Summary
Questo manoscritto descrive la zWEDGI (zebrafish ferire e dispositivo di allettamento per la crescita e la formazione immagine), che è un dispositivo compartimenti progettato per orientare e trattenere le larve di zebrafish. Il design permette di coda transection e a lungo termine raccolta di immagini di microscopia fluorescente ad alta risoluzione di guarigione delle ferite e la rigenerazione.
Abstract
La larva di pesce zebra è un importante organismo modello per biologia inerente allo sviluppo e per la guarigione della ferita. Ulteriormente, la larva di pesce zebra è un prezioso sistema per live imaging ad alta risoluzione microscopica di fenomeni biologici dinamici nello spazio e nel tempo con cellulare ad alta risoluzione. Tuttavia, il metodo tradizionale di incapsulamento di agarosio per live imaging può ostacolare lo sviluppo larvale e la ricrescita del tessuto. Di conseguenza, questo manoscritto descrive la zWEDGI (zebrafish ferire e dispositivo di allettamento per la crescita e la formazione immagine), che è stato progettato e fabbricato come un dispositivo funzionalmente suddiviso in compartimenti per orientare le larve per microscopia ad alta risoluzione permettendo transection pinna caudale all'interno del dispositivo e lo sviluppo successivo coda sfrenato e ricrescita. Questo dispositivo permette di ferimento e a lungo termine imaging mantenendo attuabilità. Dato che la muffa di zWEDGI è stampato in 3D, la possibilità di personalizzazione delle sue geometrie lo rendono facilmente modificati per applicazioni di imaging di zebrafish diversificata. Inoltre, il zWEDGI offre che numerosi vantaggi, quali l'accesso alla larva durante la sperimentazione per ferire o per l'applicazione dei reagenti, parallelo orientamento delle larve multiple per l'imaging snella e riusabilità del dispositivo.
Introduction
La capacità rigenerativa delle larve di zebrafish rerio del Danio li rendono un organismo modello ideale per esaminare la risposta di ferita così come la guarigione e la ricrescita1,2,3,4. Accesso a una serie di linee di zebrafish transgenici e trasparenza anatomica di zebrafish ulteriormente migliorare la loro utilità per gli studi in vivo di ferita risposta eventi, nonché a più lungo termine i processi rigenerativi4. Studio di questi processi biologici mediante microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione di time-lapse pertanto richiede un dispositivo di zebrafish imaging live che consente un'elevata stabilità e minimo movimento della larva zebrafish mantenendo attuabilità. È fondamentale che il dispositivo consente ferendo efficace durante la guarigione e rigenerazione verificarsi inalterato dal dispositivo.
Il metodo di stabilizzazione imaging live standard di incorporare la larva in agarosio durante la formazione immagine diretta limita la crescita e rigenerazione5 di ferita e può aumentare i tassi di mortalità, poiché le larve iniziano a mostrare il segno di necrosi cardiaca lo stress ed il tessuto dopo quattro ore4. Di conseguenza, rimozione di agarosio da regioni di interesse è spesso necessario per consentire il normale sviluppo e rigenerazione6, esponendo le larve alla potenziale danno come l'agarosio è tagliata via. Inoltre, con l'agarosio incorporamento tecnica, l'utente deve orientare le larve nel breve tempo prima l'agarosio si solidifica5,6,7. Rapidamente, manipolando la larva richiede non solo abilità dell'utente, si rischia anche di danni alla larva. Anche se sono stati descritti metodi per stabilizzare la larva per live imaging per ovviare a questi inconvenienti, come agar increspata pozzi3 o divets8, l'uso del vuoto in silicone ungere per creare una camera di imaging con tubazioni in PVC o altro materiali6e rotazione della tubazione9, molti di questi metodi sono labor intensive, disordinato, spesso non riutilizzabili e non consentono per manipolazione ambientale (trattamenti, ferimento di droga ecc.) dopo il pesce è stato montato.
Di conseguenza, il dispositivo zWEDGI (Figura 1) è stato progettato per superare alcuni degli svantaggi di agar di montaggio per l'imaging dal vivo a lungo termine delle larve di zebrafish pur consentendo la manipolazione del campione. Il zWEDGI è costituito da tre alloggiamenti compartimenti semi-aperte (Figura 1A) per consentire per caricamento, moderazione, ferendo e imaging delle larve di zebrafish post-fertilizzazione di 2-4 giorni. Il dispositivo è fabbricato da polidimetilsilossano (PDMS) e inserito il vetrino coprioggetto di un imaging piatto fondo vetro 60 mm. Il progetto qui presentato è stato inteso per gli studi di guarigione della ferita, tuttavia l'uso di un design modulare e tecnologie di fabbricazione standard rendono il design di zWEDGI modificabile e suscettibili di una varietà di procedure sperimentali, soprattutto per le procedure che richiede minima moderazione con manipolazione sperimentale e la formazione immagine a lungo termine.
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Protocol
Nota: il disegno di base zWEDGI è stato formulato per le larve di zebrafish che sono post-fertilizzazione di 2-4 giorni (dpf) e seguono le linee guida del centro risorse animali ricerca Università del Wisconsin-Madison.
1. design e stampa 3D di stampi
- modello il PDMS componente del dispositivo con geometrie desiderate e attributi in un software 5 di modellazione 3D. Creare un assembly di uno stampo in bianco e la parte PDMS e generare uno stampo negativo per la parte PDMS creando una cavità nello stampo corrispondente alla parte PDSM. Salvare la muffa come un file. STL per la stampa 3D ( Figura 2, passaggio 1.1).
