Summary
אוכלוסיה מאוד טהור של megakaryocytes ניתן להשיג כבל דם-derived CD34+ תאים. שיטה CD34+ בידוד תאית התמיינות מגקריוציט מתואר כאן.
Abstract
ייצור טסיות מתרחשת בעיקר במח העצם על תהליך המכונה thrombopoiesis. במהלך thrombopoiesis, להבדיל hematopoietic ובתאים כדי מבשרי טסיות טופס שנקרא megakaryocytes, אשר להבדיל סופני לשחרר טסיות דם מן התהליכים זמן cytoplasmic כינה proplatelets. Megakaryocytes הם נדירים תאים מוגבל במח העצם, ולכן הם קשים לקצור או מספיקים לשימוש מעבדה. ייצור יעיל של megakaryocytes האנושית יכולה להיות מושגת במבחנה מאת culturing CD34+ תאים בתנאים מתאימים. פרוטוקול מפורט כאן מתאר בידוד של CD34+ תאים על-ידי תא מגנטי מיון של דגימות דם חבל הטבור. מתוארים הצעדים הדרושים כדי לייצר megakaryocytes מאוד טהור, בוגרת בתנאים ללא סרום. הפרטים של ניתוח פנוטיפי של בידול מגקריוציט והנחישות של היווצרות proplatelet וייצור טסיות הינם גם מסופקים. ניתן להוסיף effectors המשפיעים על בידול מגקריוציט ו/או היווצרות proplatelet, כגון נוגדנים נגד טסיות או מימטיקה thrombopoietin, תאים בתרבית לבחון תפקוד ביולוגי.
Introduction
בידוד של מספרים נאותה של ראשי megakaryocytes האנושית (ח"כ) לשימוש מעבדה רגיל הוא לא ריאלי עקב שלהם בתדר נמוך במח העצם, שבו הם מהווים ~0.01% של תאים nucleated1. חלופה נוחה היא הרחבה שמחוץ הבידול של גזע hematopoietic, ובתאים בנוכחות גורמי גדילה ספציפי. מספר של ציטוקינים כולל גורם לתאי גזע (SCF; ליגנד c-kit), אינטרלויקין (IL)-3 ו- IL-11 היו מועסקים במערכות תרבות לייצר מק ש. Thrombopoietin (TPO) היא הגורם היעיל ביותר בהתפתחותם עבור תרבויות megakaryocytic הוא יעיל לבד או עם אחרים ציטוקינים, כגון SCF ו- IL-32. TPO יכול לפעול על תאי גזע אוכלוסיות את התוצאה התפשטות וגם ההבשלה של חברי כנסת2.
ח"כ טסיות התוצרת מן בליטות cytoplasmic שנקרא proplatelets, אין ויוו, כ עונה 1 פרק 1011 טסיות הם יצרו מדי יום כדי לקיים את ספירת טסיות של 150-400 x 109/L. טסיות ייצור במבחנה הוא עד 1000 -מקפלים נמוך יותר מאשר ה- ויוו הערכות3, זה נתן עלייה לתנאים תרבות רבים באמצעות CD34+ ובתאים hematopoietic כדי לשפר את ח"כ, טסיות ייצור במבחנה. המקור הראשוני של CD34+ התאים המשמש ח"כ בידול היה דם היקפיים אנושי4. מקורות תא אחרים כוללים את מח העצם5,6, עובריים תאי גזע/המושרה pluripotent תאי גזע (ESC/iPSC)7הטבור דם (UCB)8,9,10 . מח עצם האדם CD34+ 11 ו העכבר שושלת היוחסין שלילי מח עצם תאים5 התוצרת ח"כ ולבנים וטסיות דם בתוך חוץ גופית; ובכל זאת, חוסר זמינות של מח עצם האדם מגביל את השימוש בו כמקור CD34+ תאים. לעומת זאת, ESC, iPSC מייצגים מקור מוגבל של תאים עבור ייצור טסיות במבחנה . טסיות ייצור של תאים אלה דורש מזין תאים תאים OP9 מאתר ו תקופות ארוכות יותר של תרבות. טסיות נגזר בתנאים ללא מזין להיראות פחות פונקציונלי12. טסיות נגזר iPSC נוטים להיות השימוש בהגדרות קליני מאז הם ניתן להרחיב בקנה מידה גדול. תהליך זה דורש lentiviral בתיווך התמרה חושית של גורמי שעתוק, תא לטווח ארוך תרבות13.
