Summary
巨核球の人口は非常に純粋なコードから得られる血由来 CD34+細胞。CD34 のメソッド+細胞分離と巨核球分化をここで説明します。
Abstract
血小板は、骨髄血小板と呼ばれるプロセスで主に発生します。血小板産生、中に造血前駆細胞は巨核球は、proplatelets と呼ばれる長い細胞質プロセスから血小板を解放する区別する末期と呼ばれるフォーム血小板前駆細胞に区別します。巨核球は骨髄に閉じ込められた珍しいセルであり、実験室の使用のための十分な数字で収穫することは困難であるため。ヒト巨核球を効率的に生産することができます達成体外CD34 を養殖+の適した条件下のセルします。ここで詳細なプロトコル CD34 の分離を記述する臍帯血液サンプルから磁気セルソーターによる細胞の+ 。無血清条件下で非常に純粋な成熟した巨核球の生成に必要な手順を示します。巨核球分化の表現型解析および proplatelet の形成と血小板の生産の決定の詳細もあります。巨核球分化および/または抗血小板抗体などトロンボポエチン ヒューマンミメティック最前線の proplatelet の形成に影響を与えるエフェクターは、生物学的機能を調べるための培養細胞に追加できます。
Introduction
通常研究室用プライマリ ヒト巨核球 (MK) の十分な数の分離は不可能です、骨髄での低周波による有核細胞1の ~0.01% のアカウントは、彼ら。便利な代替手段は、拡張前のヴィヴォと造血幹・前駆細胞の特定の成長因子の存在下で分化です。巨核芽球の文化の最も効果的な成長および分化因子は、MKs。 トロンボポエチン (TPO) を生産する培養システムの採用 (SCF; c キット リガンド) 幹細胞因子とインターロイキン (IL)-3 IL 11 などサイトカインの数がされています。単独で、または SCF と IL 32などの他のサイトカインが有効であります。TPO は、増殖と MKs2の成熟の両方で発生する幹細胞集団を操作できます。
1000 までは毎日 150-400 x 109/L. 血小板生産の in vitroの血小板数を維持するために形成された proplatelets と呼ばれる細胞質突起から MK プロデュース血小板や、生体内で約 1 × 10 の11の血小板が-これは CD34 を使用して多数の培養条件に上昇を与えているし体内の見積もり3より低いフォールド+を改善する MK と血小板生産体外造血前駆細胞。CD34 の初期ソース+ MK 分化用細胞は、ひと末梢血4だった。骨髄5,6、胚性幹細胞/誘導多能性幹細胞 (ESC/iPSC)7臍帯血 (UCB)8,9,10 などの他の細胞の源.ひと骨髄 CD34+ 11とマウス系統負, 骨髄細胞5生産 MK と血小板体外;人間の骨髄の可用性の欠如が CD34 のソースとしての使用を制限するそれにもかかわらず、+のセル。対照的に、ESC と iPSCの in vitro血小板の生産のための細胞の無制限のソースを表します。これらの細胞からの血小板の生産には、フィーダー細胞マウス OP9 細胞長期培養などが必要です。フィーダー無料条件で派生した血小板は、少ない機能12のように見えます。iPSC 由来血小板が大規模に拡張することができますので、臨床の現場で使用する可能性があります。このプロセスには、転写因子と長期的な細胞文化13レンチウイルスベクターを介した情報伝達が必要です。
UCB は CD34 のアクセス ソース+で容易に使用することができます細胞研究設定。TPO だけではコードの分化を促進することができます血由来 CD34+の血清添加またはフィーダー細胞との共培養を必要とせず非常に純粋な成熟した MKs を生じさせる細胞とこれ。他のサイトカイン SCF UCB CD34 から分化が低下するなど、+細胞、フェルマーの最終定理 3 配位子と IL-11 未熟な巨核球14の生産を推進中。このプロトコルは非常に純粋な臍帯血 CD34 から MK 文化+の生産を記述する無血清条件下で細胞。
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Protocol
このプロトコルは南東シドニー人間研究倫理委員会で承認され、大学のニュー ・ サウス ・ ウェールズの人間研究倫理委員会によって批准されました。健康なドナーから得られる臍帯血によって、シドニーの臍帯血バンク (シドニー, ニューサウス ウェールズ州, オーストラリア) が提供されました。約 100 mL のボリュームは、この手順で使用されました。
メモ: クラス II バイオ セーフティ キャビネットの無菌技術を使用であります。70% エタノールで臍帯血バッグの外側を消毒します。この手順 (はさみ、ピンセット) 滅菌器具を使用します。