Nota: Un file di formato (. STL) stereolitografia della progettazione dello stampo qui presentato ( Figura 1) è disponibile per il download a https://morgridge.org/designs/. - Stampa stampi utilizzando una stampante 3D di fotopolimero ( Figura 2, punto 1.2). Fare stampi multipli in una sola stampa, se possibile, così più di un dispositivo può essere modellato con una singola partita di PDMS.
Nota: Nell'esempio mostrato è stato stampato in modalità Hi-Res con un 0,075 mm larghezza diametro e 0,05 mm spessore dello strato, utilizzando fotopolimero resina 5.- Stampi pulita utilizzando un pennello fine, alcool denaturato in un flacone spray e aria compressa a delicatamente la macchia e rimuovere la resina non polimerizzata. Rimuovere qualsiasi materiale dalle regioni microchannel.
- Post-curare gli stampi in un apparato di cura post UV per 60 minuti su ogni lato, come le dimissioni non polimerizzata sono tossica per le larve di zebrafish 10.
- Lato cavità dello stampo con carta abrasiva di grana 200 su una superficie piana di sabbia fino a quando tutte le superfici di tenuta sono a contatto con la carta vetrata (caricamento canale geometrie e perimetro di muffa). Raschiare leggermente con carta abrasiva sabbia 400 e 600, progressivamente, per produrre superfici a filo lisce in tutti i rivestimenti di geometria ( Figura 2, passaggio 1.3). Misurare la profondità della cavità dopo la levigatura con un comparatore per verificare che si trova vicino la profondità progettata.
- Pulire stampi e Covers (1 ¾ di pollice di diametro x spessore vetro di borosilicato ¼ di pollice o acrilico; un vetro coprire per muffa), inserendo in un ultrasuoni pulitore riempito d'acqua per 30 minuti o tramite risciacquo sotto l'acqua corrente.
- Asciugare con aria compressa e pulire entrambi gli stampi e copertine con alcol isopropilico e aria compressa filtrata. Utilizzare un banco pulito come un posto per fabbricare i dispositivi per ridurre al minimo la contaminazione da detriti nell'aria. Lasciare gli stampi puliti e vetro copre il banco pulito o una capsula di Petri coperto fino a quando necessario.
2. PDMS fabbricazione di dispositivo zWEDGI
- marca il PDMS da 184 versando in silicone elastomero polidimetilsilossano (PDMS) con un rapporto di 5:1 (base di attivatore) in un bicchiere di plastica. Mescolare bene per 2 min con un bastone di legno del mestiere, mescolando il gel sopra su se stesso, come impastare il pane. Per 5 stampi, usare 10 g di base e 2 g di attivatore.
- De-gas miscela in un essiccatore sotto vuoto per 25-45 min fino a quando tutte le bolle sono andate.
- Riempire la cavità di ciascuno degli stampi 3D stampati con circa 0,75 mL di PDMS utilizzando una siringa da 10mL, fino a quando lo stampo leggermente trabocca di un menisco ( Figura 2, punto 2.1).
- De-gas riempiti stampi per 45 min rimuovere ulteriori bolle formatesi durante la compilazione.
- Applicare un disco di copertura di vetro sopra la muffa PDMS-riempita, premendo il disco ad un angolo per evitare che le bolle vengano intrappolati ( Figura 2, punto 2.2). Consentire PDMS in eccesso essere espulso come il coperchio di vetro viene applicato. Morsetto a cricchetto piccolo
- uso per tenere il disco di copertura strettamente allo stampo.
Nota: Questo crea una superficie piana, una volta il PDMS è guarito e produce attraverso i fori dove le geometrie 3D stampate sono a filo con lo slittamento del coperchio di vetro. In alternativa, per aumentare il numero di dispositivi che possono essere curate in una sola volta, costruire un dispositivo multi-clamp (ad es. Figura 2, punto 2.3). - Curare il dispositivo PDMS negli stampi fissati a 100 o C in un forno per 90 min ( Figura 2, punto 2.4). Togliere gli stampi dal forno e lasciarlo raffreddare fino a quando possono essere facilmente gestiti. Se il dispositivo di bloccaggio è in metallo, rimuovere il gruppo di disco di stampo e coperchio dal morsetto per impedire che il metallo continuando a curare il PDMS a causa del calore residuo.
Nota: Il dispositivo è più facile da rimuovere dallo stampo mentre ancora leggermente caldo e non completamente curato. Tuttavia, una volta che la muffa è rimosso dal forno e viene rimosso il disco di copertura, il dispositivo può sedersi per un paio di giorni prima di procedere alla sformatura. Se il dispositivo è Estarre poco dopo la rimozione dal forno di trattamento, metterlo in un piatto coperto di petri per minimizzare contaminanti consentendole di curare completamente.
3. ZWEDGI al plasma-incollaggio vetro piatto
- morsetto lo stampo contenente il dispositivo PDMS in una morsa da banco affinché lo stampo ' geometrie s stanno affrontando fino, in parallelo al banco della stazione di lavoro.
- Start per rimuovere la periferica PDMS rilasciando la linguetta di estrazione PDMS dallo stampo con pinzette a punta piatta. Lavoro intorno al perimetro dello stampo con le pinzette (come la rimozione di una torta fuori una padella ( Figura 2, punto 3.1)).
