Summary
Ce manuscrit décrit le zWEDGI (poisson-zèbre Wounding et dispositif de piégeage pour la croissance et de l’imagerie), qui est un dispositif compartimenté destiné à orienter et à empêcher les larves de poisson zèbre. La conception permet la transection de la queue et à long terme collection d’images de microscopie de fluorescence à haute résolution de la cicatrisation et de régénération.
Abstract
La larve de poisson-zèbre est un organisme modèle important pour la biologie du développement et de la cicatrisation des plaies. Par ailleurs, la larve de poisson-zèbre est un système utile pour l’imagerie microscopique direct haute résolution des phénomènes biologiques dynamiques dans l’espace et le temps avec résolution cellulaire. Toutefois, la méthode traditionnelle d’encapsulation d’agarose pour l’imagerie live peut entraver le développement larvaire et repousse des tissus. Par conséquent, ce manuscrit décrit le zWEDGI (poisson-zèbre Wounding et dispositif de piégeage pour la croissance et de l’imagerie), qui a été conçu et fabriqué comme un dispositif fonctionnellement compartimenté pour orienter les larves pour la microscopie à haute résolution tout en permettant transection de nageoire caudale au sein de l’appareil et le développement subséquent de queue sans retenue et le repousse. Ce dispositif permet de blesser et de l’imagerie à long terme tout en préservant la viabilité. Étant donné que le moule de zWEDGI est imprimé en 3D, les possibilités de personnalisation de ses géométries rendent facilement modifiables pour applications diverses poisson-zèbre. En outre, le zWEDGI offre de que nombreux avantages, tels que l’accès à la larve au cours de l’expérimentation pour blessure ou pour l’application de réactifs, parallèlement à l’orientation des larves multiples pour l’imagerie simplifiée et réutilisabilité de l’appareil.
Introduction
La capacité de régénération des larves de poisson zèbre Danio rerio rendent un organisme modèle idéal pour examiner la réponse de la plaie ainsi que guérison et repousse1,2,3,4. Accès à un tableau de lignées transgéniques de poisson-zèbre et transparence d’anatomique du poisson-zèbre encore améliorer leur utilité pour les études in vivo de plaie réponse événements ainsi qu’à plus long terme du processus de régénération4. Étude de ces processus biologiques à l’aide de la microscopie en fluorescence Time-lapse haute résolution donc exige un appareil d’imagerie live de poisson-zèbre qui permet une stabilité élevée et mouvement minimal de la larve de poisson-zèbre tout en préservant la viabilité. Il est essentiel que l’appareil permette blessant efficace tout en la guérison et la régénération se produisent pas affecté par le dispositif.
La méthode de stabilisation standard d’imagerie direct d’incorporation de la larve dans l’agarose en imagerie live limite la croissance et enroulé de régénération5 et peut augmenter les taux de mortalité étant donné que les larves commencent à montrer des signes de nécrose cardiaque de stress et de tissus après quatre heures4. Par conséquent, la suppression d’agarose de régions d’intérêt est souvent nécessaire pour permettre le développement normal et régénération6, exposer les larves à des dégâts potentiels que l’agarose est coupé. En outre, avec l’agarose, intégration technique, l’utilisateur doit orienter les larves dans le peu de temps avant l’agarose solidifie5,6,7. Rapidement, manipulant la larve requiert non seulement des compétences de l’utilisateur, elle risque aussi de dommages à la larve. Méthodes pour stabiliser la larve d’imagerie live ont été décrits pour contourner ces inconvénients, comme la gélose striée puits3 ou divets8, à l’utilisation du vide de silicone graisse pour créer une chambre d’imagerie avec la tuyauterie de PVC ou autre matériaux6et rotation tubes9, beaucoup de ces méthodes sont du travail intensif, malpropre, souvent non réutilisables et ne permettent pas de manipulation environnementale (pharmacothérapie, blessant etc..) après que le poisson a été monté.
Par conséquent, le dispositif de zWEDGI (Figure 1) a été conçu pour surmonter certains des inconvénients de la gélose de montage pour l’imagerie live à long terme des larves de poisson zèbre tout en permettant la manipulation de l’échantillon. Le zWEDGI est composé de trois chambres compartimentées semi-ouvert (Figure 1 a) pour permettre de chargement, retenue, le blessant et l’imagerie des larves de poisson zèbre après fécondation de 2 à 4 jours. Le dispositif est fabriqué de polydiméthylsiloxane (PDMS) et placé sur la lamelle couvre-objet d’un plat d’imagerie de fond verre 60 mm. La conception présentée ici a été destinée aux études guérison de plaie, cependant l’utilisation d’une conception modulaire et les technologies de fabrication standard font la conception zWEDGI modifiable et se prêtent à une variété de procédures expérimentales, en particulier pour les procédures qui exiger une retenue minimale avec manipulation expérimentale et l’imagerie à long terme.
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Protocol
Remarque : la conception de base de zWEDGI a été formulée pour les larves de poisson zèbre fécondation après 2 à 4 jours (dpf) et suivent les directives de l’Université du Wisconsin-Madison recherche animaux Resource Center.
1. conception et impression de moules 3D
- modèle le PDMS composant de l’appareil souhaité des géométries et des attributs dans un logiciel 5 de modélisation 3D. Créer un assembly d’un moule vide et la partie PDMS et générer un moule négatif pour la partie PDMS en créant une cavité dans le moule correspondant à la partie PDSM. Enregistrez le moule sous un fichier .stl pour l’impression 3D ( Figure 2, étape 1.1).
