Summary
Dette manuskriptet beskriver zWEDGI (sebrafisk Wounding og Entrapment enhet for vekst og bildebehandling), som er en compartmentalized enhet konstruert for å orientere og holde sebrafisk larver. Design tillater hale transection og langsiktig samling av høyoppløselige fluorescerende mikroskopi bilder av sårheling og gjenfødelse.
Abstract
Sebrafisk Larven er en viktig modell organisme for både utviklingsbiologi og sårtilheling. Videre, sebrafisk Larven er en verdifull system for live høyoppløselig mikroskopiske bildebehandling av dynamisk biologiske fenomener i rom og tid med cellular oppløsning. Den tradisjonelle metoden for agarose innkapsling for live bildebehandling kan imidlertid hindre larver utvikling og vev regrowth. Derfor dette manuskriptet beskriver zWEDGI (sebrafisk Wounding og Entrapment enhet for vekst og bildebehandling), som ble designet og fabrikkert som funksjonelt compartmentalized apparat å orientere Larvene for høy oppløsning mikroskopi mens tillater halefinnen transection innen enheten og påfølgende hemningsløs hale utvikling og re-vekst. Denne enheten gir såret og langsiktig imaging samtidig levedyktighet. Gitt at zWEDGI mold er 3D trykt, customizability sin geometrityper gjør det enkelt endres for mangfoldig sebrafisk tenkelig søknadene. Videre tilbyr zWEDGI mange fordeler, for eksempel tilgang til Larvene under eksperimentering såret eller anvendelsen av reagenser, paralleller retning av flere Larvene for strømlinjeformet bildebehandling og gjenbruk av enheten.
Introduction
Regenerativ kapasitet sebrafisk Larvene Danio rerio gjøre dem en ideell modell organisme for å undersøke såret respons samt healing og gjenvekst1,2,3,4. Tilgang til en rekke transgene sebrafisk linjer og sebrafisks anatomiske transparency ytterligere forsterke deres nytte for i vivo studier av såret svar arrangementer samt langsiktige regenerativ prosesser4. Studiet av disse biologiske prosesser med høy oppløsning time-lapse fluorescens mikroskopi derfor krever en live bildebehandling sebrafisk enhet som gir høy stabilitet og minimal bevegelse av sebrafisk Larven samtidig levedyktighet. Det er viktig at enheten gir effektiv såret mens healing og gjenfødelse oppstår upåvirket av enheten.
Live bildebehandling stabilisering standardmetoden for innebygging Larven i agarose under live bildebehandling begrenser veksten og sår gjenfødelse5 og kan øke dødelighet siden Larvene begynner å vise tegn på cardiac stress og vev nekrose etter fire timer4. Derfor fjerning av agarose fra regioner av interesse er ofte nødvendig å tillate normal utvikling og regeneration6, utsette Larvene til potensielle skader som agarose er kuttet bort. Videre med agarose innebygging teknikk, må brukeren orientere Larvene på kort tid før agarose stivner5,6,7. Raskt manipulere Larven ikke bare krever dyktighet av brukeren, også risiko skade Larven. Selv om metoder for å stabilisere Larven for live bildebehandling har blitt beskrevet for å omgå disse ulempene, som ridged agar brønner3 eller divets8, bruk av silikon vakuum fett for å lage en tenkelig kammer med PVC rør eller andre materialer6og roterende rør9, mange av disse metodene er arbeidskraft intensiv, rotete, ofte ikke-gjenbrukbare og tillater ikke miljømessige manipulering (narkotika behandlinger, såret osv.) etter at fisken har blitt montert.
Derfor ble zWEDGI enheten (figur 1) utviklet for å overvinne noen av ulempene med agar montering for langsiktig live bildebehandling av sebrafisk Larvene mens tillater manipulering av prøven. ZWEDGI består av tre halvåpne compartmentalized kamre (figur 1A) å tillate lasting, tilbakeholdenhet, såret og bildebehandling for 2 til 4 dager etter befruktning sebrafisk larver. Enheten er fabrikkert fra Polydimethylsiloxane (PDMS) og plassert på cover slip av en 60 mm glass bunn tenkelig rett. Design presenteres her var ment for sår helbredelse studier, men bruk av et modulært design og standard fabrikasjon teknologier gjør zWEDGI design kan endres og mottagelig for en rekke eksperimentelle prosedyrer, spesielt for prosedyrer som kreve minimalt tilbakeholdenhet med eksperimentelle manipulasjon og langsiktig bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: base zWEDGI design ble formulert for sebrafisk larver som er 2 til 4 dager etter befruktning (dpf) og følge retningslinjene for University of Wisconsin-Madison forskning dyr ressurssenter.
1. design og 3D utskrift av muggsopp
- modell av PDMS komponenten av enheten med ønsket geometrier og attributter i en 3D-modellering programvare 5. Opprette en samling av en tom mold og PDMS og generere en negativ mold for PDMS del ved å opprette et hulrom i mold tilsvarer den PDSM delen. Lagre mold som en .stl fil for 3D utskriften ( figur 2, trinn 1.1).