1. 臍帯血細胞調製と CD34 の単離細胞の+
- 滅菌分離バッファー (SB) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で、pH 7.2, と含まれている 0.5% のウシの血清アルブミンと 2 mM EDTA を準備します。
- (血液の 10 mL あたり 1 つの管が必要) 50 mL コニカル チューブに SB の 10 mL を分注します。10 mL のシリンジにマウントされている G18 鈍針を使用して、バッグから 10 ミリリットルの血液を描画し、SB の 10 mL を含む 50 mL チューブに分注します。
- 2 つの層を作成する、希釈血液の入ったチューブの底部に 15 mL のリンパ球分離培 (材料の表を参照) を追加します。
注: は、異なる層の混合を避けるために管の下でゆっくりとメディアを調剤します。 - 区切りなしとアクセラレータなし室温 (RT) で 30 分間 1,200 × g でチューブを遠心します。
- パスツール ピペットを使用して新しい 50 mL チューブに単核細胞 (各チューブから約 5-10 mL) を格納筒の中心に近い層を転送します。各容量 50 mL のチューブに SB を追加します。
- RT。 破棄で 10 分の 400 × g で遠心上清。
- 浮遊細胞 SB. コンバインの 5-10 mL のパスツール ピペットで注意深く細胞ペレットを再懸濁します、SB にて 50 mL にボリュームをもたらします。
- トリパン ブルー染色および診断を使用して、または自動のセルを数える細胞カウンター (材料の表を参照してください)。CD34 のパーセンテージを決定+のセルをサンプルでは、2.5 × 10 を再懸濁します5セル SB と染色の 100 μ L で 4 ° C で 15-30 分の抗 CD34 PE 抗体の 10 μ L を追加することによってフローサイトメトリー (図 1 a) によって分析します。
- 4 ° C で 10 分間 400 × g で遠心管上清を捨てます。
注: すぐに必要でなければ、単核細胞はこの段階で冷凍することができます。 - SB の 300 μ L 108細胞/細胞を再懸濁します。FcR はヒト IgG の 100 μ L を追加 (ブロッキング試薬、材料表を参照) と 10 の8セルあたり CD34 磁気ビーズの 100 μ L。穏やかに混合し、, 4 ° C、30-40 分で。
メモ: 単一細胞懸濁液は必要です (必要に応じて、細胞を通過も 30 μ m フィルター試薬を追加する前に)。記載されている以下の 10 の8セルの試薬ボリュームを使用します。以上 10 の8セル試薬 (SB、ブロッキング、および、CD34 磁気ビーズ) をそれに応じてスケール アップします。 - マグネット ホルダーに LS 列を配置し SB. 破棄の 3 mL 洗浄廃液、潜伏期間中に LS 分離カラムを準備します。
注意: LS 分離カラムは最大 2 × 10 の8セルの総数をロードできます。小さくより大きい列があります。 - セルの混合物に SB の 5-10 mL を追加し、400 × g で 10 分間遠心上清を破棄します。
- SB の 1.5 mL の細胞を再懸濁します、LS 列に細胞懸濁液 (1.5 mL) を読み込みます。15 mL コレクション チューブ (負の分数 #1) のラベルのないセルを含む流れを収集します。ドレインし、SB の 1.5 mL でコラムを洗浄液ができます。
- (3 mL) を通じて収集した流れを列に読み込むし、同じ 15 mL コレクション チューブ (負の分数 #1) の流れを収集します。SB の 3 mL で 3 回 LS 列を洗います。
注: 必要な場合、負の分数 (12 mL) でセルと汚されることができる抗 CD34 抗体 CD34 のキャプチャを確認するために+ LS 列による細胞します。 - 磁選機から列を削除し、SB の 2 mL で新しい 15 mL チューブに注射器のプランジャーをゆっくりと細胞をフラッシュします。
- 列に戻って戻って磁気分離装置と負荷セルの 2 mL に列を配置します。流れを収集し、2 ml の SB を洗います。これは、負の分数 #2 (4 mL) です。
- 磁気分離装置から LS 列を削除し、CD34 を収集するためにシリンジのプランジャーで着実に、しっかりと SB. フラッシュ セルの 2 mL を追加+細胞画分。トリパン ブルー染色、検定または自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