Remarque : Un fichier de format (.stl) de stéréolithographie de la conception du moule présenté ici ( Figure 1) est disponible pour téléchargement à https://morgridge.org/designs/.
Moules de - imprimé à l’aide d’une imprimante 3D photopolymère ( Figure 2, étape 1.2). Faire des moules multiples en une seule impression, si possible, donc plus d’un appareil peut être moulé avec un lot unique de PDMS.
Remarque : L’exemple illustré a été imprimé en mode haute résolution avec un 0.075 mm faisceau de diamètre et 0,05 mm épaisseur de la couche, à l’aide de photopolymère résine 5.- Propres moules à l’aide d’une brosse fine, alcool dénaturé dans un flacon pulvérisateur et l’air comprimé pour frotter en douceur et enlever la résine non polymérisée. Prélever sur toute les régions de microcanaux.
- Post-guérir les moules dans un appareil de traitement UV post pendant 60 min de chaque côté comme non durci résine est toxique pour les larves de poisson zèbre 10.
- Sable du côté de la cavité du moule avec le papier de verre grain 200 sur une surface plane jusqu'à ce que toutes les surfaces d’étanchéité sont en contact avec le papier de verre (chargement des géométries de canal et périmètre de moule). Poncez légèrement avec du papier de grain de sable de 400 et 600, progressivement, pour produire des surfaces lisses de chasse partout tous les bardages de géométrie ( Figure 2, étape 1.3). Mesurer la profondeur de la cavité après ponçage avec un comparateur pour vérifier qu’il est proche de la profondeur conçus.
- Nettoyer les moules et couvrir les disques (1 ¾ po de diamètre x ¼ de pouce épais verre borosilicate ou acrylique ; un verre couvrent par moule) en plaçant dans un ultrasons nettoyeur rempli d’eau pendant 30 min ou en rinçant sous l’eau courante.
- Sécher à l’air comprimé et nettoyer les deux moules et couvre avec l’alcool isopropylique et air comprimé filtré. Utiliser un banc propre comme un lieu pour fabriquer les dispositifs pour réduire la contamination des débris aéroportés. Laissez les moules nettoyées et verre couvre dans le banc propre ou une boîte de Pétri couvert jusqu'à ce que nécessaire.
2. Fabrication de PDMS de zWEDGI appareil
- font le PDMS par 184 verseur silicone élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) à un ratio de 5:1 (base d’activateur) dans une tasse en plastique. Mélangez bien pendant 2 min avec un bâton de métier en bois, remuer le gel plus sur lui-même, comme pétrir le pain. Pour 5 moules, utiliser 10 g de base et 2 g d’activateur.
- Dé-gaz mélange dans un dessiccateur à vide pour les 25-45 min jusqu'à ce que toutes les bulles ont disparu.
- Remplir la cavité de chacun des moules imprimés 3D avec environ 0,75 mL de PDMS à l’aide d’une seringue de 10mL jusqu'à ce que le moule légèrement déborde d’un ménisque ( Figure 2, point 2.1).
- Dé-gaz les moules remplis pendant 45 min enlever les bulles supplémentaires qui se sont formées lors du remplissage.
- Appliquer un disque de verre couvercle sur le dessus du moule rempli de PDMS, appuyant le disque vers le bas à un angle pour empêcher les bulles d’être pris au piège ( Figure 2, point 2.2). Permettre des excès PDMS à être expulsé que la couverture de disque de verre est appliquée.
- Utilisation petit cliquet pince pour tenir le disque de couverture étroitement au moule.
Remarque : Cela crée une surface plane, une fois que le PDMS est soignée et produit par le biais de trous où les géométries 3D imprimées soient à égalité avec la lamelle de verre. Sinon, pour augmenter le nombre d’appareils qui peuvent être soignées en même temps, construire un dispositif de serrage multiples (par exemple. la figure 2, étape 2.3). - Guérir l’appareil PDMS dans les moules fixées à 100 o C dans une étuve pendant 90 min ( Figure 2, étape 2,4). Retirer les moules du four et laisser refroidir jusqu'à ce qu’ils peuvent être facilement manipulés. Si le dispositif de serrage est en métal, retirez le moule et couvercle disque par la pince pour empêcher le métal de continuer à guérir le PDMS en raison de la chaleur résiduelle de.
Remarque : L’appareil est plus facile retirer du moule, alors qu’encore tièdes et non complètement durcie. Cependant, une fois que le moule est retiré du four et le disque de couverture est retiré, l’appareil peut s’asseoir pendant quelques jours avant de procéder au démoulage. Si l’appareil est démoulée peu après le retrait du four de polymérisation, placez-le dans une boîte de Pétri couverte afin de minimiser les contaminants tout en lui permettant de guérir complètement.
3. ZWEDGI plasma-collage à plat en verre
- le moule contenant le dispositif PDMS dans un étau de serrage pour que le moule ' géométries s sont face vers le haut, parallèlement à la magistrature de station de travail.
- Commencer à enlever le dispositif PDMS en libérant la PDMS la tirette du moule à l’aide de pinces à épiler à embout plat. Travail autour du périmètre du moule avec la pince à épiler (comme enlever un gâteau dans une casserole ( Figure 2, étape 3.1)).
- Utilisation filtré l’air comprimé et pince à épiler pour tirer doucement sur l’appareil hors du moule en tenant sur la languette et en soufflant de l’air sous l’appareil. Travailler lentement, permettant à l’air pour aider séparé le PDMS du moule, en prenant des précautions particulières avec les conseils de la pince à épiler dans les sections minces tunnel.