Merk: En stereolitografi-formatfil (.stl) av mold design presenteres her ( figur 1) er tilgjengelig for nedlasting på https://morgridge.org/designs/. - Print muggsopp photopolymer 3D skriveren ( figur 2, trinn 1.2). Gjøre flere former i en enkelt utskrift, hvis mulig, så mer enn én enhet kan formes med en enkelt bunke PDMS.
Merk: I eksemplet ble trykt i Hi-Res modus med en 0.075 mm strålen diameter og 0.05 mm lagtykkelse, bruker photopolymer harpiks 5.- Ren former med en fin børste, rødsprit i en sprayflaske og trykkluft forsiktig skrubbe og fjerne uherdet harpiks. Fjern materiale fra regionene microchannel.
- Etter kurere formene i en UV innlegget kur apparater for 60 min på hver side som uherdet fratre er giftig for sebrafisk Larvene 10.
- Sand hulrom siden av mold med 200 korns slipepapir på flatt underlag til alle tetting overflater er i kontakt med sandpapir (lasting kanal geometrier og mold perimeter). Lett sand med 400- og 600 grus sand papir, gradvis, for å produsere glatte flush flater over alle geometri facinger ( figur 2, trinn 1.3). Måle dybden av hulrommet etter sliping med en indikator for å bekrefte at det er nær designet dybden.
- Ren former og dekke plater (1 ¾ tomme diameter x ¼ tomme tykk Borosilikatglass eller akryl, ett glass dekke per mold) ved å plassere i en ultrasonisk renere fylt med vann i 30 min eller rødme under rennende vann.
- Blåse tørt med komprimert luft og feilfri begge formene og dekker med isopropyl alkohol og filtrert trykkluft. Bruk en ren benk som et sted for å dikte enhetene for å redusere forurensning fra luftbårne rusk. La den renset muggsopp og glass dekker i ren benken eller en dekket Petriskål inntil.
2. PDMS fabrikasjon av zWEDGI enheten
- gjør PDMS av helle 184 silikon elastomer polydimethylsiloxane (PDMS) i forholdet 5:1 (base å Aktivator) i en plast kopp. Bland godt i 2 minutter med en tre craft pinne, røring gel over på seg, som kneading brød. 5 muggsopp, bruke 10 g av base og 2 g av aktivator.
- De gass blandingen i et vakuum desiccator i 25-45 min til alle bobler er borte.
- Fylle hulrom av 3D trykt formene med omtrent 0,75 mL av PDMS med en 10mL sprøyte til mold litt flyter over med en menisk ( figur 2, trinn 2.1).
- De gass fylt formene for 45 min fjerne flere bobler som kan ha dannet når du fyller.
- Bruke et glass dekket skiven på PDMS-fylt mold, trykke platen ned for en innfallsvinkel å hindre bobler blir fanget ( figur 2, trinn 2.2). Tillate overflødig PDMS å bli utvist som glass filmens etui brukes.
- Bruk små ratchet klemme å holde den dekket skiven tett mold.
Merk: Dette skaper et flatt underlag når PDMS er herdet og produserer gjennom hull hvor 3D trykt geometrier er flush med glass cover slip. Alternativt, for å øke antallet enheter som kan kureres samtidig, bygge en multi klemme enhet (f.eks. figur 2, trinn 2.3). - Kurere PDMS enheten i festet formene på 100 o C i en ovn 90 min ( figur 2, trinn 2.4). Fjern formene fra ovnen og la avkjøles før de kan lett behandles. Hvis spennanordningen metall, fjerne samlingen mold og dekk platen fra klemmen å forhindre metallet fra fortsetter å kurere PDMS på grunn av restvarmen.
Merk: Enheten er lettest å fjerne fra formen mens litt varm og ikke fullstendig kurert. Men når mold er fjernet fra ovnen og dekket skiven er fjernet, kan enheten sitte for et par dager før du går videre til demolding. Hvis enheten er demolded kort tid etter fjerning av herding ovnen, plassere den i en dekket Petriskål å minimere forurensninger stund tillater den å fullt cure.
3. Plasma-bånd zWEDGI til Glass rett
- klemme mold som inneholder PDMS enheten i en benk vice slik at mold ' s geometrier vender opp, parallelt til arbeider stasjon benken.
- Start å fjerne PDMS enheten ved å slippe kategorien PDMS trekk fra formen ved hjelp av flat-tipped pinsett. Arbeid rundt perimeteren på mold med pinsett (som fjerner en kake av et pan ( figur 2, trinn 3.1)).
- Bruk filtrert komprimert luft og pinsetter å trekk enheten ut av formen av holder på dratappen og blåse luft under enheten. Arbeide langsomt, slik at luften å separat PDMS fra formen, ta spesiell bekymre med tips av pinsett rundt delene tynn tunnel.