- Utilizzare filtrato aria compressa e pinzette per estrarre delicatamente il dispositivo dallo stampo di trattenendo la linguetta di estrazione e soffiando aria sotto il dispositivo. Lavorare lentamente, permettendo all'aria di aiutare separato il PDMS dallo stampo, prestando particolare cura con la punta delle pinzette intorno alle sezioni sottili tunnel.
- Posizionare il dispositivo PDMS upside-down sulla parte interna della copertina di un piatto di vetro a fondo affinché i cunei di tunnel trattenente stanno toccando la plastica ( Figura 2, punto 3.2).
- Inserire il coperchio piatto con zWEDGI a testa in giù e il corrispondente piatto con fondo di vetro in un plasma cleaner con il vetro interno rivolto verso l'alto ( Figura 2, punto 3.3).
- Evacuare il plasma pulizia camera fino a quando la pressione raggiunge 500 mTorr.
- Set di radio frequenza (RF) potere di alta. Esporre il dispositivo e il piatto alla frequenza di RF per circa 2 min lentamente de-pressurizzare la camera e tornare il dispositivo e il piatto di un cappuccio di camera pulita.
- Rimuovere il dispositivo PDMS dalla parabola di copertura. Capovolgere il PDMS zWEDGI nell'orientamento corretto sul vetro posizionandolo con cura sul centro bene del piatto di fondo di vetro ( Figura 2, punto 3.4)
- utilizzando il back-end delle pinzette, premete leggermente il il PDMS dispositivo per garantire le bolle d'aria non sono intrappolati sotto. Applicare la pressione intorno al minuto geometrie dei canali micro e appianare il PDMS ai bordi ( Figura 5).
Nota: Contatto completo tra il vetro e il PDMS garantisce maggiore aderenza da incollaggio al plasma. Il dispositivo di zWEDGI può essere al plasma legato su altri formati di piatto col fondo di vetro, come un plat 6 pozzetti col fondo di vetroe ( Figura 2). - Mettere un coperchio sopra il piatto di dispositivo prima di togliere il cappuccio di camera pulita.
Nota: Una volta che i dispositivi sono stati fissati al vetro, il protocollo può essere sospesa fino a quando non sono pronti per l'uso.
- utilizzando il back-end delle pinzette, premete leggermente il il PDMS dispositivo per garantire le bolle d'aria non sono intrappolati sotto. Applicare la pressione intorno al minuto geometrie dei canali micro e appianare il PDMS ai bordi ( Figura 5).
4. Canale preparazione e caricamento delle larve
Nota: generale zebrafish zootecnica è stata condotta per il libro di Zebrafish, disponibile online presso http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Embrioni e zebrafish adulto sono stati mantenuti come descritto in precedenza 1. È stato utilizzato il ceppo selvaggio tipo AB. Seguire l'istituzione ’ s protocollo di cura degli animali per le specifiche riguardanti i requisiti per l'imaging di larve vive.
- Risciacquo i canali con un minimo di etanolo al 70% 100 µ l per ogni canale, utilizzando una micropipetta sciacqui il contenimento del tunnel. Rimuovere l'etanolo e risciacquo 2 o 3 volte con acqua distillata doppia. Lasciare asciugare all'aria.
- Riempire i canali con latte scremato (ad una concentrazione di 1% diluito in acqua) per 10 min a temperatura ambiente per ridurre al minimo l'aderenza delle larve al vetrino coprioggetti del piatto. Poi, delicatamente immergere il dispositivo più volte in doppia acqua distillata per risciacquare. Asciugare all'aria sottosopra.
Nota: Protocollo può essere messo in pausa qui. Questa preparazione del dispositivo di zWEDGI può essere fatto parecchi giorni prima di utilizzare. Archivio coperto a temperatura ambiente. - Preparare 1% punto di fusione basso dell'agarosi (LMP) combinando 100 µ l 2% sciolto LMP agarosio con 100 µ l 2 x Tricaine (0,4 mg/mL tricaina - aminobenzoate dell'etile 3) nella E3 buffer 11 pre-riscaldato a 38 o C. mantenere l'1% soluzione di agarosio/tricaina a 38 o C in un blocco caldo per prevenire gelificante.
Nota: Per microscopia multifotonica 11, utilizzare entrambi varianti non-pigmentate zebrafish (come casper 12) o mantenere le larve in E3 contenente 0,2 mM N-feniltiourea per impedire la formazione di pigmento 11 per minimizzare l'assorbimento di lunghezze d'onda infrarosse vicino dal pigmento.
Attenzione: N-feniltiourea è tossico. Seguire l'istituzione ' regole per lo smaltimento di s.
Larve di - Anesthetize in E3 tampone contenente 0,2 mg/mL tricaina (tricaina/E3) 11. Attendere fino a quando le larve sono immobili e non risponde ad uno stimolo di tocco.
- Pre-bagnato i canali con pochi microlitri di tricaina/E3.
- Pick su una singola larva utilizzando un puntale ampia orifizio. Depositare le larve nel canale di carico ( Figura 3A). Utilizzando una pipetta o attrezzo simile, orientare la larva nel vano di carico, tale che il lato dorsale verso il bordo dritto della camera di carico e le facce di coda verso il tunnel restrittivo ( Figura 3B).
- Estrarre delicatamente il liquido dalla camera di ferimento, permettendo la larva di fluire nel tunnel restrittivo ( Figura 3). Rimuovere la maggior parte del liquido, mantenendo l'umidità intorno la larva ( Figura 3D). Questo processo può essere aiutato inclinando il piatto leggermente verso la camera di ferimento.