- Placer le dispositif PDMS à l’envers sur l’intérieur de la couverture d’un plat à fond de verre, afin que les cales de tunnel retenue entrent en contact avec le plastique ( Figure 2, étape 3.2).
- Placer le couvercle plat avec zWEDGI à l’envers et le plat à fond de verre correspondant dans un plasma nettoyant avec la vitre intérieure vers le haut ( Figure 2, étape 3.3).
- Évacuer le plasma Nettoyage chambre jusqu'à ce que la pression atteint 500 mTorr.
- Set radio fréquence (RF) puissance élevée. Exposer l’appareil et le plat à fréquence RF pendant environ 2 min. lentement dépressuriser la chambre et retourner l’appareil et le plat d’un capot de salle blanche.
- Enlever le PDMS de plat couvercle. Retourner sur le zWEDGI PDMS à la bonne orientation sur le verre en le positionnant soigneusement sur le centre bien du verre fond plat ( Figure 2, étape 3.4)
- à l’aide de l’extrémité arrière de la pince à épiler, appuyez légèrement sur le PDMS dispositif pour s’assurer de bulles d’air ne sont pas pris au piège sous. Appliquez une pression autour des minutes géométries des canaux micro et lisser le PDMS sur les bords ( Figure 5).
Remarque : Contact complet entre le verre et le PDMS assure la meilleure adhérence de collage de plasma. Le dispositif de zWEDGI peut être plasma collé sur autres formats de verre à fond plat, comme un plat de 6 puits à fond de verree ( Figure 2). - Placer l’enveloppe sur le plat de l’appareil avant de retirer le capot de la salle blanche.
Remarque : Une fois que les appareils ont été fixées pour le verre, le protocole peut être suspendu jusqu'à ce qu’ils sont prêts à l’emploi.
- à l’aide de l’extrémité arrière de la pince à épiler, appuyez légèrement sur le PDMS dispositif pour s’assurer de bulles d’air ne sont pas pris au piège sous. Appliquez une pression autour des minutes géométries des canaux micro et lisser le PDMS sur les bords ( Figure 5).
4. Préparation et chargement des larves de canal
Remarque : élevage de poissons zèbres générale a été réalisée par le livre du poisson-zèbre, disponible en ligne à http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Embryons et le poisson-zèbre adulte ont été maintenues comme décrit plus haut 1. La souche de type sauvage AB a été utilisée. Suivez l’institution ’ s Animal Care protocole pour plus de détails concernant les exigences pour l’imagerie des larves vivantes.
- Rincer les canaux avec un minimum d’éthanol 70 % 100 µL par canal, à l’aide d’une micropipette de rincer grâce à la contention du tunnel. Retirez l’éthanol et rinçage 2 ou 3 fois avec l’eau bidistillée. Laisser sécher à l’air.
- Remplir les canaux avec du lait écrémé (à une concentration de 1 % diluée dans l’eau) pendant 10 min à température ambiante pour réduire l’adhérence des larves à la lamelle de verre du plat. Puis, doucement immerger l’appareil plusieurs fois dans l’eau bidistillée à rincer. Laisser sécher à l’air à l’envers.
NOTE : Protocole peut être suspendue ici. Cette préparation du dispositif de zWEDGI peut se faire plusieurs jours avant d’utiliser. Magasin couvert à température ambiante. - Préparer 1 % bas point de fusion (LMP) agarose en combinant 100 µL 2 % fondu LMP agarose avec 100µl 2 x Tricaine (0,4 mg/mL tricaïne - 3-aminobenzoate d’éthyle) E3 tampon 11 préchauffée à 38 o C. maintenir le 1 % solution d’agarose/tricaïne à 38 o C dans un bloc chaud pour empêcher la gélification.
Remarque : Pour la microscopie multiphoton 11, utiliser deux variantes zebrafish non pigmentées (tels que casper 12) ou de maintenir des larves en E3 contenant 0,2 mM N-phénylthiourée pour empêcher la formation de pigment 11 afin de minimiser l’absorption de longueurs d’onde infrarouges proches par le pigment.
ATTENTION : N-phénylthiourée est toxique. Suivez l’institution ' règles de s pour élimination. - Anesthésier les larves en E3 tampon contenant 0,2 mg/mL de tricaïne (tricaïne/E3) 11. Attendez que les larves sont immobiles et ne répond pas à un stimulus tactile.
- Pré mouillage les canaux avec quelques microlitres de tricaïne/E3.
- Pick up une seule larve à l’aide d’un embout large orifice de la pipette. Déposer les larves dans le canal de chargement ( Figure 3 a). À l’aide d’une pointe de pipette ou un outil similaire, orienter la larve dans la chambre de chargement tels que la face dorsale trouve le bord rectiligne de la chambre de chargement et les visages de la queue vers le tunnel de retenue ( Figure 3 b).
- Retirer soigneusement le liquide de la chambre blessant, ce qui permet à la larve s’écouler dans le tunnel de retenue ( Figure 3). Enlever la plupart du liquide tout en conservant l’humidité autour de la larve ( Figure 3D). Ce processus peut être facilitée en inclinant le plat légèrement vers la chambre blessant.
- Placer 1 % LMP d’agarose dans tricaïne/E3 (~ 38 o C) au cours de la larve ' s la tête, remplissage de la chambre de chargement ( Figure 3E). Permettre d’agarose solidifier la larve dans la bonne position. Ajouter tricaïne/E3 à la chambre blessant au besoin pour maintenir l’hydratation. Répétez ce processus pour les 2 autres canaux de chargement.