- Plasser PDMS enheten opp ned på innsiden av omslaget til et glass bunn rett slik at begrensende tunnel kiler berører plast ( figur 2, trinn 3.2).
- Plasser parabolen forsiden opp-ned zWEDGI og tilhørende glass bunn parabolen i en plasma renere med indre glass vender oppover ( figur 2, trinn 3.3).
- Evakuere plasma renhold kammer til trykket når 500 mTorr.
- Sett (radiofrekvens) makt til høy. Utsett enheten og parabolen med RF frekvens for ca 2 min. sakte de pressurize kammeret og returnere enheten og retten til rent hette.
- Fjerne PDMS enheten fra parabolen dekselet. Snu PDMS zWEDGI til riktig retning på glass ved å plassere den nøye på midten godt av glass bunnen rett ( figur 2, trinn 3.4)
- med bakenden av pinsett, trykk lett ned på PDMS enheten å sikre luftbobler er ikke fanget under. Bruk trykk rundt minutt geometrier av mikro kanalene og glatt PDMS til kantene ( figur 5C).
Merk: Komplett kontakt mellom PDMS og glass sikrer bedre tilslutning fra plasma binding. ZWEDGI være plasma limt på andre glass bottomed parabolen formater, for eksempel et glass bunn 6-og plate ( figur 2C). - Plasserer en cover over enheten rett før du fjerner fra rent panseret.
Merk: Når enhetene er rettet til glass, protokollen kan pauses før de er klare til bruk.
- med bakenden av pinsett, trykk lett ned på PDMS enheten å sikre luftbobler er ikke fanget under. Bruk trykk rundt minutt geometrier av mikro kanalene og glatt PDMS til kantene ( figur 5C).
4. Forberedelse og lasting Larvene
Merk: General sebrafisk dyrehold ble gjennomført per sebrafisk bok, tilgjengelig online på http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Voksen sebrafisk og embryo ble opprettholdt som beskrevet tidligere 1. Wild type AB belastningen ble brukt. Følg institusjonen ’ s Animal Care protokollen for detaljer om kravene for imaging live larver.
- Skyll kanalene med minimum 100 µL 70% etanol per kanal, bruker brønnene skylle gjennom den begrensende tunnel. Fjerne etanol og skyll 2 eller 3 ganger med dobbel destillert vann. La luften tørr.
- Fylle kanalene med skummet melk (i en konsentrasjon av 1% fortynnet i vann) for 10 min ved romtemperatur å minimere overholdelse av Larvene glass dekkglassvæske av retten. Deretter forsiktig senke enheten flere ganger i dobbel destillert vann til skyll. La luften tørr oppned.
Merk: Protokollen kan pauses her. Dette preparatet zWEDGI enheten kan gjøres flere dager før bruk. Store dekket ved romtemperatur. - Forberede 1% lavt Smeltepunkt poeng (LMP) agarose ved å kombinere 100 µL 2% smeltet LMP agarose med 100 µL 2 x Tricaine (0,4 mg/mL Tricaine - etyl 3-aminobenzoate) i E3 buffer 11 pre varmet til 38 o C. opprettholde 1% agarose/tricaine løsning på 38 o C i en varm blokk å hindre gelling.
Merk: For multiphoton mikroskopi 11, bruke enten un pigmentert sebrafisk varianter (som casper 12) eller vedlikeholde larver i E3 inneholder 0.2 mM N-phenylthiourea å hindre pigment formasjon 11 å minimere absorpsjon av de nær infrarøde bølgelengdene av pigment.
Forsiktig: N-phenylthiourea er giftige. Følg institusjonen ' s regler for avhending. - Anesthetize larver i E3 bufferen med 0,2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) 11. Vent til Larvene er urørlig og ikke-responsiv til en touch stimulans.
- Våt pre kanalene med noen microliters av Tricaine/E3.
- Plukke opp en enkelt Larven bruker et bredt orifice pipette tips. Innskudd Larvene til lasting kanalen ( figur 3A). Bruke en pipette tips eller lignende verktøy, orientere Larven i lasting kammeret slik at dorsal side ansikter rettere kanten av lasting kammeret og hale ansiktene mot begrensende tunnelen ( figur 3B).
- Trekke nøye væske fra såret kammeret, slik at larvene å strømme inn begrensende tunnelen ( Figur 3 c). Fjerne det meste av væsken samtidig fuktighet rundt Larven ( figur 3D). Denne prosessen kan få hjelp ved å vippe rett litt mot såret kammeret.
- Sett 1% LMP agarose i Tricaine/E3 (~ 38 o C) over Larvene ' s leder, fylle lasting kammeret ( figur 3E). Tillate agarose å størkne med Larven er riktig plassert. Legge til Tricaine/E3 til såret kammeret som nødvendig for å opprettholde hydration. Gjenta dette lasting prosessen for de gjenværende 2 kanalene.