- Posto LMP agarosio all'1% in tricaina/E3 (~ 38 o C) sopra la larva ' testa s, riempimento della camera di carico ( Figura 3E). Consentire l'agarosio solidificare con la larva nella posizione corretta. Aggiungere tricaina/E3 alla camera ferentesi come necessario per mantenere l'idratazione. Ripetere questo processo per i restanti 2 canali di caricamento.
- Utilizzando un ago di siringa, rimuovere con cura qualsiasi agarosio che filtrava attraverso il tunnel restrittivo nella camera di ferimento ( Figura 3F). Aggiungere ulteriori tricaina/E3 o appena sopra l'agarosio (per il ferimento, la formazione immagine a breve termine o ferita trattamento isolamento) o per riempire il piatto di cultura (per l'imaging a lungo termine). Sostituire il coperchio piatto cultura per evitare l'evaporazione. Le larve possono essere imaged a questo punto (i) o ferite.
5. Larve di ferimento e Imaging
- usando un bisturi sterile, transetto la pinna di coda posteriore per la notocorda 11 nella camera di ferimento ( Figura 3 G, H). Se necessario, aggiungere ulteriori tricaina/E3 e sostituire il coperchio piatto cultura.
Nota: In alternativa, a seconda della finestra dello sviluppo temporale di interesse, larve possono essere ferite, consentite di recuperare in E3 e mantenute in un incubatore (28,5 o C) fino al momento di formazione immagine desiderato, al punto che essi possono essere caricati in canali come descritto in precedenza. - Installare il dispositivo zWEDGI con anestetizzate larve su un microscopio invertito in un inserto di stadio che ospiterà il piatto di fondo di vetro 60 mm. Individuare la coda della larva nel canale più in alto, ruotando il piatto come necessaria per ottenere la coda nella posizione desiderata. Immagine come richiesto per l'esperimento specifico.
Nota: Il zWEDGI è ampiamente applicabile per microscopia ad alta risoluzione, tra cui widefield fluorescenza e microscopia a scansione laser. Ci sono una serie di considerazioni di parametro quando imaging larve di zebrafish, ma specifici parametri di imaging sono strumento, campione ed esperimento dipendente. Qui, la coda larvale era imaged su una compilazione personalizzata multifotonica microscopio 5 , 11, utilizzando i seguenti parametri: 40 X lungo lavoro distanza acqua obiettivo a immersione, 890 nm laser di eccitazione, filtro di emissione di 445/20 nm e risoluzione di 512 x 512.
6. Fine dell'esperimento
- rimuovere il piatto zWEDGI da microscopio. Le larve di eutanasia inserendo il zWEDGI acqua e ghiaccio o su 4 o C per almeno 20 min e valutare per assenza di battito cardiaco e la circolazione.
Nota: Poiché le larve sono mantenute in compartimenti separati, le larve possono essere singolarmente recuperate tirando delicatamente l'agar con forcipe o pipetta. L'agar può essere rimosso dalla regione della testa e la larva utilizzato per le procedure supplementari, come la fissazione per la macchiatura dell'anticorpo o trattati per l'estrazione di RNA o proteine. - a seguito di rimozione delle larve e agar, pulire il zWEDGI con etanolo e acqua distillata, come descritto al punto 4.1 e impostare capovolto all'aria secca. Archivio coperto in un luogo fresco e asciutto. Riverniciare con latte scremato (passo 4.2) come necessario prima dell'uso successivo.
Nota: zWEDGIs può essere riutilizzato più volte, fino a quando il PDMS comincia a staccarsi il vetro.
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Representative Results
Il dispositivo di microfluidica PDMS zWEDGI è un dispositivo funzionalmente suddiviso in compartimenti, progettato per ospitare quattro funzioni principali (elencate sotto) connesse con formazione immagine dal vivo della pinna caudale, ferendo la guarigione e la ricrescita nelle larve di zebrafish. PDMS è stato scelto per la fabbricazione di zWEDGI, perché non solo è prontamente disponibile e uno standard industriale per la biocompatibilità, ma funziona bene in stampi anche. Inoltre, PDMS rende il dispositivo riutilizzabile e privo di bordi duri o affilati una volta che il dispositivo è formato. Il zWEDGI permette in particolare 1) il caricamento delle larve nel dispositivo, 2) ritenuta a orientamento corretto per imaging, 3) ferendo della pinna caudale e la formazione immagine 4) al microscopio, descritto dettagliatamente di seguito.
Caricamento
Il design di zWEDGI è costituito da 3 canali, ciascuno progettato per trattenere una larva (Figura 1B). Per il carico e iniziale orientamento della larva, la camera di carico aperto è 3 mm di larghezza (Figura 1A) per ospitare un puntale di grande orifizio per depositare una larva (Figura 3A). Inoltre, la lunghezza e la larghezza a disposizione spazio sufficiente per consentire la successiva manipolazione della larva nell'orientamento corretto, con la coda verso il tunnel restrittivo e lato dorsale verso l'alto (Figura 3B).