- 4 ° C で 15 分間 400 × g で肯定的な分画遠心分離機管上清を捨てます。Cd34 陽性の血清自由な媒体の細胞を再懸濁します+細胞 (SFM、材料表を参照してください)。
注: すぐに必要でなければ、セルを固定できる液体窒素でこの段階で。
2. 純度チェック分離 cd34 陽性細胞の+
- 2 x 104 10 μ L 抗 CD34 PE 抗体と 4 ° C (アイソタイプ コントロールのために個別のチューブ使用) で 15 分の 20 μ L 抗 CD45 PerCP 抗体陽性分画細胞を染色 (図 1 b)。
- 洗浄する SB の 1 mL を追加します。400 × g で 10 分間の遠心分離機の SB の 200 μ L にペレットを再懸濁します。
- フローサイトメトリーによる解析を行い、ゲートの残骸 (図 1 b) を除外する生きているセルの人口。PE、PerCP アイソタイプ コントロール (図 1 b) を使って PE、PerCP の肯定的な人口のためにゲートを設定および cd34 陽性の割合を決定する+/CD45+細胞。
3. 巨核球分化
- シード 5 × 105セル/mL cd34 陽性細胞 12 ウェル プレートのウェルあたり 50 ng/mL の組換え人間トロンボポエチン (rhTPO) を添加した SFM の 2 mL の+ 。37 ° c、5% CO2加湿雰囲気の中で細胞を孵化させなさい。分析のために必要である前に、細胞が合流、セルを収穫し、新鮮なメディアと rhTPO の複数の井戸に分割します。
注: 2 つまたは 3 つの井戸は、異なる時点 (例えば7、9、および 10 日間) で分化を監視するために特に準備されるべき。 - 他の井戸のセルを妨げないで分化を監視するために脇の井戸から細胞を採取します。
- 20 μ L 抗アスピリン/CD41 FITC 抗体で染色細胞と 100 μ L の最終巻で 10 μ L 抗 GPIX/CD42a Alexa Fluor 647 抗体コントロール設定はそれぞれアイソタイプ コントロール抗体を用いた管します。4 ° C で 15-30 分間インキュベートします。
- 洗浄する SB の 1 mL を追加します。
- 洗浄する SB の 1 mL を追加します。400 × g で 10 分間遠心分離が 100 でペレットを再懸濁します SB と 30 s. 空気乾燥、メタノールで浸ることによってスライドの 5 分修正セル 1,000 x g でスライド ガラス上にスピンの μ L を追加 DAPI を含むメディアのマウントの 20 μ L (材料の表を参照)、、coverslip でカバーし、蛍光顕微鏡 (図 2 a) を使って視覚化。
- 2 mL PBS/0.1% トリトン X100 で洗って 10 分 400 × g で遠心分離機、同じバッファーの 100 μ L で再懸濁し、抗マウス IgG Alexa 594 と抗うさぎ IgG アレクサ 488 (1: 100) を追加します。室温で 30 分間インキュベート、2 mL PBS/0.1% トリトン X100 で洗って、同じバッファーの 100 μ L で再懸濁します、CD42b APC アンチの 20 μ L を追加します。3.6.1 の手順で説明するようにスライド ガラスに細胞をスピンし、3.6.1 の手順で説明するよう、顕微鏡可視化のサンプルを準備します。
- SB の 1 mL で 1 回洗浄し、低張性クエン酸バッファー (1.25 mM クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム 2.5 mM、3.5 mM ブドウ糖) 含む 20 μ g/ml propidium ヨウ化物及び 0.05% の 300 μ L でペレットを再懸濁しますトリトン X 100。光から保護 4 ° C で 15 分間インキュベートします。
- 最終濃度 20 μ G/ml に RNase を追加し、光から保護 4 ° C で 30 分間インキュベートします。CD41 FITC+の人口 (図 2) の 30,000 に 50,000 イベントを収集して、フローサイトメトリーによる propidium ヨウ化物の強度を決定します。
4. proplatelet カウント、血小板の列挙、および血小板の活性化
- 1 × 104細胞/ウェル 50 ng/mL rhTPO を添加した新鮮な SFM の 200 μ L で 48 ウェル プレートでの日 8 または 9 の分化と種 (ステップ 3.1) から細胞を採取します。37 ° C、5% で 5 日間文化 CO2.