- Bruker en sprøyte nål, forsiktig fjerne alle agarose som sivet gjennom begrensende tunnelen i såret kammeret ( figur 3F). Legge til ekstra tricaine/E3 rett over agarose (for såret, kortsiktige imaging eller sår behandling isolasjon) eller fylle kultur parabol (for langsiktig imaging). Erstatte kultur parabol lokket for å hindre fordampning. Larvene kan avbildet på dette punktet (unwounded) eller såret.
5. Såret og tenkelig Larvene
- med et sterilt skalpell blad, mudderbunn halefinnen bakenfor notochord 11 i såret chamber ( Figur 3 G, H). Legge til ekstra tricaine/E3 hvis nødvendig og erstatte kultur parabol lokket.
Merk: Alternativt avhengig av utviklingsmessige tidsvinduet rundt, larvene kan såret, lov til å gjenopprette i E3 og vedlikeholdes i en inkubator (28.5 o C) til den ønskede tenkelig tid, da de kan lastes inn i kanaler som beskrevet ovenfor. - Installere zWEDGI enheten med bedøvet larver på en invertert mikroskopet i en scene setter plass 60 mm glass bunnen rett. Finn halen av Larven i øverste kanalen, roterende parabolen som måtte få halen i ønsket posisjon. Bilde som kreves for det bestemte eksperimentet.
Note ZWEDGI er bredt aktuelt for høy oppløsning * lys, inkludert widefield fluorescens og laserskanning mikroskopi. Det er en rekke parameteren vurderinger når imaging sebrafisk larver, men bestemt imaging parametere er instrument, prøve og eksperimentere avhengige. Her, larver halen ble avbildet på en tilpasset bygge multiphoton mikroskop 5 , 11 bruker følgende parametere: 40 X lenge arbeider avstand vann nedsenking mål, 890 nm laser eksitasjon, 445/20 nm utslipp filter og 512 x 512 oppløsning.
6. Slutten av eksperimentet
- fjerne zWEDGI rett fra mikroskop. Euthanize Larvene ved å plassere zWEDGI enten på en isen vannbad eller ved 4 o C i minst 20 min og vurdere for fravær av hjerteslag og sirkulasjon.
Merk: Fordi Larvene beholdes i separate seksjoner, larvene individuelt gjenopprettes ved å trekke forsiktig på agar med tang eller pipette. Agar kan fjernes fra hodet regionen og Larven brukes for flere prosedyrer, for eksempel fiksering for antistoff flekker eller behandlet for RNA eller protein utvinning. - Etter fjerning av larver og agar, rent zWEDGI med etanol og destillert vann, som beskrevet i trinn 4.1 og sette opp ned til luft tørr. Store dekket i et kjølig, tørt sted. Nytt pels med skummet melk (trinn 4.2) etter behov før neste bruk.
Merk: zWEDGIs kan brukes på nytt flere ganger, til PDMS begynner å komme fra glasset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZWEDGI PDMS microfluidic enheten er et funksjonelt compartmentalized enhet designet for å huse fire hovedfunksjoner (nedenfor) forbundet med live bildebehandling av halefinne såret healing og gjenvekst i sebrafisk larvene. PDMS ble valgt zWEDGI fabrikasjon fordi det ikke er bare lett tilgjengelig og en industristandard for biocompatibility, men også fungerer godt i formene. I tillegg gjør PDMS enheten gjenbrukbare og blottet for hardt eller skarpe kanter når enheten er dannet. ZWEDGI spesielt tillater 1) lasting av Larvene inn i enheten, 2) tilbakeholdenhet i riktig retning for imaging, 3) såret halefinne og 4) mikroskopiske bildebehandling, beskrevet i detalj nedenfor.
Lasting
Den zWEDGI består av 3 kanaler, hver designet for å hindre en larve (figur 1B). Lasting og innledende orientering Larven er åpne lasting kammeret 3 mm bred (figur 1A) å imøtekomme et stort orifice pipette tips for innskudd en larve (figur 3A). Videre, lengden og bredden gir tilstrekkelig rom for å tillate etterfølgende manipulering av Larvene inn i riktig retning, med halen mot begrensende tunnelen og dorsal side mot toppen (figur 3B).
Selvbeherskelse
Når Larven er lastet inn i kanalen, kan det tegnede hale først i begrensende tunnelen ved fjerning av væske fra såret kammeret eller forsiktig skyve på plass med en pipette tips eller lignende verktøy (Figur 3 c). Trakt-formede geometrien av lasting chamber (figur 1A), fra 3 mm til 0,45 mm, guider Larvene inn ønsket lateral orientering (Figur 3 c). Retningen på Larven på siden begrenser halen ca parallelt med glass bunnen av parabolen for forbedret imaging. I motsetning til microfluidic enheter med silisiumskiver, trenger geometrier av 3D trykt muggsopp ikke være konsekvent i z-retningen. Derfor er begrensende tunnelen dekket og konisk i z-aksen slik at oppføringen er større enn utgangen, fra 0,5 mm til 0.3 mm høyde (figur 1B, isometrisk visning av tunnelen). Denne avsmalnende forenkler veiledning av Larven og sammenslåing av halen mot dekselet glasset imaging overflaten. Denne funksjonaliteten eliminerer behovet å orientere prøven mens agarose er hardere.