Sistema di ritenuta
Una volta che la larva è stata caricata nel canale, può essere disegnato coda-prima nel tunnel restrittivo da rimozione di fluido dal vano di ferimento o spostare delicatamente in posizione con una pipetta o un attrezzo simile (Figura 3). La geometria a forma di imbuto della camera di carico (Figura 1A), da 3 mm a 0,45 mm, guide la larva in orientamento laterale desiderato (Figura 3). L'orientamento della larva sul suo lato trattiene la coda circa in parallelo con il fondo di vetro del piatto per una migliore imaging. A differenza di dispositivi microfluidici realizzati con wafer di silicio, le geometrie degli stampi 3D stampati non devono essere coerente nella direzione z. Pertanto, il tunnel restrittivo è coperto e conici nell'asse z tale che l'altezza della voce è più grande l'uscita, da 0,5 mm a 0,3 mm di altezza (Figura 1B, vista isometrica del tunnel). Questa si assottiglia facilita l'orientamento della larva e appiattimento della coda verso il vetro di copertura superficie di imaging. Questa funzionalità Elimina la necessità per l'utente per orientare il preparato mentre dell'agarosi sono indurimento.
Fluido viene rimosso dal vano di carico (Figura 3D) e viene sostituito con basso punto di fusione dell'agarosi per stabilizzare la testa all'interno del canale, mentre la coda è mantenuta sfrenato in tampone nella camera di ferimento (Figura 3E). L'agarosio minima che può fuoriuscire attraverso il tunnel restrittivo può essere rimosso facilmente dalla camera di ferimento (Figura 3F). La mancanza di agarosio in aula ferentesi permessi ricrescita sfrenato e sviluppo della pinna caudale5.
Ferendo
Una volta che la larva è stata caricata tramite il tunnel e la testa trattenuta da agarosio, la pinna caudale è disponibile per il transection perché protende verso la camera di ferimento. La camera di ferimento semi-cerchia è compensata 1,9 mm dalla simmetria orizzontale. In questo modo la lama del bisturi per essere inserito appena sopra la pinna caudale, lasciando sufficiente spazio per la lama da trarre verso il basso attraverso la coda, transecting la pinna caudale (Figura 3). La porzione più estesa del semicerchio di diametro 7 mm si verifica dove la coda è ferita per accogliere questa proposta. Oltre a consentire all'utente di ferita la larva, questo disegno compartimenti offre l'opportunità per applicazione regionale di composti per la regione di coda5. Questa caratteristica unica di semi-isolamento consentirebbe di test localizzata degli effetti di vari farmaci, sostanze chimiche o agenti biologici sul processo di guarigione arrotolato.
Di imaging
L'obiettivo del dispositivo zWEDGI è quello di permettere ad alta risoluzione formazione immagine di microscopia della pinna caudale zebrafish, non ostacolata da agarosio incorporamento di luce. Per questo motivo, il dispositivo PDMS è legato ad un piatto di fondo di vetro disponibili in commercio, per fornire una superficie di qualità ottica per microscopia usando alta NA lenti. Qui presentiamo immagini usando la microscopia multifotonica per seconda armonica imaging (SHG) delle fibre di collagene nella pinna caudale per illustrare le funzionalità di imaging della zWEDGI. Tuttavia, la zWEDGI può essere applicato ad altri metodi di microscopia chiara, come la microscopia confocale, che utilizza una configurazione di fase di microscopio invertito. Con il zWEDGI, a differenza del metodo di agarosio incorporamento con successiva rimozione, la pinna caudale può facilmente essere imaged nel dispositivo prima del ferimento (Figura 4A), ferito all'interno del dispositivo, quindi immediatamente restituito al microscopio per post-ferita Imaging (Figura 4B-E). Lavoro precedente identificato i cambiamenti nell'organizzazione della fibra collagene durante il processo di guarigione della ferita utilizzando SHG. 13 SHG può essere usato per rilevare alcuni tipi di strutture ordinate, tra cui collagene fibrillare, senza l'uso di etichette esogene. 14 immagine qualità delle pinne caudali vivente imaged nella zWEDGI era simile a quella ottenuta in tessuto fisso5 ma il zWEDGI fornisce una serie di vantaggi. La cosa più importante, la pinna caudale di guarigione e la ricrescita può procedere senza ostacoli di agarosio incorporamento con larvale sopravvivenza simile a quella delle larve coltivate sfrenato5. Ulteriormente, perché il ferimento può essere eseguito mentre la larva si trova nel dispositivo, immagini pre- e post-ferentesi possono essere raccolti sulla pinna caudale stessa (Figura 4A). Il zWEDGI permette la raccolta di dati dimensionali 3 nel corso del tempo, fornendo una visione più completa delle modifiche dinamiche che si verificano nella struttura della matrice extracellulare (Figura 4B). Qui illustrato è SHG relax avvolta in fibra, in 3 dimensioni, seguendo ferendo entro il zWEDGI. Prima del ferimento, SHG rilevato fibre di collagene si irradiano verso l'esterno dalla notocorda fino alla punta della pinna, (Figura 4A). Poco dopo che la distanza tra la punta della pinna contratta e il centro di thpinna e aumenta con il rilassamento della ferita. La natura 3D della raccolta consente la ricostruzione spaziale, utilizzando software di rendering come Imaris. Queste ricostruzioni e le opzioni di rotazione successiva, illustrano la contrazione e rilassamento della pinna si verifica non solo nel piano x y della collezione immagine (Figura 4 B, C, D), ma anche sull'asse z (Figura 4 G-J, L-O, Q-T; Film supplementare 1, 2) come la coda appiattisce dall'arricciatura verso l'alto dello stato contratto. Il zWEDGI può essere utilizzato con altre modalità di imaging per lunghi periodi di tempo, come l'uso della microscopia confocale ai neuroni di immagine durante lo sviluppo di pinna caudale oltre 24 h5. Perché unità restrittivo del dispositivo sono allineati di parallelo, eliminando così la necessità di ruotare il dispositivo durante l'individuazione le larve, impostazione il microscopio e lo spostamento tra più esemplare per l'imaging è semplice e può essere automatizzato per raccogliere dati di time-lapse immagine delle larve multiple. Per estendere il numero di campioni che possono essere imaged, il dispositivo di zWEDGI PDMS può essere posizionato in altri formati col fondo di vetro, come una piastra a 6 pozzetti (Figura 2).