注: 定量用、種子は 3 通の井戸します。この低密度は可視化に必要な文化の 2 日後に表示される proplatelet 担 MK. Proplatelets 通常のカウント開始。ピークは、4 日から 5 日間です。 - 10 X、20 X 目標を用いた倒立顕微鏡上全体の井戸の proplatelet ベアリング MK の数をカウントします。
注: 温水 (37 ° C) 顕微鏡のステージは、proplatelet 拡張子の収縮を引き起こす長時間室温で細胞を維持するので望ましい。Proplatelets は、MK の体から長い拡張子として観察されます。各 MK proplatelet いくつかの突起があります。Proplatelets を開発し、MK の本体サイズが小さくなります。 - 細胞を収穫し、室温で 10 分間 400 × g で遠心分離機します。3.3 と 3.4 の手順で説明するように 20 μ L 抗ひと CD41 FITC 抗体で細胞を染色します。Proplatelet ベアリング MK (pbMK) のパーセンテージを計算: pbMK (%) = [(Proplatelet ベアリング MKs よく/)/(総 CD41+細胞/ウェル)] x 100
- 培養液中に放出される血小板をカウントするには、優しくパスツール ピペットで細胞をミックスし、14 または 15 文化の日で 100 μ L を収集します。
- 4 ° C で 20-30 分の 20 μ L 抗ひと CD41 FITC 抗体で染色します。それぞれのアイソタイプ コントロール抗体を用いた制御管を設定します。
- SB の 150 μ L とビーズを数えるの 50 μ L を追加します。
- フローサイトメトリーによる解析、FSC と SSC を対数スケールを設定します。血小板豊富な血しょうから使用通常ひと血小板は、セクション 4.4.1 血小板 (図 3 a) のゲートを設定するの説明に従って CD41 FITC と汚れます。
- フローサイトメトリーによるビーズを数えるとステンド グラスの血小板を分析します。SSC 散布図 (図 3 a) と FSC を用いたビーズを数える 1,000 イベントを収集します。CD41 FITC ポジティブなイベント (図 3 b) 数式を使用してに基づく血小板の数を計算します。
Μ L あたり血小板 = [(CD41 FITC 肯定的なイベントの番号)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/ボリュームのサンプル)]
- 血小板の活性化を分析するには、優しくパスツール ピペットで細胞をミックスし、14 または 15 文化の日で 100 μ L を収集します。細胞のペレットに 5 分間、200 x g でタイロード バッファー (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、 0.2 mM Na2HPO4、12 mM NaHCO3、5.5 mM D-グルコース、pH 6.5) および遠心分離機の 1 mL を追加します。
- 血小板サイズの粒子をペレットに 10 分間、800 × g で遠心、上清を収集します。
- 上澄みを廃棄し、タイロード バッファーの 100 μ L で再懸濁します。PAC1 FITC 抗体とアデノシン二リン酸 (ADP) の 20 μ L を加える最終濃度 20 μ M の FITC 肯定的なイベントの割合を決定するため 20 分分析フローサイトメトリーによる部屋の温度で加温。肯定的な制御 (図 3) と同じように扱われる新鮮なひと血小板を使用します。
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Representative Results
このプロトコルにより、コードから高純度の MK 文化準備血由来 CD34+細胞。CD34 の割合+細胞コード血は約 1.315 (図 1 a)、10 x 90-300 から単核細胞 (ステップ 1.8) 範囲の総数 UCB 単位6 。CD34 の純度 + CD45 陽性細胞分離範囲は 90 から 99% (図 1 b) 後。MK (CD41 として定義されている+細胞) 無血清 CD34 の早い段階で観察される+細胞 rhTPO の存在下で培養します。7 日の割合成熟 MK (CD41+と CD42a+細胞) は通常 30-40% (図 1)。最高レベルの CD41+と CD42a+ 10 と分化 (図 1) の 12 日間二重陽性細胞 (90-99%) が観察されます。観測された変動は、主に臍帯血のソースと CD34 の純度によって異なります+/CD45+ 1.17 の手順で分離した細胞。5-10 入力 CD34 あたりから 10 日目の範囲に成熟した MK の収量+セル。MK の成熟 (CD41+/CD42b+) 蛍光灯の下で観察された顕微鏡は、図 2 aに示すように。培養 MK は、大規模な通常多核巨細胞の細胞 (図 2 aの矢印) として表示されます。MK の細分化されたコンテンツは、vWf (緑) と CD62p (p-セレクチン ・ タンパク、赤) 染色 (図 2 b) によって決定されました。培養 mks 単位の倍数性の分布を図 2に示します。