UCB הוא מקור נגיש של CD34+ התאים יכולה בקלות לשמש מחקר הגדרות. TPO לבד יכול לקדם את הבידול של כבל דם-derived CD34+ תאים וזה מעורר חברי כנסת מאוד טהור, בוגר ללא צורך תוספי סרום או תרבות משותפת עם מזין תאים. ציטוקינים אחרים כגון SCF עשויה להקטין בידול מ- UCB CD34+ תאים, בעוד ליגנד Flt-3 ו- IL-11 לקדם את הייצור של ילדותי megakaryocytes14. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של תרבויות ח"כ מאוד טהור של דם טבורי CD34+ תאים בתנאים ללא סרום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי דרום מזרח סידני האנושי מחקר ועדת האתיקה, שאושררה על-ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי של האוניברסיטה של ניו סאות וויילס. דם טבורי שהושג מתורמים בריאים סופק על ידי סידני בנק דם טבורי (NSW, סידני, אוסטרליה). כרכים של 100 מ ל שימשו עבור הליך זה.
הערה: עבודה ב- cabinet באמצעות הטכניקה aseptic Class II אבטחה. Decontaminate החיצוני של שקית הדם טבורי עם 70% אתנול. להשתמש בכלים סטריליים (מספריים, פינצטה) עבור הליך זה.
1. כבל תאי הדם הכנה ובידוד של CD34 תאים+
- להכין את ההפרדה סטרילי מאגר (SB) בתמיסת פוספט buffered (PBS), ב- pH 7.2, המכילה 0.5% שור אלבומין ו- 2 מ מ EDTA.
- לוותר על 10 מ"ל של SB לתוך צינור חרוטי 50 מ ל (צינור אחד לכל 10 מ"ל של דם זה נדרש). באמצעות מחט בוטה G18 רכוב על מזרק 10 מ"ל, לצייר 10 מ"ל של דם מתוך התיק, לוותר על תוך הצינורות 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של SB.
- להוסיף 15 מ"ל של לימפוציטים ההפרדה מדיה (ראה טבלה של חומרים) לתחתית הצינור המכיל את הדם מדולל, יצירת שתי שכבות.
הערה: לוותר על מדיה לאט בחלק התחתון של צינור כדי להימנע מערבוב הרבדים השונים. - צנטריפוגה צינורות ב g × 1,200 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם בלי הפסקה, אין האצה.
- להעביר את השכבה ליד המרכז של הצינור המכיל תאי תאים (כ 5-10 מ"ל מהצינור כל) לתוך צינור 50 מ ל באמצעות פיפטה של פסטר. להוסיף SB כל שפופרת את הנפח הכולל של 50 מ.
- Centrifuge ב 400 g × 10 דקות ב RT. להשליך את תגובת שיקוע.
- Resuspend תא כדורי בזהירות עם פיפטה פסטר ב 5-10 מ ל SB. לשלב את התאים מושעה ולהביא נפח 50 מ עם SB.
- ספירת תאים באמצעות צביעת Trypan blue ו- hemocytometer או אוטומטיות תא מונה (ראה טבלה של חומרים). כדי לקבוע את אחוז CD34+ תאים במדגם, resuspend 2.5 × 105 תאים µL 100 של SB, כתם על-ידי הוספת 10 µL של נוגדן anti-CD34-PE למשך 15-30 דקות ב 4 º C. ניתוח על ידי cytometry זרימה (איור 1 א').
- צנטריפוגה צינורות ב 400 g × 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
הערה: אם לא מיידית, תאי תאי שיכול להיות קפוא בשלב זה. - Resuspend תאים µL 300 של SB לכל 108 תאים. להוסיף 100 µL של ה-FcR האנושי IgG (חסימת ריאגנט, ראה טבלה של חומרים) ו- µL 100 של CD34 beads מגנטי לכל 108 תאים. לערבב בעדינות, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30-40 דקות.
הערה: השעיה תא בודד נדרש (אם יש צורך, להעביר התאים למרות מסנן 30 מיקרומטר לפני הוספת ריאגנטים). השתמש את הכרכים ריאגנט המתוארים כאן עבור 108 תאים או פחות. עבור יותר מ-108 תאים, קנה המידה של ריאגנטים (SB, חסימת פתרון ולאחר beads מגנטי CD34) בהתאם. - להכין את העמודה ההפרדה האם במהלך תקופת הדגירה על ידי הצבת העמודה LS בעל מגנטי כביסה עם 3 מ של SB. להשליך למסקנות.