Figura 1 : Progetto definitivo schema (A) Schema che mostra il layout generale e misurazioni del dispositivo zWEDGI, evidenziando i termini delle sezioni funzionalmente suddiviso in compartimenti. (B) vista isometrica del dispositivo PDMS come rimosso dallo stampo. (C) inserto Mostra tunnel, evidenziando il cambiamento nelle altezze di entrata e uscita. (D) modello della larva trattenuta nel dispositivo. Figura per volta da un precedentemente pubblicare articolo5 con il permesso di ristampa di Zebrafish Journal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Schema di montaggio (A) Passo 1 inizia con la progettazione dello stampo dispositivo in un software di modellazione 3D (1.1) che viene poi stampata 3D (1,2). Gli stampi sono luce UV curata e poi levigato e pulita così le geometrie rialzate hanno anche altezza (1,3). Passaggio 2 coinvolge riempire gli stampi con misto e degassato PDMS (2.1) e l'applicazione di un disco di vetro sopra lo stampo obliquamente per evitare bolle d'aria intrappolamento nel dispositivo PDMS (2.2). Il vetro e la muffa sono serrate insieme (2.3) per la polimerizzazione in forno a 100oC per almeno un'ora (2,4). Passaggio 3 utilizza aria filtrata e pinzette a punta piatta per rimuovere il dispositivo PDMS dallo stampo (3.1). Il dispositivo viene poi collocato nella parte superiore del coperchio piatto imaging (3.2) ed è trattato al plasma (3.3), insieme con il fondo di vetro, per consentire il PDMS ad aderire al vetro piatto fondo (3,4). (B) il dispositivo finito zWEDGI incollati in un piatto fondo di vetro e pronto per l'uso di formazione immagine. (C) più zWEDGI dispositivi possono essere posizionate in una piastra di vetro inferiore 6 pozzetti per molte larve nello stesso esperimento di immagine. Figura per volta da un precedentemente pubblicare articolo5 con il permesso di ristampa di Zebrafish Journal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Caricamento e ferendone della Larva in zWEDGI (A) Una larva è caricata nella camera di carico utilizzando una pipetta wide-orifizio. (B) la larva è orientata con il lato dorsale contro la parte piatta del caricamento dell'alloggiamento imbuto e coda verso il tunnel restrittivo. (C) mediante aspirazione dalla punta della pipetta tenuto presso l'ingresso alla camera di ferimento, la larva è disegnata nel tunnel, collocandolo nell'orientamento corretto per l'imaging. (D) il fluido viene rimosso dal vano di carico per consentire l'aggiunta di agarosio intorno alla regione testa per stabilizzare la larva (E) . Agarosio è di colore rosso qui solo a scopo dimostrativo. Agarosio minima perdite nella camera di ferimento e può essere facilmente rimosso come mostrato in (F). (G) per ferita una volta che la larva è trattenuta nel canale, un bisturi viene inserito sopra la larva e affettato giù attraverso la pinna caudale, posteriore alla notocorda. (H) la larva è ora pronta per l'imaging di alberino-ferita. Scala bar (A-H) = 1 mm; Scala bar (F) = 1 mm; Scala bar (G) = 1 mm. figura per volta da un precedentemente pubblicare articolo5 con il permesso di ristampa di Zebrafish Journal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Lasso di tempo di multiphoton 3D imaging delle fibre di SHG in zebrafish caudale, pre- e post-ferimento, nella zWEDGI. Il design di zWEDGI offre la possibilità per l'imaging ad alta risoluzione, in questo caso di organizzazione di fibra SHG precedente (pre-ferita) e quello successivo caudale fin transection (post-ferita). I dati sono stati raccolti come z-pile ad intervalli di 4 min. (A-E) Mostra SHG delle fibre nella pinna caudale come una proiezione degli z-stack, prima e alla post-transection quattro intervalli. Z-proiezione è stato effettuato utilizzando il software ImageJ. 15 t = 0 è stato l'inizio di imaging, post-transection a circa 20 min. Le doppie frecce indicano l'aumento della distanza della punta del bordo della ferita (breve linea bianca) relativo alla posizione della notocorda (lungo bianco linea) durante il rilassamento della ferita dopo la contrazione iniziale. (F-J). Ricostruzione 3D inclinata dei dati originali. (KO). Resa superficie della ricostruzione 3D inclinata indicata in F-J. (P-T). Vista laterale del rendering 3D ricostruzione superficiale, illustrando come la contrazione e rilassamento si verificano nello spazio 3-dimensionale, che può essere valutato con i dati raccolti utilizzando la zWEDGI dove la pinna caudale non è vincolata da agarosio. Scala bar (A-E) = 100 micron; Scala bar (F-T) =100 micron. Rendering 3D sono stati eseguiti utilizzando software di imaging. Vedi anche supplementare film 1 e 2. Figura per volta da un precedentemente pubblicare articolo5 con il permesso di ristampa di Zebrafish Journal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Fasi critiche di zWEDGI fabbricazione (A) Per non garantire nessuna forma di bolle o rimanere intrappolati nel dispositivo durante il bloccaggio del disco di vetro, degas dopo PDMS è stato compilato negli stampi e inclinano il bloccaggio vetro quando applicarlo per il PDMS nello stampo. Inoltre, per impedire PDMS "lampeggiante" sopra il caricamento e ferendone chambers, assicurarsi di sabbia la parte superiore del dispositivo accuratamente per