Væske fjernes fra lasting kammer (figur 3D) og erstattes med lavt Smeltepunkt agarose å stabilisere hodet innenfor kanalen mens halen opprettholdes Lakewood buffer i såret kammeret (figur 3E). Den minimal agarose som kan lekke gjennom begrensende tunnelen kan enkelt fjernes fra såret kammer (figur 3F). Mangel på agarose i såret kammeret tillater hemningsløs gjenvekst og utvikling av halefinne5.
Såret
Når Larven er lastet gjennom tunnelen og hodet hemmet av agarose, er halefinnen tilgjengelig for transection fordi det stikker ut i såret kammeret. Halvsirkel såret kammeret motposteres 1,9 mm fra vannrett symmetri. Dette tillater skalpell bladet settes rett over halefinnen, slik at nok plass for bladet trekkes ned over halen, transecting halefinnen (Figur 3 g). Den bredeste delen av den 7 mm diameter halvsirkelen oppstår hvor halen er såret for denne bevegelsen. I tillegg tillater brukeren å sår Larven, gir denne compartmentalized design muligheten for regionale anvendelse av forbindelser til halen regionen5. Denne unike funksjonen semi isolasjon ville tillate for lokaliserte testing av effekten av ulike legemidler, kjemikalier eller biologiske midler på såret helbredelsesprosessen.
Bildebehandling
Målet med zWEDGI enheten er å tillate høyoppløselig lys mikroskopi avbilding av sebrafisk halefinnen, uhindret av agarose innebygging. Derfor er PDMS enheten limt til et kommersielt tilgjengelig glass bunnen rett, å gi en optisk kvalitet overflate for mikroskopi bruker høy NA linser. Her presenterer vi profilen benytter multiphoton mikroskopi for andre harmonisk (SHG) avbildning av kollagen fibrene i halefinnen for å illustrere tenkelig evnene av zWEDGI. Men kan zWEDGI brukes på andre * lys metoder, som AC confocal mikroskopi, utnytte en invertert mikroskop scenen konfigurasjon. Med zWEDGI, i motsetning til metoden agarose embedding med påfølgende fjerning, kan lett halefinnen avbildes i enheten før såret (figur 4A), såret i enheten, deretter umiddelbart tilbake til mikroskopet for etter sår Imaging (figur 4B-E). Tidligere arbeid identifisert endringer i kollagen fiber organisasjonen under såret helbredelsesprosessen bruker SHG. 13 SHG kan brukes til å finne enkelte typer bestilte strukturer, inkludert fibrillar kollagen, uten bruk av eksogene etiketter. 14 bildet kvalitet av levende caudal finnene avbildet i zWEDGI var det innhentet i fast vev5 men zWEDGI gir en rekke fordeler. Viktigst, kan halefinne healing og gjenvekst fortsette uhindret av agarose innebygging larver overlevelse ligner på Larvene vokst hemningsløs5. Fordi såret kan utføres mens Larven er i enheten, kan videre pre og post såret samles på samme halefinnen (figur 4A). ZWEDGI tillater samlingen av 3 dimensjonale data over tid, gir en mer fullstendig oversikt over de dynamiske endringene forekommer i strukturen i den ekstracellulære matrisen (figur 4B). Illustrert her er SHG fiber sår avslapning i 3 dimensjoner, etter såret i zWEDGI. Før såret, oppdaget SHG kollagenfibre stråle utover fra notochord til fin spissen, (figur 4A). Kort tid etter såret avstanden mellom spissen av innleide fin og sentrum av the fin øker med såret avslapning. 3D-natur datainnsamling tillater romlige gjenoppbygging, benytter rendering programvare som Imaris. Disse rekonstruksjoner og de påfølgende rotasjonsalternativer, illustrerer sammentrekning og avslapping av fin skjer ikke bare i x y flyet i bildesamlingen (Figur 4 B, C, D), men også i z-aksen (Figur 4 G-J, L-O, Q-T; Supplerende filmer 1, 2) som halen flater fra oppadgående krøller av kontrakt. ZWEDGI kan brukes med andre tenkelig modaliteter over lengre perioder, som bruk av AC confocal mikroskopi til bildet neurons under halefinne utvikling over 24 h5. Fordi enhetens begrensende enheter er stilt opp parallell, dermed eliminere behovet for å dreie ved å finne larvene, definere mikroskopet og flytte mellom flere prøven for bildebehandling er enkelt og kan automatiseres å samle time-lapse bildedata av flere larver. For å utvide antall eksempler som kan avbildes, kan PDMS zWEDGI enheten plasseres i andre glass bottomed formater, for eksempel en 6-vel plate (figur 2C).