הערה: ניתן לטעון? האם ההפרדה עמודות עם תאים הכולל8 × 10 עד 2. עמודות קטן יותר, גדול יותר זמינים. - להוסיף 5-10 מ ל SB לתערובת תא וזורקים צנטריפוגה ב 400 × g במשך 10 דקות את תגובת שיקוע.
- Resuspend התאים ב- 1.5 מ ל SB וטען התליה תא (1.5 מ ל) אל העמודה LS. לאסוף את הזרימה המכילות את התאים ללא תווית בשפופרת איסוף 15מל (שבר שלילי #1). תן את הנוזל לרוקן ולשטוף את העמודה עם 1.5 מ ל SB.
- לטעון את הזרימה (3 מ"ל) שנאספו בחזרה לתוך העמודה ולאסוף את הזרימה לשפופרת אוסף 15 מ"ל זהה (שבר שלילי #1). לשטוף את העמודה LS 3 פעמים עם 3 מ"ל של SB.
הערה: אם יש צורך, תאים השבר שלילי (12 מ ל) יכול להיות מוכתם נוגדן anti-CD34 לאמת לכידתו של CD34+ תאים לפי העמודה LS. - הסר העמודה במפריד מגנטי ותורידי תאים לאט עם פומפה מזרק לתוך צינור 15 mL החדש עם 2 מ ל SB.
- במקום העמודה בחזרה על עומס mL 2 תאים ומפריד מגנטי בחזרה לתוך העמודה. לאסוף את הזרימה, לשטוף עם 2 מ ל SB. זהו השבר שלילי #2 (4 מ ל).
- הסר האם העמודה מפריד מגנטי ולהוסיף 2 מ"ל של תאים SB. סומק בהתמדה בנחישות עם פומפה מזרק כדי לאסוף את CD34+ תא שבר. לספור את התאים באמצעות trypan blue מכתים, hemocytometer או מונה תא אוטומטית.
- צנטריפוגה צינור עם השבר חיובי ב g × 400 למשך 15 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend תאים בתקשורת ללא סרום עבור CD34+ תאים (SFM, ראה טבלה של חומרים).
הערה: אם לא מיידית, תאים שיכול להיות קפוא בחנקן נוזלי בשלב זה.
2. טוהר הסימון של CD34 מבודד התאים+
- כתם 2 x 104 תאים מן השבר חיובית עם נוגדן anti-CD34-PE µL, 20 µL נוגדן anti-CD45-PerCP למשך 15 דקות ב 4 ° C (שימוש נפרד צינור עבור פקדים isotype) 10 (איור 1B).
- להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף. צנטריפוגה-400 g × עבור 10 דקות Resuspend צנפה ב 200 µL של SB.
- לבצע ניתוח תזרים cytometric, שער האוכלוסייה תא חי כדי לא לכלול פסולת (איור 1B). להגדיר את השער עבור אוכלוסיות חיובי PE ו- PerCP באמצעות PE ו- PerCP isotype שולטת (איור 1B), לקבוע את אחוזי CD34+/CD45+ תאים.
3. מגקריוציט בידול
- זרע 5 × 105 תאים למ"ל CD34+ תאי 2 מ של SFM בתוספת 50 ng/mL רקומביננטי האנושי thrombopoietin (rhTPO) לכל טוב בצלחת 12-. טוב. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 באווירה humidified. אם התאים נמצאים confluent לפני שהם נדרשים לניתוח, לקצור את התאים, התפצל ולס מרובים עם rhTPO ומדיה חדשה.
הערה: צריך להיות מוכן בארות שניים או שלושה במיוחד כדי לפקח על בידול בנקודות זמן שונות (למשל, ימים 7, 9 ו-10). - קציר תאים מן הבארות להפריש לפקח בידול מבלי להפריע התאים הבארות אחרים.
- כתם תאים עם נוגדן anti-GPIIb/CD41-FITC 20 µL, 10 µL, אנטי-GPIX/CD42a-Alexa עבור חיל הים 647 נוגדן באמצעי אחסון הסופי של µL 100. הגדר פקד צינור באמצעות נוגדנים שליטה isotype בהתאמה. תקופת דגירה של 15-30 דקות ב 4 º C.
- להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף.
- להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף. צנטריפוגה-400 g × עבור 10 דקות Resuspend בגדר 100 µL של SB, ספין על זכוכית-1000 g x עבור 5 דק תאים תיקון בשקופית על-ידי טבילה ב מתנול 30 ס' אוויר יבש, להוסיף 20 µL של טעינת המדיה המכילה דאפי (ראה טבלה של חומרים) , מכסים עם coverslip ולאחר להמחיש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 א).
- לשטוף עם טריטון PBS/0.1% 2 מ ל- X 100, צנטריפוגה ב 400 g × 10 דקות, resuspend ב µL 100 באותו מאגר ולהוסיף העכבר אנטי איג-Alexa 594 וארנבת אנטי-488 IgG-Alexa (1: 100). תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף עם טריטון PBS/0.1% 2 מ ל- X 100, resuspend ב µL 100 באותו מאגר ולהוסיף 20 µL של אנטי-CD42b-APC. ואז לסובב את התאים על גבי מדרון זכוכית כפי שמתואר בשלב 3.6.1, הכנת דוגמאות להמחשת מיקרוסקופיים כפי שמתואר בשלב 3.6.1.
- לשטוף פעם עם 1 מ"ל של SB, resuspend צנפה ב- 300 µL של ציטראט היפוטוניק מאגר (1.25 מ"מ סודיום ציטרט, 2.5 מ מ נתרן כלורי, 3.5 מ מ דקסטרוז) המכיל 20 µg/ml propidium יודיד ל- 0.05% 100 טריטון-X. תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
- להוסיף RNase ריכוז סופי של 20 µg/mL, תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור. לקבוע את עוצמת יודיד propidium על ידי cytometry זרימה על ידי איסוף אירועים 30,000 כדי 50,000 מכלל האוכלוסייה CD41-FITC+ (איור 2C).
4. proplatelet סופרים, ספירת טסיות, והפעלה טסיות
- הקציר תאים (מתוך שלב 3.1) ב ימים 8 או 9 של בידול, זרע-1 × 104 תאים/טוב ב- 48-ובכן הצלחות µL 200 של SFM טרי בתוספת 50 ננוגרם למ"ל rhTPO. תרבות במשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2-
הערה: לצורך כימות, זרע בארות דולר. צפיפות נמוכה זה נדרש עבור ויזואליזציה, ספירת proplatelet מניבי קרונית דחיפה קלה Proplatelets בדרך כלל מתחילים להופיע לאחר יומיים של תרבות. הפסגה היא בין ימים 4 ו- 5. - לספור את מספר proplatelet מניבי ח"כ בבאר שלם על מיקרוסקופ אור הפוך באמצעות 10 X או מטרות X 20.
הערה: שלב מיקרוסקופ מחוממת (37 מעלות צלזיוס) היא עדיפה, מאז להשאיר את התאים בטמפרטורת החדר לתקופה ממושכת גורמת הצטמקות של הרחבות proplatelet. Proplatelets הם נצפו כהרחבות ארוך מהגוף MK. כל ח"כ ייתכן כמה בליטות proplatelet. כפי proplatelets לפתח, הגוף של ח"כ הקטנת גודל. - קציר תאים, צנטריפוגה ב 400 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר. כתם תאים עם נוגדן אנטי-האדם CD41-FITC µL 20, כפי שתואר בשלבים 3.3 ו- 3.4. לחשב את האחוזים של ח"כ מניבי proplatelet (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet מניבי חברי כנסת/טוב) / (סה כ CD41+ תאים / טוב)] x 100
- כדי לספור טסיות שוחרר לתוך המדיום תרבות, בעדינות לערבב את התאים עם פיפטה פסטר ולאסוף 100 µL ימים 14 או 15 של תרבות.
- כתם עם נוגדנים CD41-FITC נגד µL 20 למשך 20-30 דקות ב 4 º C. להגדיר את צינור שליטה באמצעות הנוגדן שליטה isotype בהתאמה.
- להוסיף 150 µL של SB ו 50 µL של ספירת חרוזים.
- לניתוח cytometric זרימה, הגדר את FSC ואת האס על סולם לוגריתמי. שימוש רגיל האנושית טסיות דם של טסיות דם עשיר פלזמה מוכתמים CD41-FITC כמתואר בסעיף 4.4.1 כדי להגדיר את דרך השער של טסיות הדם (איור 3 א).