assicurare le superfici delle geometrie sono a filo durante il serraggio sul vetro. (B) quando il dispositivo è sufficientemente guarito nel forno, sacche d'aria tra il PDMS e muffa indicano che il dispositivo sarà facile da rimuovere. Se il dispositivo non rimuove facilmente, è più probabile a causa di tempo di cura insufficiente o temperatura o stampo stesso non era adeguatamente UV-cured, con conseguente contaminazione residua resina del PDMS. (C) quando si applica il dispositivo per il piatto di fondo di vetro dopo trattamento al plasma, applicare una leggera pressione con il back-end di pinzette, a partire dalle regioni di tunnel e procedendo verso l'esterno verso il bordo del dispositivo. Se il dispositivo non si lega bene, come indicato dalle sacche d'aria tra il dispositivo e il vetro, la quantità di tempo nel bonder del plasma si allungano e garantire che non ci sia polvere tra la superficie di vetro e PDMS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare Movie 1: inclinato rendering 3D di superficie di immagini di lasso di tempo multifotonica delle fibre SHG nella pinna caudale durante il rilassamento post-ferimento. SHG delle fibre nella pinna caudale imaged come zstacks nel tempo dopo la ferita (inizio del film è circa 20 min dopo la ferita) nella zWEDGI. Z-stack sono state ricostruite e superficie eseguito il rendering utilizzando software di imaging. Coda inclinata per mostrare la tridimensionalità. Anteriore è a sinistra. Film corrisponde a immagini fisse in Figura 4 (KO). Barra della scala = 50 micron. Per favore clicca qui per scaricare il film.
Supplementare Movie 2: Vista laterale del rendering 3D di superficie di immagini di lasso di tempo multifotonica delle fibre SHG nella pinna caudale durante il rilassamento post-ferimento. SHG delle fibre nella pinna caudale imaged come zstacks nel tempo dopo la ferita (inizio del film è circa 20 min dopo la ferita) nella zWEDGI. Z-stack sono state ricostruite e superficie eseguito il rendering utilizzando software di imaging. Vista laterale indicato per enfatizzare la cattura di cambiamenti dinamici nell'asse z. Anteriore è a sinistra. Film corrisponde a immagini fisse in Figura 4 (P-T). Barra della scala = 40 micron. Per favore clicca qui per scaricare il film.
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Discussion
Lo scopo del dispositivo zWEDGI è quello di catturare il lasso di tempo 3D imaging stabilizzando e orientare il pesce dentro la piccola distanza di lavoro di un obiettivo del microscopio ad alta risoluzione. Durante l'incontro di queste specifiche di progettazione, è anche un miglioramento rispetto tradizionale preparazione a base di agar per imaging dal vivo. Ci sono tre fasi critiche (sotto) nella fabbricazione di zWEDGI, che, se non eseguite correttamente, possono provocare dispositivi difettosi:
Preparazione di PDMS (Figura 5A)
Per evitare le bolle, degas gli stampi dopo PDMS è stato aggiunto. Verificare che tutte le bolle sono state eliminate dopo degasaggio e prestare particolare attenzione all'applicazione del disco di vetro. Il disco di vetro deve essere applicato ad un'inclinazione per garantire che l'aria non è stato intercettato sotto e all'interno il PDMS. Polvere può essere un problema durante la maggior parte delle fasi del processo. Per evitare che la polvere, completare accuratamente ogni fase di pulizia e archiviare parti in una cappa pulita tra i passaggi. Verifica di stampi per la resina in eccesso che può creare una superficie ruvida prima della reticolazione UV. Quando levigatura, assicurarsi che i contatti di carta vetrata tutte le geometrie per garantire che tutte le superfici sono a filo (Figura 2, passaggio 1.3). Sempre pulito con alcol isopropilico e aria proprio prima di riempire gli stampi con PDMS. Quando stringendo il PDMS supplementare fuori dallo stampo, garantire i morsetti strettamente tenere lo stampo e copertura di vetro insieme (Figura 2, punto 2.3).
Dispositivo di rimozione dallo stampo (figura 5B)
Assicurarsi che il forno sia almeno 100 o C e il tempo di cura è almeno 1-1.5 h. Se il PDMS non è sufficientemente guarito, può essere difficile da rimuovere dallo stampo. Altre possibilità per la mancata rimozione includono non mescolare i reagenti PDMS abbastanza a lungo, utilizzando non corretti rapporti di base e induritore o avanzo resina rimanenti nello stampo dopo che poi contamina il PDMS di stampa 3D. Dopo averli tolti dal forno, sacche d'aria tra il dispositivo e stampo (figura 5B) indicano che il dispositivo sarà rimosso facilmente.
Aderenza del PDMS al piatto con fondo di vetro (Figura 5)
Scarsa aderenza al vetro piatto può derivare da polvere, disallineamento o insufficiente lunghezza del trattamento al plasma. Quando si posiziona il dispositivo sul vetro, punta il piatto ad angolo e centro il PDMS sul cerchio di vetro facendo attenzione che non tocchi i bordi del pozzo. Se il dispositivo non aderisce, premere delicatamente il dispositivo sullo slittamento di vetro con il back-end di pinzette, partire dalla regione del tunnel delicato e premendo verso l'esterno per i bordi. Se il dispositivo ancora non aderisce, sperimentare aumentando il tempo nel plasma pulitore con incrementi di un minuto.