- à l’aide d’une aiguille de seringue, retirer soigneusement toute agarose qui s’est infiltrée à travers le tunnel de retenue dans la chambre de blessure ( Figure 3F). Ajouter tricaïne/E3 supplémentaires soit un peu plus l’agarose (pour les blesser, imagerie à court terme ou plaie traitement isolation) ou à remplir la boîte de Petri (pour l’imagerie à long terme). Replacez le couvercle plat de culture pour empêcher l’évaporation. Les larves peuvent être photographiés à ce stade (chemin) ou blessés.
5. Les larves de blessures et d’imagerie
- à l’aide d’une lame de bistouri stérile, transect de la nageoire caudale postérieure de la notochorde 11 dans la chambre de blessure ( Figure 3 G, H). Si nécessaire, ajouter supplémentaires tricaïne/E3 et remettez le couvercle de plat de la culture.
NOTE : Vous pouvez également en fonction de la fenêtre de temps de développement d’intérêt, larves peuvent être blessés, l’autorise à recouvrer en E3 et maintenus dans un incubateur (28,5 o C) jusqu’au moment d’imagerie désiré, à quel point ils peuvent être chargés dans des canaux comme décrits ci-dessus.
Insert - installer le dispositif zWEDGI larves anesthésié sur un microscope inversé dans un stade qui accueillera le plat de fond de verre de 60 mm. Localisez la queue de la larve dans le canal supérieurs, en faisant tourner le plat tel qu’il est nécessaire pour faire la queue dans la position désirée. L’image selon les besoins pour l’expérience spécifique.
Remarque : Le zWEDGI est largement applicable pour la microscopie à haute résolution, y compris widefield fluorescence et microscopie à balayage laser. Il y a un certain nombre de considérations de paramètre lors de l’imagerie des larves de poisson zèbre, mais spécifiques de paramètres d’imagerie sont instrument, échantillon et expérience dépendant. Ici, la queue larvaire a été photographiée sur une génération personnalisée microscope multiphoton 5 , 11 utilisant les paramètres suivants : 40 X long travail distance eau objectif à immersion, excitation de laser 890 nm, 445/20 nm-filtre d’émission et la résolution de 512 x 512.
6. Fin de l’expérience
- retirer le plat de zWEDGI du microscope. Euthanasier les larves en plaçant le zWEDGI sur un bain d’eau glacée ou à 4 o C pendant au moins 20 min et évaluer pour absence de rythme cardiaque et la circulation.
Remarque : Étant donné que les larves sont maintenues dans des compartiments séparés, les larves peuvent être individuellement récupérés en tirant doucement sur la gélose avec une pince ou pipette. La gélose peut être retirée de la région céphalique et la larve utilisé pour des procédures additionnelles, telles que la fixation des anticorps ou transformés pour l’extraction de l’ARN ou protéine. - Après le retrait des larves et agar, nettoyer le zWEDGI avec de l’éthanol et l’eau distillée, comme indiqué au point 4.1 et mis sens dessus dessous à le pour air sec. Magasin couvert dans un endroit frais et sec. Ré-enduire de lait écrémé (étape 4.2) selon le besoin avant la prochaine utilisation.
Remarque : zWEDGIs peut être réutilisée plusieurs fois, jusqu'à ce que le PDMS commence à s’éloigner le verre.
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Representative Results
Le dispositif microfluidique de zWEDGI PDMS est un dispositif fonctionnellement compartimenté conçu pour accueillir quatre fonctions principales (listées ci-dessous) associées à l’imagerie live de nageoire caudale, blessant la guérison et la régénération chez les larves de poisson zèbre. PDMS a été choisi pour la fabrication de zWEDGI, parce qu’il n’est pas seulement facilement disponible et qu’un standard industriel pour la biocompatibilité, mais aussi fonctionne bien dans les moules. En outre, PDMS rend le dispositif réutilisable et vide de bords durs ou pointus lorsque l’appareil est formé. Le zWEDGI permet plus précisément 1) le chargement des larves dans le dispositif, retenue pour 2) à une orientation appropriée pour l’imagerie, 3) blessant de la nageoire caudale et l’imagerie 4) microscopique, décrites en détail ci-dessous.
Chargement
La conception zWEDGI est composé de 3 chaînes, chacune conçue pour retenir une larve (Figure 1 b). Pour l’orientation initiale et de chargement de la larve, la chambre de chargement ouverte est 3 mm de large (Figure 1 a) pour accueillir un grand orifice de pipette pour déposer une larve (Figure 3 a). En outre, la longueur et la largeur prévoir une marge suffisante pour permettre une manipulation ultérieure de la larve dans le bon sens, avec la queue vers le tunnel de retenue et de la face dorsale vers le haut (Figure 3 b).