- לנתח את טסיות הדם ויטראז'ים עם סופר חרוזים מאת cytometry זרימה. לאסוף 1,000 אירועים של ספירת חרוזים באמצעות את FSC מול מגרש פיזור האס (איור 3 א). לחשב את מספר טסיות בהתבסס על CD41-FITC חיובי אירועים (איור 3B) תוך שימוש בנוסחה:
טסיות לכל µL = [(מספר אירועים חיוביים CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/לדגום נפח)]
- כדי לנתח טסיות הפעלה, בעדינות לערבב את התאים עם פיפטה פסטר ולאסוף 100 µL ימים 14 או 15 של תרבות. להוסיף 1 מ"ל של מאגר (137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, MgCl 1 מ2, 1.8 מ"מ CaCl2, 0.2 מ מ נה2HPO4, 12 מ מ NaHCO3, 5.5 מ מ D-גלוקוז, pH 6.5) של Tyrode, צנטריפוגה g x 200 עבור 5 דקות כדי הצניפה תאים.
- לאסוף את תגובת שיקוע צנטריפוגה ב g 800 x 10 דקות הצניפה חלקיקים בגודל טסיות.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב µL 100 מאגר של Tyrode. להוסיף 20 µL של נוגדן PAC1-FITC, אדנוזין diphosphate (ADP) ריכוז סופי של 20 מיקרומטר. Incubate בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות נתח מאת cytometry זרימה כדי לקבוע את אחוז FITC אירועים חיוביים. טסיות דם אנושי טרי לשימוש מטופלים באופן זהה כפקד חיובי (איור 3C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מאפשר הכנת תרבויות ח"כ הטהור מאד מכבל דם-derived CD34+ תאים. האחוז של CD34+ תאים כבל דם הוא כ 1.3%15 (איור 1 א') ואת המספר הכולל של תאי תאי (שלב 1.8) נע בין 90-300 x 106 ליחידה UCB. טוהר CD34 + CD45 + תאים לאחר בידוד נעה בין 90 ל 99% (איור 1B). ח"כ (כהגדרתו CD41+ תאים) הם נצפו בתחילת CD34 ללא סרום+ תא תרבויות בנוכחות rhTPO. יום 7, האחוז של מבוגרים ח"כ (CD41+ , CD42a+ תאים) בדרך כלל 30-40% (איור 1C). הרמות הגבוהות ביותר של CD41+ , CD42a+ תאים חיובית כפולה (90-99%) הם נצפו בין ימים 10 ו- 12 של בידול (איור 1C). ההשתנות נצפתה תלוי בעיקר על מקור דם טבורי על טוהר CD34+/CD45+ תאים מבודדים בשלב 1.17. התשואה של ח"כ בוגרת על יום 10 נע בין 5-10 לכל קלט CD34+ תא. בוגר MK (CD41+/CD42b+) נצפתה תחת פלורסנט מיקרוסקופ מוצגות באיור איור 2A. ח"כ בתרבית מופיעים תאים גדולים, בדרך כלל multinucleated (איור 2 א, ראשי חץ). תוכן פרטנית של ח"כ נקבע על ידי vWf (ירוק) CD62p (p-בחירת שמלות, אדום) צביעת (איור 2B). התפלגות פלואידיות שנצפתה הח"כים בתרבית מוצג באיור 2C.
Proplatelets הם סיבים ארוכים, חרוזים או חוטים שבולטים מן הגוף MK. Proplatelets יכול להיות מיקרומטר מאות במספר רב16 ומכילים סניפים ואזורים נפוחה. מאפיין proplatelet מניבי ח"כ מודגם ב איור דו-ממדי. האחוז של ח"כ מניבי proplatelet (pbMK) היה 1.3 ± 0.17%.
טסיות הדם יכול להיות מנותח וספרתי כמפורט בפרוטוקול. כפי שמוצג באיור 3B, טסיות לרוב בתרבות תא supernatant נופלים בתוך השער אנליטית של טסיות דם היקפיים, הן חיובית עבור דה מרקר טסיות CD41 (איור 3B). התשואה טסיות מטווחי זו שיטה בין 19 ל 42 טסיות לכל קרונית דחיפה קלה טסיות הדם המיוצר בתרבות יכול להיות מופעל על ידי טסית דם אגוניסטים כגון ADP כפי שנקבע על ידי קשירה מוגברת של נוגדנים חד שבטיים PAC1 הפעלה ספציפית (איור 3C) .