Mentre le larve possono essere imaged nel dispositivo per brevi periodi di tempo (minuti) senza l'uso di agar, allo scopo di imaging vivere a lungo termine della regione caudale, agar è disposto sulla testa nella camera di caricamento dopo il pesce è stato caricato. Anche se questa applicazione di agar non sembra influenzare la risposta o la vitalità delle larve5di cicatrizzazione, questo potrebbe influire lo studio di altre regioni anteriori delle larve. Anche se siamo stati in grado di larve di immagine per fino a 60 h non abbiamo esaminato se la redditività sarebbe influenzato con tempi più lunghi di imaging. Inoltre, il particolare design qui presentato è stato ottimizzato per le larve di fertilizzazione (dpf) di età 2-4 giorni post sdraiato su un fianco per coda transection e formazione immagine di cicatrizzazione. Altri stadi di sviluppo, orientamenti e protocolli sperimentali potrebbero richiedere modifiche al design. Tuttavia, la modularità funzionale intenzionale del design lo rende facilmente suscettibili di tali alterazioni.
Inoltre, fabbricazione di questo dispositivo richiede l'accesso ad una stampante 3D e altri microfluidici materiali e attrezzature, quali PDMS e un plasma pulitore, potenzialmente limitando l'accessibilità del dispositivo per alcuni utenti. Tuttavia, questo metodo di fabbricazione della muffa è stato scelto poiché le funzionalità di stampa 3D, insieme a fabbricazione di microfluidica, stanno diventando sempre più prevalente nei campus accademico. Inoltre, ci sono fornitori di servizi di stampa disponibili, come la tecnologia si sviluppa rapidamente 3D e i costi delle diminuzioni di stampanti.
Dato il suo compartimenti design e funzionalità, il zWEDGI offre miglioramenti rispetto la tecnica attuale per la collezione di immagini di lasso di tempo utilizzando l'incorporamento di agar. In primo luogo, agarosio non circondano la regione di coda in zWEDGI, permettendo la guarigione della ferita e rigenerazione al progresso disinibito, mentre la sopravvivenza delle larve nella zWEDGI è paragonabile a controlli incorporati e non incorporati5. In secondo luogo, l'uso di stampa ad alta risoluzione 3D per fabbricare stampi permette la zWEDGI di avere geometrie sloping uniche per orientare la larva in tre dimensioni rispetto al piano di formazione immagine. Questa operazione rimuove la dipendenza dal tempo di manipolare le larve per un corretto orientamento come l'agar si indurisce. Un terzo importante beneficio del zWEDGI design è il design della camera aperta che permette la coda e la testa regioni per essere accessibile per manipolazione sperimentale. Questo è di particolare interesse per gli studi di cicatrizzazione, ma questo rende anche il zWEDGI uno strumento potenzialmente utile per altre manipolazioni. Il design compartimentale del dispositivo, inoltre, offre l'opportunità per applicazione regionale dei composti durante la sperimentazione. Gli semi-isolati di dispositivo la testa dalla coda a causa del differenziale di diffusione del buffer (nella camera di ferimento) e agarosio (nel vano di carico)5, permettendo l'applicazione di composti mentre studiava la guarigione della ferita o altri biologico processi. Inoltre, poiché le larve sono montate in canali separati, larva individuo possa essere identificata ed estratto post-imaging per ulteriori elaborazioni ad esempio Purificazione RNA o proteine o anticorpi etichettatura. E infine, poiché il dispositivo è costituito da PDMS che è stato incollato al vetro a fondo piatto, il dispositivo è riutilizzabile una volta che le larve sono state rimosse.
Lo spostamento in avanti, il design modulare e la facilità di montaggio della zWEDGI si presta bene alla modifica per alterata funzionalità. Attualmente, le geometrie compartimentali sono costruite appositamente per i ferimento e imaging esperimenti descritti, dandogli un'ampia applicazione per formazione immagine diretta di guarigione della ferita. Tuttavia, la larva si trova direttamente sul vetro, tale che nessun materiale (cioè PDMS), che potrebbe interferire con la formazione immagine, esiste tra la larva e la superficie di imaging. Di conseguenza, altre regioni delle larve, come il tronco, wouLD essere accessibile per l'imaging. Inoltre, la progettazione dello stampo 3D stampata della zWEDGI facilmente modificabili per ospitare altri stadi di sviluppo, diversi orientamenti della larva e vari trattamenti. Questi attributi, quindi, lo rendono un prezioso strumento per l'acquisizione di microscopia di lasso di tempo degli eventi su diverse scale temporali. L'uso di altri formati di piatto di vetro inferiore potrebbe consentire per dispositivi più grandi di PDMS e spazio per più canali. Dato il crescente accessibilità a tecniche di fabbricazione di stampa 3D e la conseguente facilità di modifica per una varietà di protocolli sperimentali, la zWEDGI può risultare per essere un potente strumento nell'ambito della microscopia immagini dal vivo ad alta risoluzione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desidera ringraziare progetto primario finanziamento dell'Istituto Morgridge per la ricerca e il laboratorio per ottici e strumentazione computazionale. Riconosciamo anche finanziamenti dal NIH # R01GM102924 (AH e KWE). KH, JMS, RS, AH e KWE ideato e realizzato lo studio. KH e JMS effettuati tutti gli esperimenti con supporto da DL, KP e RS. KH, JS, RS, AH e KWE ha contribuito alla stesura del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
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