Figur 1 : Siste Design skjematisk (A) Skjematisk viser generelle layouten og målinger av zWEDGI enheten, utheving terminologi av funksjonelt compartmentalized kamre. (B) isometrisk visning PDMS enhet som fjernet fra mold. (C) innfelt viser tunnel, utheving endringen i inn- og utgangseffekter høyder. (D) modell av Larven behersket i enheten. Figur endret fra en tidligere publisere artikkel5 med opptrykk tillatelse fra sebrafisk Journal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Fabrikasjon skjematisk (A) Trinn 1 begynner med utformingen av enheten mold i en 3D modellering programvare (1.1) som er så 3D trykt (1.2). Formene er UV-lys kurert pusset og renset så hevet geometrier har selv høyden (1.3). Trinn 2 innebærer fylle formene med blandet og degassed PDMS (2.1) og bruke en glass plate over mold på skrå å forhindre overlapping luftbobler i enheten PDMS (2.2). Glasset og mold er festet sammen (2,3) for herding i en ovn ved 100oC i minst en time (2,4). Trinn 3 bruker filtrert luft og flat-tipped pinsett for å fjerne PDMS enheten fra formen (3.1). Enheten er deretter plassert på toppen av tenkelig parabolen lokket (3,2) og er behandlet plasma (3.3), sammen med glass bunnen, å tillate PDMS å følge glass bunnen rett (3,4). (B) ferdig zWEDGI enheten bånd i et glass bunn rett og klar for tenkelig bruk. (C) flere zWEDGI enheter kan plasseres i et glass bunn 6-vel plate for å bilde mange larver i samme eksperiment. Figur endret fra en tidligere publisere artikkel5 med opptrykk tillatelse fra sebrafisk Journal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Lasting og såret av larve i zWEDGI (A) En Larven er lastet inn i lasting kammeret ved hjelp av en bred-orifice pipette. (B) Larven er orientert med dorsal side mot den flate delen av lasting kammer trakt og hale mot begrensende tunnelen. (C) ved hjelp av suge fra spissen pipette holdt ved inngangen til såret kammeret, Larven er trukket inn i tunnelen, plasserer den i riktig retning for bildebehandling. (D) væske fjernes fra lasting kammer å tillate (E) tillegg av agarose rundt hodet regionen å stabilisere Larven. Agarose er rød her for demonstrasjon hensikt bare. Minimal agarose lekkasjer i såret kammeret og kan lett fjernet som vist i (F). (G) for å sår når Larven er tilbakeholdne i kanalen, er en skalpell blad settes inn over Larven og skiver ned over halefinnen, bakenfor notochord. (H) Larven er nå klar for post såret bildebehandling. Skalere bar (A-H) = 1 mm; Skalere bar (F) = 1 mm; Skalere bar (G) = 1 mm. figur endret fra en tidligere publisere artikkel5 med opptrykk tillatelse fra sebrafisk Journal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : 3D multiphoton tidsforløp imaging av SHG fibrene i sebrafisk halefinnen, pre og post såret, i zWEDGI. ZWEDGI design gir muligheten for høy oppløsning bilder, i dette tilfellet SHG fiber organisasjon foregående (pre sår) og følge caudal fin transection (etter sår). Dataene ble samlet som z-stabler med 4 min intervaller. (AE) viser SHG fibre i halefinnen som en projeksjon av z-stabler, før og på fire intervaller etter transection. Z-projeksjon ble utført ved hjelp av ImageJ programvare. 15 t = 0 var starten på bildebehandling, ca 20 minutter etter transection. Dobbel pilene angir økningen i avstand på spissen av såret kanten (kort hvit linje) fra plasseringen til notochord (lange hvite linjen) i løpet av såret etter første sammentrekning. (FJ). Skrå 3D rekonstruksjon av de opprinnelige dataene. (Ko). Overflaten gjengivelse av skrå 3D rekonstruksjon vist i F-J. (PT). Visninger av 3D rekonstruksjon overflaten gjengivelsen, illustrerer hvordan Sammentrekningen og avslappingen oppstår i 3-dimensjonale rommet, som kan vurderes med disse dataene samles inn med zWEDGI der halefinnen er ikke begrenset av agarose. Skalere bar (AE) = 100 mikrometer; Skalere bar (F-T) =100 mikrometer. 