Dispositif de retenue pour
Une fois que la larve a été chargée dans le canal, il peut être dessiné première queue dans le tunnel retenue par élimination du fluide de la chambre de blessant ou pousser doucement en place avec une pointe de pipette ou autre outil (Figure 3). La géométrie en forme d’entonnoir de la chambre de chargement (Figure 1 a), de 3 mm à 0,45 mm, guide la larve dans l’orientation latérale désirée (Figure 3). L’orientation de la larve sur son côté retient la queue environ en parallèle avec le fond du verre du plat pour une meilleure image. Contrairement aux dispositifs microfluidiques apportées à l’aide de plaquettes de silicium, les géométries des moules imprimés 3D ne sont pas nécessairement cohérentes dans la direction z. Par conséquent, le tunnel de retenue est couverte et coniques dans l’axe des z, telle que la hauteur de l’entrée est supérieure à la sortie, entre 0,5 mm et 0,3 mm de hauteur (Figure 1 b, vue isométrique du tunnel). Cette effilée facilite l’orientation de la larve et l’aplatissement de la queue vers le couvercle en verre d’imagerie de surface. Cette fonctionnalité élimine le besoin de l’utilisateur d’orienter l’échantillon tandis que l’agarose est durcissement.
Le liquide est prélevé à la chambre de chargement (Figure 3D) et est remplacé par le point de fusion bas d’agarose pour stabiliser la tête dans le chenal, tandis que la queue est maintenue sans retenue dans un tampon dans la chambre blessant (Figure 3E). L’agarose minimal qui peut s’écouler à travers le tunnel de retenue peut facilement être retiré de la chambre blessant (Figure 3F). Le manque d’agarose dans la chambre de blessure permet la repousse sans retenue et le développement de la nageoire caudale5.
Blessant
Une fois que la larve a été chargée par le tunnel et la tête freinée par l’agarose, la nageoire caudale est disponible pour la transection parce qu’il s’avance dans la chambre de blessure. La chambre blessant demi-cercle est décalée de 1,9 mm de symétrie horizontale. Ceci permet à la lame de bistouri à insérer juste au-dessus de la nageoire caudale, ce qui permet de suffisamment d’espace pour la lame à tirer vers le bas dans l’ensemble de la queue, sectionnant la nageoire caudale (Figure 3). La plus grande partie du demi-cercle de diamètre 7 mm se produit lorsque la queue est blessée pour accueillir cette motion. En plus de permettre à l’utilisateur de blesser la larve, cette conception compartimentée offre l’occasion d’une demande régionale de composés pour la région de queue5. Cette caractéristique unique d’isole en partie permettrait d’essai localisé des effets des différentes drogues, produits chimiques ou agents biologiques sur la processus de cicatrisation.
Imagerie
L’objectif de l’appareil zWEDGI est de permettre à haute résolution imagerie microscopie de la nageoire caudale du poisson-zèbre, sans incorporation d’agarose de la lumière. Pour cette raison, l’appareil PDMS est collée sur un plat de fond de verre disponibles dans le commerce, pour fournir une surface de qualité optique pour la microscopie à l’aide de verres hauts de NA. Nous présentons ici des images à l’aide de la microscopie multiphoton pour l’imagerie (SHG) deuxième harmonique des fibres de collagène dans la nageoire caudale pour illustrer les fonctionnalités d’imagerie de la zWEDGI. Cependant, le zWEDGI peut être appliquée à d’autres méthodes de microscopie photonique, telles que la microscopie confocale, utilisant une configuration de scène microscope inversé. Avec le zWEDGI, contrairement à la méthode d’agarose incorporation avec retrait subséquent, la nageoire caudale peut facilement être photographiée sur l’appareil avant de le blessant (Figure 4 a), blessé au sein de l’appareil, puis immédiatement retourné au microscope pour blessure après imagerie (Figure 4 b-E). Les travaux précédents a identifié des changements dans l’organisation de fibre de collagène pendant le processus de guérison de plaies à l’aide de SHG. 13 SHG peut être utilisé pour détecter certains types de structures ordonnées, y compris de collagène fibrillaire, sans l’utilisation d’étiquettes exogènes. 14 image qualité des nageoires caudales vie photographiée sur le zWEDGI était semblable à celui obtenu en tissu fixe5 mais la zWEDGI fournit un certain nombre d’avantages. Plus important encore, la guérison de la nageoire caudale et la repousse peuvent procéder sans entrave de l’agarose incrustation dans la survie des larves semblable à celle des larves libres5. En outre, parce que la blessure peut être effectuée pendant que la larve se trouve dans l’appareil, images préalables et post blessures peuvent être recueillies sur la nageoire caudale même (Figure 4 a). Le zWEDGI permet la collecte de données dimensionnelles 3 au fil du temps, offrant une vision plus complète des changements dynamiques qui se produisent dans la structure de la matrice extracellulaire (Figure 4 b). Illustré ici est la SHG relaxation fibre enroulé, en 3 dimensions, suivant blessant au sein de la zWEDGI. Avant la blessure, la SHG a détecté des fibres de collagène rayonnent vers l’extérieur de la notochorde à l’extrémité de la nageoire, (Figure 4 a). Peu de temps après la blessure de la distance entre l’extrémité de la nageoire sous contractée et le centre de thfin e augmente avec la relaxation de la plaie. La nature 3D de la collecte de données permet la reconstruction spatiale, à l’aide du logiciel de rendu tels que Imaris. Ces reconstructions et les options de rotation ultérieure, illustrent la contraction et la relaxation de la nageoire se produit non seulement dans le plan y de x de la collection d’images (Figure 4 B, C, D), mais aussi dans l’axe z (Figure 4 G-J, L-O, Q-T; Supplemental films 1, 2) que la queue s’aplatit de celui qui s’enroule vers le haut de l’État contracté. Le zWEDGI peut être utilisé avec d’autres modalités d’imagerie sur de longues périodes de temps, telles que l’utilisation de la microscopie confocale aux neurones d’image au cours du développement de la nageoire caudale plus de 24 h5. Parce que les unités de retenue de l’appareil sont alignées parallèlement, éliminant ainsi le besoin de faire pivoter l’appareil lors de la localisation des larves, mise en place du microscope et circulant entre plusieurs spécimen d’imagerie sont simple et peuvent être automatisé afin de recueillir données d’image Time-lapse de plusieurs larves. Pour étendre le nombre d’échantillons qui peut être photographiée, l’appareil de zWEDGI PDMS peut être placé dans d’autres formats à fond de verre, comme une plaque 6 puits (Figure 2).