Proplatelets は、長い、ビーズの繊維または MK ボディから伸びるフィラメントです。Proplatelets は数百 μ m の長い16で、枝と膨張した地域でできます。Proplatelet ベアリング MK の特徴は、図 2 Dで示されています。Proplatelet ベアリング MK (pbMK) の割合は 1.3 ± 0.17%。
血小板は、分析およびプロトコルで記述としてカウントできます。図 3Bに示すとおり、ほとんど血小板細胞培養上清中には末梢血血小板とは血小板マーカー CD41 陽性 (図 3 b) の分析のゲートに分類されます。このメソッドの範囲 19 から文化で生産された MK. 血小板あたり 42 血小板から血小板収量血小板アゴニスト活性化固有 PAC1 モノクローナル抗体 (図 3) の結合の増加によって決定される ADP などによってアクティブにできます。.
図 1: 流れ cytometry CD34 のプロット+細胞の分離・培養に MK 分化します。(A) 単核細胞 (左のパネルのように、ゲート) 臍帯血 (ステップ 1.8) から精製されたが、CD34 のパーセンテージを決定抗 CD34 PE 抗体で染色されたサンプル (1.3%、右側のパネル) では細胞の+ 。(B)分離後、正の分数 (ステップ 1.17) は、抗 CD34 PE と抗 CD45 PerCP 抗体で染まっていた。濃縮 CD34+人口は (98.1%、右側のパネル、右上象限) の図に示されています。MK の (C) 表現型解析は 7 日間体外CD34 陽性細胞から区別または 11 日は反 CD41, 抗 CD42a 抗体で染色しました。成熟した MK が両方 CD41 陽性+と CD42a+ (右上)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: MK 染色倍数性および生体外での proplatelet 形成します。(A) 蛍光画像 11 日目 MK アンチ CD41 PE と CD42b APC 抗体で染色します。DAPI の核が染色された.黄色の矢印は、抗 CD62p (赤) と反 CD42b APC (マゼンタ) 抗体多核 MKs。 スケール バー、vWf (緑)、アンチ染みた 14 日 MK の 30 μ m. (B) 蛍光画像を示します。DAPI の核が染色された.スケール バー、CD41 の倍数性の分布を示す 15 μ m (C) 代表的なゲート戦略+イベント。グラフ (下段) 倍数性クラスの観測された分布を示しています (n = 4)、誤差範囲、SD. (D) proplatelet ベアリング MK の特徴的な形態を示します。MK の体は、矢印で示されます。MK (proplatelets) から伸びる長い細胞質プロセスは、矢印で示されます。1 つまたは 2 つの MK これらの proplatelet 拡張機能を生産しているかどうか、ビューのいくつかの領域/分野で明確なことがあります。これは、倒立顕微鏡、対物レンズ 10 倍で撮影した 1 つの proplatelet ベアリング MK. 画像としてカウントすべき。スケール バー、50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 血小板の豊富な生産の in vitroと血小板活性化。(A) 血小板血小板豊富な血しょうからの前方および側面の散布 (左側のパネル) の対数スケールを使用して解析のゲートを設定する使用されました。右側のパネルは、MK の文化からセルを示しています。作り出された体外血小板血小板に対して定義された分析ゲートで観察されます。セルとカウントのビーズは図で示されます。Plt の (B) 血小板血小板の生産の in vitro抗 CD41 抗体で染色しました。血小板豊富な血しょうからひと血小板は、転送のログ スケールと側方散乱を用いた分析のゲートを設定し、CD41 FITC ゲート内でプロファイルを比較する使用されました。