3D-gjengivelser ble utført ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Se også ekstra filmer 1 og 2. Figur endret fra en tidligere publisere artikkel5 med opptrykk tillatelse fra sebrafisk Journal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Avgjørende skritt av zWEDGI fabrikasjon (A) For å sikre at ingen bobler form eller blir fanget i enheten når clamping på glass platen, degas etter at PDMS er fylt i formene og skråstilling klem glasset når det gjelder PDMS i mold. I tillegg for å hindre at PDMS "blinker" over lasting og såret chambers, sikre å sand toppen av enheten nøye for å sikre at er overflater av geometrier flush når clamping på glasset. (B) når enheten er tilstrekkelig herdet i ovnen, luftlommer mellom PDMS og mold indikerer at enheten vil være lett å fjerne. Hvis enheten ikke fjerner lett, sannsynligvis på grunn av utilstrekkelig kur tid eller temperatur eller mold selv er ikke tilstrekkelig UV-herdet, resulterer i gjenværende harpiks forurensning av PDMS. (C) når enheten glass bunnen rett etter plasma behandling, bruke lett trykk med bakenden pinsett, starter på regionene tunnelen og jobber utover mot kanten av enheten. Hvis enheten ikke bindingen Vel, som indikert av luftlommer mellom enheten og glass, forlenge tiden i plasma-bonder, og kontroller at det er ingen støv mellom PDMS og glass overflaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra film 1: skrå 3D-overflate gjengivelse av multiphoton tid lapse bilder av SHG fibrene i halefinnen under avslapning etter såret. SHG fibre i halefinnen avbildet som zstacks over tid etter såret (starten av filmen er ca 20 min etter såret) i zWEDGI. Z-stabler ble ombygget og overflaten gjengis ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Hale skrå vise tre dimensionality. Fremre er til venstre. Filmen tilsvarer stillbilder i Figur 4 (ko). Skala bar = 50 mikron. Klikk her for å laste ned filmen.
Ekstra Movie 2: Side-visning av 3D-overflate gjengivelse av multiphoton tid lapse bilder av SHG fibrene i halefinnen under avslapning etter såret. SHG fibre i halefinnen avbildet som zstacks over tid etter såret (starten av filmen er ca 20 min etter såret) i zWEDGI. Z-stabler ble ombygget og overflaten gjengis ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Side-visning vist å understreke erobringen av dynamiske endringer i z-aksen. Fremre er til venstre. Filmen tilsvarer stillbilder i Figur 4 (PT). Skala bar = 40 mikron. Klikk her for å laste ned filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med zWEDGI enheten er å fange 3D tidsforløp imaging stabilisere og orientere fisken innen de små arbeider fra et høyoppløselig mikroskop mål. Mens møte disse design spesifikasjoner, er det også en forbedring over tradisjonelle agar-baserte forberedelse til live bildebehandling. Det er tre viktige trinn (nedenfor) i produksjon av zWEDGI, som, hvis det ikke gjøres riktig, kan resultere i defekt enheter:
PDMS forberedelse (figur 5A)
For å hindre bobler, degas formene når PDMS er lagt. Kontroller at alle bobler har blitt eliminert etter avgassing og pass på anvendelse av platen glass. Glass platen må brukes på skrå slik at luften ikke er å bli fanget under og i PDMS. Støv kan være et problem i de fleste trinnene i prosessen. Hindre støv, fullføre hver rengjøringstrinnet grundig og lagre delene i en ren hette mellom trinn. Sjekk former for overskytende resin kan opprette en ru overflate før UV-herding. Når sliping, sørg for at sand papir kontaktene alle geometrier for å sikre at alle overflater er flush (figur 2, trinn 1.3). Alltid rene med isopropyl alkohol og rett før fylle formene med PDMS. Når klemme den ekstra PDMS ut av formen, sikre klemme tett holder formen og glass cover sammen (figur 2, trinn 2.3).
Fjerne enheten fra mold (figur 5B)
Sikre ovnen er minst 100 o C og kur tid er minst 1-1,5 t. Hvis PDMS ikke er tilstrekkelig helbredet, kan det være vanskelig å fjerne fra mold. Andre muligheter for fjerner omfatter ikke blande PDMS reagenser lenge nok, bruker feil prosenter av base og herder eller leftover harpiks igjen i mold etter 3D utskrift som deretter forurenser i PDMS. Etter fjerning fra ovnen indikerer luftlommer mellom enheten og mold (figur 5B) at enheten vil lett fjernes.
Overholdelse av PDMS glass bunn parabolen (figur 5C)
Dårlig tilslutning til glass rett kan skyldes støv, skjevheter eller angitt tilstrekkelig lengde for plasma behandling. Når du monterer enheten på glasset, tips parabolen i vinkel og center PDMS på glass sirkelen slik at det berører ikke kantene av brønnen. Hvis enheten ikke følger, trykk enheten på glass slip med baksiden av pinsett, begynner på regionen delikat tunnelen og trykke utover til kantene. Hvis enheten fremdeles ikke følger, eksperimentere ved å øke tiden i plasma renere i intervaller på ett minutt.