Figure 1 : Schéma de conception finale (A) Schéma montrant la disposition générale et les mesures de l’appareil zWEDGI, mettant en évidence la terminologie des chambres fonctionnellement compartimentées. (B) vue isométrique de dispositif PDMS comme retirée du moule. (C) encart montre tunnel, mettant en évidence la variation de hauteur d’entrée et de sortie. (D) modèle de larve attaché dans l’appareil. Figure modifié par rapport à un déjà publier article5 avec la permission de la réimpression du Journal de poisson-zèbre . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Fabrication de schéma (A) Étape 1 commence avec la conception du moule périphérique dans un logiciel (1.1) qui est ensuite imprimé 3D (1.2) de la modélisation 3D. Les moules sont lumière UV guérie et puis poncé et nettoyé ainsi les géométries surélevés ont même hauteur (1.3). Étape 2 consiste à remplir les moules avec mixtes et dégazé PDMS (2.1) et en appliquant un disque de verre sur le moule à une inclinaison pour éviter les bulles d’air de piégeage dans le dispositif de PDMS (2.2). Le verre et le moule sont maintenues ensemble (2,3) pour le séchage à l’étuve à 100oC pendant au moins une heure (2.4). Étape 3 utilise l’air filtré et pince à épiler à embout plat pour enlever le PDMS du moule (3.1). L’appareil est ensuite placé sur le dessus du couvercle de plat d’imagerie (3.2) et plasma traité (3.3), ainsi que le fond de verre, afin de permettre le PDMS à adhérer au plat verre bas (3.4). (B) l’appareil fini zWEDGI collé dans un plat en verre bas et prêt à l’emploi d’imagerie. (C) plusieurs dispositifs de zWEDGI peuvent être placés dans une plaque de 6 puits de fond de verre pour l’image de nombreuses larves dans la même expérience. Figure modifié par rapport à un déjà publier article5 avec la permission de la réimpression du Journal de poisson-zèbre . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Chargement et blessant de larve dans zWEDGI (A) Une larve est chargée dans la chambre de chargement à l’aide d’une pipette de l’échelle-orifice. (B) la larve est orientée avec la face dorsale contre la partie plate du chargement entonnoir et la queue vers le tunnel de retenue de la chambre. (C) à l’aide de dragues de la pipette qui s’est tenue à l’entrée à la chambre de blessure, la larve est aspirée dans le tunnel, mettez-le dans une orientation appropriée pour l’imagerie. (D) le liquide est prélevé de la chambre de chargement pour permettre l’ajout d’agarose autour de la région céphalique pour stabiliser la larve (E) . L’agarose est couleur rouge ici uniquement à des fins de démonstration. Agarose minimal s’infiltre dans la chambre de blessant et peut être facilement enlevé comme sur la (F). (G) pour blesser une fois la larve est attachée dans le canal, une lame de bistouri Swann-Morton est insérée au-dessus de la larve et tranchée vers le bas dans l’ensemble de la nageoire caudale, postérieure de la notochorde. (H) la larve est maintenant prête pour l’imagerie après blessure. L’échelle bar (A-H) = 1 mm ; L’échelle bar (F) = 1 mm ; Balance bar (G) = 1 mm. modifiée par rapport à la Figure un déjà publier article5 avec la permission de la réimpression du Journal de poisson-zèbre . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : 3D multiphoton time-lapse d’imagerie des fibres SHG dans la nageoire caudale de poisson-zèbre, pre et post blessure, dans le zWEDGI. La conception zWEDGI offre la possibilité pour l’imagerie de haute résolution, en l’occurrence d’organisation fibre SHG précédant (préalablement enroulées) et suivant caudal fin transection (après blessure). Données ont été recueillies dans le z-piles à des intervalles de 4 min. (A-E) présente la SHG de fibres dans la nageoire caudale comme une projection des z-cheminées, avant et Pendant les après transection quatre intervalles. Z-projection a été réalisée à l’aide de logiciels ImageJ. 15 t = 0 est le début de l’imagerie, environ 20 min après transection. Les flèches doubles indiquent l’augmentation de la distance de la pointe de l’arête de la plaie (petite ligne blanche) relative à l’emplacement de la notochorde (ligne blanche) lors du relâchement de la plaie après la contraction initiale. (F-J). Reconstruction 3D inclinée des données originales. (K-O). Rendu de surface de la reconstruction 3D inclinée montrée F.-J. (P-T). Vues de côté du rendu surface reconstruction 3D, illustrant comment la contraction et la relaxation se produisent dans l’espace à 3 dimensions, pouvant être évaluée par ces données recueillies à l’aide de la zWEDGI où la nageoire caudale n’est pas contraint par l’agarose. L’échelle bar (A-E) = 100 microns ; L’échelle bar (F-T) =100 microns. Rendus 3D ont été réalisées à l’aide de logiciels d’imagerie. Voir également supplémentaire films 1 et 2. Figure modifié par rapport à un déjà publier article5 avec la permission de la réimpression du Journal de poisson-zèbre . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Les étapes critiques de zWEDGI Fabrication (A) Pour s’assurer d’aucune forme de bulles ou coincés dans l’appareil quand on bloque sur le disque de verre, dégazer après que PDMS a été rempli dans les moules et incliner le verre de serrage lors de l’application pour le PDMS dans le moule. En outre, pour empêcher de PDMS de « flashage » pendant le chargement et blessant chambers, n’oubliez pas de poncer le dessus de l’appareil soigneusement pour s’assurer que les surfaces des géométries affleurent quand on bloque sur le verre. (B) lorsque l’appareil est suffisamment durci au four, des poches d’air entre le PDMS et moule indiquent que l’appareil sera facile à enlever. Si l’appareil n’enlève pas facilement, il est fort probable en raison du temps de polymérisation insuffisante ou la température ou le moule lui-même n’était pas suffisamment séchée au UV, résine résiduelle contaminent du PDMS. (C) lorsque le dispositif de serrage et au plat verre bas après traitement au plasma, appliquez une légère pression avec la partie arrière de la pince à épiler, commençant par les régions de tunnel et en partant vers l’extérieur au bord de l’appareil. Si l’appareil ne pas coller bien, comme il est indiqué par des poches d’air entre le périphérique et le verre, allonger le laps de temps dans le bonder de plasma et s’assurer qu’il n’y a pas de poussière entre la surface PDMS et de verre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire 1 film : incliné rendu surface 3D des images multiphoton de fibres SHG dans la nageoire caudale durant la relaxation après blessant. La SHG de fibres dans la nageoire caudale imagés comme zstacks au fil du temps après la blessure (début de film est environ 20 min après la blessure) dans le zWEDGI. Z-cheminées ont été reconstruits et surface restitué à l’aide de logiciels d’imagerie. Queue inclinée pour montrer trois dimensionnalité. Antérieure est à gauche. Film correspond à des images fixes à la Figure 4 (K-O). Echelle = 50 microns. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le film.
Supplémentaire Movie 2 : vue latérale de rendu surface 3D des images multiphoton de fibres SHG dans la nageoire caudale durant la relaxation après blessant. La SHG de fibres dans la nageoire caudale imagés comme zstacks au fil du temps après la blessure (début de film est environ 20 min après la blessure) dans le zWEDGI. Z-cheminées ont été reconstruits et surface restitué à l’aide de logiciels d’imagerie. Vue latérale montré à mettre l’accent sur la capture des variations dynamiques de l’axe z. Antérieure est à gauche. Film correspond à des images fixes à la Figure 4 (P-T). Echelle = 40 microns. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le film.
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Discussion
L’objectif de l’appareil zWEDGI est de capturer le laps de temps 3D imaging en stabilisant et en orientant le poisson au sein de la petite distance de travail d’un objectif de microscope de haute résolution. Tout en répondant à ces spécifications de conception, c’est aussi une amélioration au cours de la préparation traditionnelle axée sur la gélose, imagerie live. Il y a trois étapes critiques (ci-dessous) dans la fabrication de la zWEDGI, qui, si ne pas fait correctement, peut entraîner des dispositifs défectueux :
Préparation de PDMS (Figure 5 a)
Pour éviter les bulles, une solution contenant les moules après que PDMS a été ajouté. Vérifiez que toutes les bulles ont été éliminés après dégazage et demande une attention particulière à l’application du disque verre. Le disque de verre doit être appliqué à une inclinaison pour s’assurer que l’air n’est pas étant emprisonné sous et à l’intérieur du PDMS. Poussière peut poser un problème au cours de la plupart des étapes du processus. Pour éviter que la poussière, remplir chaque étape de nettoyage soigneusement et entreposer les pièces sous une hotte à nettoyer entre les étapes. Vérifier les moules pour excès de résine qui peut créer une surface rugueuse avant la polymérisation UV. Lorsque vous poncez, assurez-vous que les contacts de papier sablé toutes les géométries pour s’assurer que toutes les surfaces sont fleur (Figure 2, étape 1.3). Toujours nettoyer avec de l’alcool isopropylique et d’air juste avant de remplir les moules avec le PDMS. En pressant le PDMS supplémentaire hors du moule, assurer les attaches solidement maintenez le moule et couvercle de verre ensemble (Figure 2, étape 2.3).
Dispositif d’extraction du moule (Figure 5 b)
S’assurer que le four est au moins 100 o C et le temps de polymérisation est au moins 1 à 1,5 h. Si le PDMS n’est pas suffisamment guéri, il peut être difficile à enlever de la moisissure. Autres possibilités pour non-retrait incluent ne pas mélanger les réactifs PDMS assez longs, en utilisant les ratios incorrectes de la base et durcisseur ou reste résine qui reste dans le moule après impression qui contamine puis le PDMS 3D. Lors du retrait du four, des poches d’air entre le périphérique et le moule (Figure 5 b) indiquent que l’appareil disparaît facilement.
Adhésion du PDMS à fond de verre plat (Figure 5)
Mauvaise adhérence au verre plat peut résulter de la poussière, un mauvais alignement ou longueur insuffisante du traitement au plasma. Lorsque vous placez l’appareil sur le verre, bout plat à un angle et centrer le PDMS sur le cercle de verre assurant qu’il ne touche pas les bords du puits. Si l’appareil n’adhère pas, enfoncez doucement l’appareil sur le bordereau de verre avec la partie arrière de la pince à épiler, commençant à la région délicate tunnel et en pressant vers l’extérieur pour les bords. Si l’appareil n’adhère toujours pas, essayez en augmentant le temps dans le plasma nettoyant par incréments d’une minute.