C FITC、FITC アイソタイプ コントロール(C)血小板活性化血小板豊富な血しょうから最終濃度 20 μ m ひと血小板の ADP による治療を次のコントロール (上部パネル) として使用されました。文化で生産された血小板は、下のパネルに表示されます。PAC1 の結合抗体は血小板活性化をことを示します。C FITC、FITC アイソタイプ コントロール。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明されているプロトコルは、MK と臍帯血から文化における血小板の一貫生産に適しています。これらの細胞は、MK 増殖、分化、proplatelet の形成と血小板の生産に及ぼす薬や生物学的活動など様々 なプロセスを研究に使用できます。
文化メディアとサイトカインの組み合わせの様々 な文献で紹介されています。また幹細胞因子、フェルマーの最終定理 3 配位子、IL-3、IL-6 サポート CD34 などサイトカインの+は細胞増殖です。しかし、この拡張は文化14の減らされた MK 純度の結果します。無血清メディアとだけでも、rhTPO を使用して、ここで提示法前駆細胞の大幅な拡大はできませんが unilineage 巨核球の増殖と分化、MK の一貫生産が可能 (90-99 %cd41+CD42a+二重陽性細胞) 他の血統からの汚染なし。MK の形成のための培養時間は 10 ~ 12 日間質をサポートまたはフィーダー細胞を必要とせずです。これはより大きい文化期間 (20 日間)17,18が必要なその他のメソッドと好意的に比較します。現在のプロトコルから血小板の利回りは 19 42 血小板 MK あたりまたは入力 CD34 あたり 420 血小板まで+セル。18,19低血小板のほとんどのプロトコルの結果が生成されます。
収穫は、他の方法に比べて高いが、血小板治療上の使用のための十分な数を生成する cd34 陽性細胞の大きい源が必要です。臍帯血 MK より低いレートで成熟、(低い倍数性クラス) の一般に小規模および血小板生産能力20を減らした。それにもかかわらず、新鮮な UCB は一般的によりアクセス可能なリソースと、研究者にとって重要な利点と言えます。MK と血小板治療目標とのより高い収穫を作り出すことができる他の方法はまた記述されていた13,17をされています。
考慮する変動のいくつかの源がある: A) 単位の臍帯血の品質。24 h 以内に収集だけ臍帯血は、CD34 のソースとして使用する必要があります+細胞。血栓を含む臍帯血の単位も破棄する必要があります。CD34 の割合 B)+細胞の単核細胞画分 (ステップ 1.8):+未満 0.3 %cd34 陽性単核のセル画を使用してセル可能性があります比較的低純度 CD34 の低利回り、+の細胞。これらの細胞は、MK の差別化のため推奨されません。重力のみによって液体を流しが不可欠だ (例えば1.13、1.14 1.16 のステップ)。列の閉塞の場合は、磁石から列を削除し、新しい管にシリンジのプランジャーで軽くセルを押して新しい平衡列の再読み込みをお勧めします。
血小板数と関数の条件数に影響を与えます。血小板減少症は、外部および内部の出血につながることができる血小板数の著しい低下を指します。免疫性血小板減少症 (ITP)、薬剤性血小板減少症 (DITP) など自己免疫条件は、血小板減少症21,22のよく知られている原因です。全身性エリテマトーデスや関節リウマチなど他の免疫疾患も血小板に有害な影響を持つことができます。非免疫性血小板減少症の原因は、がん治療、重度の外傷、感染症、骨髄不全や手術に含まれます。化学療法を受けるか、幹細胞移植を受ける患者で血小板の使用率が高いため血小板輸血は過去十年にわたって着実に増加しています。MK と血小板の研究は、臨床応用のための大規模な血小板の生産の発展に間違いなく役立ちます。体外生産機能性血小板性血小板不足を防ぐし、難治性患者に血小板輸血を許可します。MK 分化と血小板の生産培養では、研究と病理学の条件および血小板形成につながる生理学的メカニズムの理解のための重要なツールです。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、(プロジェクト助成 1012409 BHC にリンク) オーストラリア健康と医学研究評議会のサポートを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
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