איור 1: Flow cytometry חלקות CD34+ תא בידוד ובידול ח"כ בתרבות. (א) תאי תאי (מגודרת כפי שמוצג בחלונית השמאלית) מכל דם טבורי אנושי (שלב 1.8) היו מוכתמים נוגדן anti-CD34-PE כדי לקבוע את אחוז CD34+ תאים המדגם (1.3%, לוח נכון). (B) לאחר הפרידה, השבר חיובי (שלב 1.17) היה מוכתם עם נוגדנים PerCP anti-CD34-PE ו- anti-CD45. CD34 מועשר+ האוכלוסייה יציין את הדמות (98.1%, לוח נכון, הרביע הימני העליון). (ג) אנליזה פנוטיפי של ח"כ הבדיל במבחנה מתאי CD34 + 7 ימים או 11 ימים היו מוכתמים נוגדנים anti-CD41 ו- anti-CD42a. ח"כ בוגרת הם חיוביים עבור שני CD41+ , CD42a+ (הרביע הימני העליון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ח"כ מכתים פלואידיות, היווצרות proplatelet במבחנה. תמונות פלורסנט (A) של ח"כ היום ה-11 מוכתם anti-CD41-PE ו- CD42b-APC נוגדנים. הגרעינים היו מוכתמים דאפי. ראש חץ צהוב מציין רב הגרעין MKs. סולם בר, 30 מיקרומטר. (B) פלורסנט תמונות של ח"כ יום 14 מוכתם אנטי-vWf (ירוק), אנטי CD62p (אדום), נוגדנים anti-CD42b-APC (מגנטה). הגרעינים היו מוכתמים דאפי. סרגל קנה מידה, אסטרטגיה המגביל נציג 15 מיקרומטר (C), מציג את התפלגות פלואידיות של CD41+ אירועים. הגרף (החלונית התחתונה) מציג את התפלגות התצפיות של מחלקות פלואידיות (n = 4), קווי שגיאה, SD. (ד) המבנה האופייני של ח"כ proplatelet מניבי מוצג. ח"כ הגוף שמציין החץ. התהליכים זמן cytoplasmic הארכת מ- MK (proplatelets) מסומנים באמצעות ראשי חץ. זה עשוי להיות לא ברור בכמה אזורים/שדות בתצוגת אם ח כ אחד או שניים מניבות הרחבות proplatelet אלה. זה צריך לספור אחד מניבי proplatelet קרונית דחיפה קלה מתמונות שצולמו בעזרת מיקרוסקופ הפוכה, המטרה X 10. סולם בר, 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שפע של טסיות המיוצר הפעלה במבחנה , טסיות. (א) אדם טסיות הדם של טסיות דם עשיר פלזמה שימשו כדי להגדיר את השער אנליטי באמצעות יומן סרגל עבור פיזור קדימה ואת הצד (החלונית הימנית). החלונית ' נכון ' מראה התאים מתרבויות MK. טסיות הדם המיוצר במבחנה שנצפו בשער אנליטי שהוגדרו עבור טסיות דם אנושי. תאים וחרוזים הספירה הם הצביעו על הדמות. Plt, טסיות טסיות (B) המיוצר במבחנה היו מוכתמים נוגדן anti-CD41. טסיות דם אנושי של טסיות דם עשיר פלזמה שימשו כדי להגדיר את השער אנליטי באמצעות סולם יומן עבור forward ופיזור בצד, כדי להשוות את הפרופיל בתוך השער CD41-FITC. C-FITC, FITC isotype לשלוט טסיות (ג) הפעלת בעקבות טיפול על ידי ADP ריכוז סופי של 20 מיקרומטר. האנושי טסיות הדם של טסיות דם עשיר פלזמה שימשו השליטה (לוחות העליון). טסיות הדם המיוצר בתרבות מוצגים לוחות נמוכה יותר. עקדת PAC1 נוגדנים מציין הפעלת טסיות. C-FITC, FITC isotype שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מתאימה לייצור עקבית של ח"כ ולבנים וטסיות דם בתרבות של דם טבורי. תאים אלה ניתן ללמוד תהליכים שונים כגון ההשפעה של תרופות או פעילויות ביולוגיות על ח כ התפשטות, בידול, היווצרות proplatelet וייצור טסיות.