Alors que les larves peuvent être photographiées sur l’appareil pendant de courtes périodes de temps (minutes) sans l’utilisation de l’agar, dans le but de vivre à long terme-imagerie la région caudale, agar est placé sur la tête dans la chambre de chargement après que le poisson a été chargé. Bien que cette demande d’agar ne semble pas influer sur la cicatrisation de la réponse ou la viabilité des larves5, cela pourrait avoir un impact l’étude de plusieurs régions antérieures des larves. Bien que nous avons pu pour les larves d’image jusqu'à 60 h nous n'avons pas examiné si la viabilité serait touchée avec des longs d’imagerie. En outre, la conception particulière présentée ici a été optimisée pour âge 2 à 4 jours post fécondation (dpf) larves se trouvant sur le côté pour la transection de la queue et l’imagerie de la cicatrisation. Autres stades de développement, des orientations et des protocoles expérimentaux peuvent exiger des modifications à la conception. Cependant, la modularité fonctionnelle intentionnelle de la conception le rend facilement se prêtent à ces modifications.
En outre, la fabrication de cet appareil requiert l’accès à une imprimante 3D et d’autres matériaux de microfluidique et équipements, tels que le PDMS et un plasma nettoyant, potentiellement limitant l’accessibilité de l’équipement à certains utilisateurs. Toutefois, cette méthode de fabrication de moule a été choisie car les capacités d’impression 3D, ainsi que de la fabrication des dispositifs microfluidiques, sont de plus en plus fréquentes sur les campus universitaires. En outre, il y a des fournisseurs de services pour la 3D impression disponibles, comme la technologie se développe rapidement et le coût des baisses d’imprimantes.
Compte tenu de sa conception compartimentée et la fonctionnalité, le zWEDGI offre des améliorations sur la technique actuelle pour la collection d’images de laps temps utilisant agar incorporation. Tout d’abord, agarose n’entoure pas la région de queue dans le zWEDGI, qui permet la cicatrisation et la régénération au progrès sans tabou tandis que la survie des larves dans le zWEDGI est comparable à des contrôles intégrés et substrats5. Deuxièmement, l’utilisation de l’impression 3D à haute résolution pour fabriquer les moules permet le zWEDGI d’avoir des géométries en pente uniques à orienter la larve en trois dimensions par rapport au plan d’imagerie. Cette commande supprime la dépendance de manipuler les larves d’une orientation appropriée comme la gélose durcit. Un troisième important avantage de la conception zWEDGI est la conception de chambre ouverte qui permet à la queue et la tête régions soient accessibles pour la manipulation expérimentale. Il s’agit d’un intérêt particulier pour les études de la cicatrisation, mais cela donne aussi la zWEDGI un outil potentiellement utile pour les autres manipulations. La conception compartimentale du dispositif, en outre, offre la possibilité d’application régionale des composés au cours de l’expérimentation. Les semi-isolats de dispositif la tête de la queue en raison de la différence de la diffusion de tampon (dans la chambre de blessure) et d’agarose (dans la chambre de chargement)5, permettant ainsi à l’application de composés alors qu’il étudiait la cicatrisation des plaies ou autre biologique processus. En outre, parce que les larves sont montés dans des canaux séparés, chaque larve puisse être identifié et Récupérée après imagerie pour un traitement supplémentaire comme purification ARN ou protéine ou étiquetage des anticorps. Et enfin, parce que l’appareil est fait de PDMS qui a été collé sur le plat à fond de verre, l’appareil est réutilisable une fois que les larves ont été supprimées.
À aller de l’avant, la conception modulaire et la facilité de fabrication de la zWEDGI vont se prête bien à la modification de fonctionnalités modifiées. Actuellement, les géométries compartimentales sont construits spécifiquement pour les expériences blessantes et imageries décrits, lui donnant une large demande d’imagerie Webcam live de la cicatrisation des plaies. Toutefois, la larve se trouve directement sur le verre, tel qu’aucun matériel (c'est-à-dire PDMS), qui risquent d’interférer avec l’imagerie, n’existe entre la larve et la surface d’imagerie. Par conséquent, d’autres régions des larves, comme le tronc, wouêtre accessible pour l’imagerie. En outre, la conception du moule 3D imprimée de la zWEDGI peut facilement être modifiée pour permettre autres stades de développement, les différentes orientations de la larve et la variété de traitements. Ces attributs font donc un outil précieux pour la capture de microscopie de laps de temps des événements sur une variété d’échelles de temps. L’utilisation d’autres formats de plat verre bas pourrait permettre de plus grands appareils PDMS et de l’espace pour plus de canaux. Compte tenu de l’accessibilité croissante de techniques de fabrication d’impression 3D et de la facilité ultérieure de modification pour une variété de protocoles expérimentaux, le zWEDGI pourrait s’avérer pour être un outil puissant dans le domaine de la microscopie d’imagerie en haute résolution.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimerait remercier financement de projets primaire de l’Institut Morgridge pour la recherche et le laboratoire d’optique et d’Instrumentation computationnelle. Nous remercions également le financement de NIH # R01GM102924 (AH et KWE). KH, JMS, RS, AH et KWE conçu et destiné à l’étude. KH et JMS exécuté toutes les expériences avec l’appui du DL, KP et RS. KH, JS, RS, AH et KWE a contribué à la rédaction du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