Mens Larvene kan avbildes i enheten for en kort tid (minutter) uten bruk av agar, for langsiktig live bildebehandling regionen halefinnen, er agar plassert på hodet i lasting kammeret Når fisken er lastet. Selv om denne bruken av agar ikke synes å påvirke sårheling svar eller levedyktighet av Larvene5, kan dette påvirke studiet av flere fremre regioner næringsplante. Selv om vi har kunnet bilde Larvene opptil 60 h har vi ikke undersøkt om levedyktighet bli påvirket med lengre tenkelig ganger. I tillegg var den spesielle designen presenteres her optimalisert for alder 2 til 4 dager innlegget befruktning (dpf) Larvene liggende på sine sider for hale transection og sårtilheling bildebehandling. Andre utviklingsstadier, orientering og eksperimentelle protokoller kan kreve endringer i utformingen. Men gjør den tilsiktede funksjonell fleksibilitet i utformingen det lett mottakelig for slike endringer.
I tillegg krever fabrikasjon av denne enheten tilgang til en 3D-skriver og andre microfluidic materialer og utstyr, slik som PDMS og et plasma renere, potensielt begrense tilgjengeligheten av enheten for noen brukere. Men ble denne metoden av mold fabrikasjon valgt siden 3D utskriftsmulighetene, sammen med microfluidics fabrikasjon, blir stadig mer utbredt på akademisk studiesteder. I tillegg finnes det tjenesteleverandører for 3D utskrift tilgjengelig, som teknologien utvikler seg raskt og kostnaden av skrivere reduseres.
Gitt sin compartmentalized design og funksjonalitet, tilbyr zWEDGI forbedringer over det gjeldende teknikken for tid forfalle bildesamlingen med agar innebygging. Først omgir agarose ikke regionen halen i zWEDGI, tillater sårheling og regeneration til fremgang uhemmet mens overlevelsen av larver i zWEDGI kan sammenlignes med innebygd og finnes5. Dernest kan bruken av høyoppløselig 3D-utskrift å dikte formene zWEDGI ha unike skrånende geometrier å orientere Larven i tre dimensjoner med hensyn til tenkelig flyet. Dette fjerner tid avhengighet av manipulere Larvene til en riktig retning som agar stivner. En tredje viktig fordel av zWEDGI design er åpne kammeret design som tillater hale og hode områder være tilgjengelig for eksperimentell manipulasjon. Dette er av spesiell interesse for sårheling studier, men dette gjør også at zWEDGI et potensielt nyttig verktøy for andre manipulasjoner. Avdelingsflytting utformingen av enheten, videre gir mulighet for regionale program av forbindelser under eksperimentering. Enheten semi isolert hodet fra halen på grunn av diffusjon differensial buffer (i såret kammeret) og agarose (i lasting chamber)5, tillater bruk av forbindelser mens han studerte sårheling eller andre biologiske prosesser. I tillegg fordi Larvene er montert i separate kanaler, personlige Larven kan identifiseres og hentet etter bildebehandling for ytterligere behandling som RNA eller protein rensing eller antistoff merking. Og til slutt, fordi enheten er laget av PDMS som har vært limt til glasset bunn parabolen, enheten er gjenbrukbare når Larvene er fjernet.
I fremover, vil den modulære design og brukervennlighet fabrikasjon av zWEDGI egner seg godt til endringen for endret funksjonalitet. Foreløpig er avdelingsflytting geometrier bygget spesielt for de såret og tenkelig eksperimentene beskrevet, gir det bred søknad om live bildebehandling sårtilheling. Imidlertid ligger Larven direkte på glasset, slik at ingen materiale (dvs. PDMS), som kan forstyrre bildebehandling, eksisterer mellom Larven og tenkelig overflaten. Derfor andre regioner av larvene, som bagasjerommet, would være tilgjengelig for bildebehandling. I tillegg kan utformingen av 3D trykt mold av zWEDGI lett bli endret til andre utviklingsstadier, forskjellige retninger Larven og variert behandlinger. Disse attributtene gjør det derfor et verdifullt verktøy for å fange tid forfalle mikroskopi hendelser over en rekke tidsskalaer. Bruk av andre glass bunnen rett formater kan tillate større PDMS og plass til flere kanaler. Gitt den økende tilgjengeligheten til 3D utskrift fabrikasjon teknikker og påfølgende enkel endring for en rekke eksperimentelle protokoller, zWEDGI kan vise seg for å være et kraftig verktøy i riket av høy oppløsning live bildebehandling mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne primære prosjektfinansiering fra Morgridge Institutt for forskning og laboratoriet for optisk og beregningsorientert instrumentering. Vi erkjenner også finansiering fra NIH # R01GM102924 (AH og KWE). KH, JMS, RS, AH og KWE unnfanget og utformet studien. KH og JMS utført alle eksperimenter med støtte fra DL, KP og RS. KH, JS, RS, AH og KWE bidratt til skriving av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