מגוון רחב של שילובים ציטוקין ומדיה תרבות הוצגו בספרות. תוספת של ציטוקינים כגון גורם לתאי גזע, Flt 3 ליגנד, IL-3 ו- IL-6 תומך CD34+ תא התפשטות. עם זאת, התרחבות זו התוצאה טוהר ח"כ מופחת ב תרבות14. השיטה המוצגת כאן, באמצעות מדיה ללא סרום rhTPO לבד, אינו מאפשר הרחבה משמעותית של ובתאים, אבל מאפשר התפשטות megakaryocytic unilineage, בידול וייצור עקבית של ח"כ (90-99% CD41+ תאים חיובי זוגי CD42a+ ) ללא זיהום של שושלות אחרות. תקופת תרבות של ח"כ היווצרות הוא 10 עד 12 ימים ללא צורך לתמוך סטרומה או מזין תאים. זה משווה לטובה עם שיטות אחרות הדורשות יותר תרבות תקופות (יותר מ-20 יום)17,18. התשואה טסית דם מן הפרוטוקול הנוכחי הוא 19-42 טסיות לכל ח כ או עד 420 טסיות לכל קלט CD34+ תא. התוצאה ברוב הפרוטוקולים טסיות נמוכה התשואות18,19.
למרות תשואה גבוהה יחסית לשיטות אחרות, מקורות גדולות של תאי CD34 נחוצים כדי לייצר מספיק מספרים של טסיות לשימוש טיפולית. ח"כ דם טבורי בוגר בשיעור נמוך, הם בדרך כלל קטנים יותר (של מחלקות פלואידיות התחתון), הפחיתו טסיות ייצור בקיבולת20. למרות זאת, UCB טריים הוא בדרך כלל משאב נגיש יותר ומייצג זה יתרון משמעותי עבור חוקרים. שיטות אחרות יכול לייצר תשואות גבוהות של ח"כ, טסיות דם עם מטרות טיפוליות היו גם תיאר13,17.
ישנם כמה מקורות של השתנות לשקול: A) איכות של יחידת דם טבורי. רק דם טבורי שנאסף בתוך 24 שעות צריך לשמש כמקור CD34+ תאים. גם צריך להיות מושלך כבל יחידות המכיל קרישי דם.. B) באחוזים CD34+ תאי השבר תאים תאי (שלב 1.8): שימוש תא תאי שברים עם פחות מ 0.3% CD34+ תאים עלול לגרום תשואות נמוכות של טוהר נמוכה יחסית CD34+ תאים. תאים אלה אינן מומלצות עבור ח"כ בידול. זה חיוני כדי לאפשר ניקוז נוזלי בכוח הכבידה בלבד (למשל, צעדים 1.13, 1.14, 1.16). במקרה של חסימה עמודה, מומלץ להסיר את העמודה של המגנט, לדחוף את התאים בעדינות עם הבוכנה מזרק לתוך צינור של רענן על עמודה חדשה equilibrated.
מספר תנאים משפיעים על מספר טסיות דם ותפקוד. תרומבוציטופניה מתייחס התדרדרות במספרים טסית דם יכול להוביל לדימום פנימי וחיצוני. חיסון מצבים כגון מערכת החיסון תרומבוציטופניה (ITP) תחת השפעת סמים תרומבוציטופניה (DITP) הם גורמים ידועים תרומבוציטופניה21,22. מחלות מערכת החיסון אחרות כמו זאבת, דלקת מפרקים שגרונית יכול להיות גם השפעות מזיקות על טסיות. Non-החיסון גורם של טרומבוציטופניה כוללים טיפול בסרטן, טראומה, זיהומים, מח עצם כישלון, ואת הניתוח. עקב ניצול גבוה של טסיות דם על ידי מטופלים שעברו טיפול כימותרפי או קבלה של השתלת תא גזע, עירוי טסיות עלה בהתמדה במהלך העשורים האחרונים. ח"כ ומחקר טסיות יסייע ללא ספק בפיתוח של ייצור טסיות בקנה מידה גדול עבור יישומים קליניים. זמינות של במבחנה המיוצר פונקציונלי טסיות למנוע מחסורים טסיות ולאפשר עירויי טסיות לתוך חולים עקשן. ח"כ בידול טסיות ייצור במבחנה הם כלים למידה והבנה של מצבים פתולוגיים והן את המנגנונים הפיזיולוגיים להוביל היווצרות טסיות דם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים להכיר את התמיכה של בריאות אוסטרלי המועצה למחקר רפואי (פרויקט גרנט 1012409 קשורה BHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H.
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
