как была добавлена PDMS. Убедитесь, что все пузыри были ликвидированы после дегазации и обратить пристальное внимание на применение стеклянного диска. Стеклянный диск должен быть применен на наклонной обеспечить, что воздух не будучи удерживается под и внутри PDMS. Пыль может быть проблемой в большинстве этапов процесса. Для предотвращения пыли, завершайте каждый шаг очистки тщательно и хранить части в чистой капот между шагами. Проверьте пресс-формы для избытков смолы, которая может создать шероховатую поверхность до УФ отверждения. При шлифовании, убедитесь, что песок бумаги контактов, которые все геометрии, чтобы обеспечить, что все поверхности являются флеш (рис. 2, шаг 1.3). Всегда очищайте с изопропиловым спиртом и воздуха прямо перед заполнением формы с PDMS. При сжимая дополнительных PDMS из формы, убедитесь, что зажимы плотно удерживайте плесень и стеклянные покрытия вместе (Рисунок 2, шаг 2.3).
Удаление устройства из плесени (Рисунок 5B)
Убедитесь, что печь находится по крайней мере 100 o C и время отверждения — по крайней мере 1-1,5 ч. Если PDMS достаточно не вылечить, это может быть трудно удалить из формы. Другие возможности для отказа удалить включают, не смешивая PDMS реагентов достаточно долго, используя неправильное соотношение базы и отвердителя или остатки смолы, оставшиеся в форму после 3D печати, который затем загрязняет PDMS. После удаления из печи воздушные карманы между устройством и плесени (Рисунок 5B) указывают, что устройство будет легко удаляется.
Приверженность PDMS прозрачным дном блюдо (рис. 5 c)
Низкой приверженности к стеклянную посуду может привести от пыли, рассогласование или недостаточная длина плазменной обработки. При размещении устройства на стекло, наконечник блюдо в угол и центр PDMS на стекло круг, убедившись, что он не коснуться края колодца. Если устройство не прилипает, аккуратно нажмите устройство на стеклянные скольжения с заднего конца пинцетом, начало в регионе деликатный туннеля и нажав наружу к краям. Если устройство по-прежнему не соответствуют, эксперимент, увеличивая время в плазме пылесос с шагом в одну минуту.
В то время как личинки могут отражаться в устройство для непродолжительного времени (минут) без использования агар, для целей долгосрочного жить изображений регионе хвостового плавника, агар помещается на голове в камере загрузки после того, как рыба была загружена. Хотя это применение агар, как представляется, не влияют на ранозаживляющее ответ или жизнеспособности личинки5, это может повлиять на изучение более передней регионов личинок. Хотя мы имели возможность личинок изображения для до 60 h мы не рассмотрели ли жизнеспособность будет влияние с больше изображений раз. Кроме того особая конструкция, представленные здесь был оптимизирован для возраст 2-4 дней поста оплодотворение (dpf) личинки лежа на боку на хвост перерезка и ранозаживляющее изображений. Другие этапы развития, ориентации и экспериментальных протоколов может потребовать изменений в дизайн. Однако преднамеренное функциональную модульность дизайн делает его легко поддаются такие изменения.
Кроме того изготовление этого устройства требуется доступ к 3D-принтер и другие microfluidic материалов и оборудования, таких как PDMS и плазмы, пылесос, потенциально ограничение доступности устройства для некоторых пользователей. Однако этот метод изготовления формы был выбран с 3D возможности печати, а также изготовление микрофлюидика, становятся более распространенными на академических кампусах. Кроме того имеются поставщики услуг для 3D печати доступны, как технология быстро развивается и стоимость уменьшается принтеры.
Учитывая его разобщенным дизайн и функциональность, zWEDGI предлагает улучшения текущей техника для коллекции изображений промежуток времени с помощью встраивания агар. Во-первых агарозы не окружают регионе хвост zWEDGI, позволяя заживление и регенерацию прогресса раскованный пока выживание личинок в zWEDGI сопоставим с unembedded и внедренными элементами управления5. Во-вторых использование печати с высоким разрешением 3D для изготовления пресс-форм позволяет zWEDGI иметь уникальный наклонные геометрии сориентироваться личинка в трех измерениях относительно плоскости изображения. Это устраняет зависимость от времени манипулирования личинок для правильной ориентации как агар затвердевает. Третьим важным преимуществом zWEDGI дизайн является открытой камерой дизайн, позволяет хвост и голову регионов для быть доступной для экспериментальных манипуляций. Это представляет особый интерес для заживления исследования, но это также делает zWEDGI потенциально полезным инструментом для других манипуляций. Полигамное дизайн устройства, Кроме того, предоставляет возможность для регионального применения соединений во время экспериментов. Устройство полу изолятов головы от хвост из-за диффузии дифференциального буфера (в зале ранение) и агарозы (в камере загрузки)5, позволяя применение соединений во время учебы заживления ран или других биологических процессы. Кроме того потому что личинки монтируются в отдельных каналов, отдельные личинки могут быть определены и получены после визуализации для дополнительной обработки, как очищения RNA или протеина и антитела маркировки. И наконец, потому, что устройство состоит из PDMS, который был прикреплен к стекла дном блюдо, устройство для повторного использования после удаления личинок.
Продвигаясь вперед, модульный дизайн и простота изготовления zWEDGI будет хорошо поддается модификации для изменения функциональности. В настоящее время составлявшем геометрии строятся специально для ранения и изображений экспериментов описанных, придав ему широкое применение для живых изображений заживление ран. Однако личинка лежит непосредственно на стекло, таким образом, чтобы не материала (т.е. PDMS), который может помешать с работой с образами, существует между личинка и изображений поверхности. Таким образом другие регионы личинок, такие как ствол, ипеLD быть доступны для обработки изображений. Кроме того дизайн 3D печатной формы zWEDGI, легко могут быть изменены для размещения других этапах своего развития, различными ориентациями личинка и разнообразными процедурами. Эти атрибуты таким образом делают его ценным инструментом для захвата микроскопии промежуток времени событий в различных масштабах времени. Использование других форматов блюдо дно стекла может позволить для больших устройств PDMS и пространство для более каналов. Учитывая повышение доступности для 3D печати методы изготовления и последующего легкость модификации для различных протоколов для экспериментальных работ, zWEDGI может оказаться мощным инструментом в области живых изображений микроскопия высокого разрешения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать первичный проект из Morgridge института для финансирования исследований и лаборатории для оптических и вычислительной аппаратуры. Мы также признаем, что финансирование из низ # R01GM102924 (AH и Кве). KH, JMS, RS, Ай и Кве задуман и разработан исследования. KH и JMS исполнил все эксперименты с поддержкой из DL, КП и RS. KH, JS, RS, Ай и Кве способствовали написания манускрипта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
