Summary
يمكن الحصول على جمهرة نقية جداً من ميجاكاريوسيتيس من الحبل CD34 المستمدة من الدم+ الخلايا. أسلوب ل CD34+ التمايز العزلة و megakaryocyte خلية يرد هنا.
Abstract
إنتاج الصفائح الدموية يحدث أساسا في نخاع العظام في عملية تعرف باسم ثرومبوبويسيس. أثناء ثرومبوبويسيس، التفريق بين الخلايا المكونة للدم السلف للسلائف الصفيحات نموذج يسمى ميجاكاريوسيتيس، التي تميز الميؤوس من شفائهم للإفراج عن الصفائح الدموية من عمليات طويلة هيولى يسمى بروبلاتيليتس. ميجاكاريوسيتيس هي خلايا نادرة تنحصر في نخاع العظام ولذلك يصعب على الحصاد بإعداد كافية للاستخدامات المختبرية. كفاءة إنتاج megakaryocytes البشرية يمكن أن يتحقق في المختبر باستزراع CD34+ الخلايا تحت ظروف مناسبة. وصف البروتوكول بالتفصيل هنا عزل CD34+ الخلايا بالخلية المغناطيسية الفرز من عينات دم الحبل السري. يتم وصف الخطوات اللازمة لإنتاج megakaryocytes عالية نقية وناضجة تحت ظروف خالية من المصل. كما يتم توفير التفاصيل المظهرية تحليل التمايز ميجاكاريوسيتي والتصميم لإنتاج بروبلاتيليت في تشكيل والصفائح الدموية. يمكن إضافة المستجيبة التي تؤثر على التمايز ميجاكاريوسيتي و/أو تشكيل بروبلاتيليت، مثل mimetics ثرومبوبويتين، أو الأجسام المضادة الصفيحات للخلايا المزروعة لدراسة الوظيفة البيولوجية.
Introduction
عزل عدد كاف من ميجاكاريوسيتيس البشرية الأولية (MK) للاستخدامات المختبرية العادية ليس ممكناً بسبب ما تردد منخفض في نخاع العظام، حيث أنها تمثل ~0.01% للخلايا المنواه1. وهو بديلاً ملائماً السابقين فيفو التوسع والتمايز الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف حضور عوامل نمو محددة. كان عدد من السيتوكينات بما في ذلك معامل الخلايا الجذعية (صندوق إنقاذ الطفولة؛ ج-طقم يجند) وانترلوكين (إيل)-3 وايل-11 المستخدمة في نظم الاستزراع لإنتاج أعضاء الكنيست-ثرومبوبويتين (TPO) هو عامل نمو وتمايز الأكثر فعالية للثقافات ميجاكاريوسيتيك وهو فعال وحدها أو مع السيتوكينات الأخرى، مثل صندوق إنقاذ الطفولة وايل-32. يمكن أن يعمل TPO على السكان الخلايا الجذعية تسفر عن انتشار ونضوج أعضاء الكنيست2.
عضو الكنيست إنتاج الصفائح الدموية من هيولى نتوءات تسمى بروبلاتيليتس، و الحية، حوالي 1 × 1011 الصفائح تشكيل يوميا للحفاظ على حساب الصفائح الدموية من 150-400 × 109الصفيحات/L. الإنتاج في المختبر هو يصل إلى 1000 -إضعاف أقل من التقديرات في فيفو 3، وهذا قد أدى إلى العديد من شروط ثقافة استخدام CD34+ الخلايا المكونة للدم السلف لتحسين عضو الكنيست والصفائح الدموية الإنتاج في المختبر. المصدر الأولى ل CD34+ الخلايا المستخدمة للتمييز بين عضو الكنيست كان الدم المحيطي البشري4. تشمل المصادر الأخرى خلية نخاع العظم5،6، والخلايا الجذعية الجنينية/التي يسببها pluripotent الخلايا الجذعية (ESC/اللجنة التوجيهية)7، والحبل السري الدم (UCB)8،9،10 . نخاع العظام البشرية CD34+ 11 والماوس النسب نخاع العظم سلبية الخلايا5 إنتاج عضو الكنيست والصفائح الدموية في المختبر؛ ومع ذلك، عدم توافر نخاع العظام البشرية يحد من استخدامه كمصدر ل CD34+ الخلايا. وفي المقابل، ESC واللجنة التوجيهية تمثل مصدرا غير محدود من الخلايا في المختبر إنتاج الصفائح الدموية. ويتطلب إنتاج الصفائح الدموية من هذه الخلايا الخلايا المغذية مثل مورين OP9 الخلايا وفترات أطول من الثقافة. الصفائح الدموية المستمدة في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق، على ما يبدو، وظيفية أقل من12. الصفائح الدموية المستمدة من اللجنة التوجيهية من المحتمل أن يكون للاستخدام في ظروف سريرية حيث أنها يمكن توسيعها لنطاق واسع. وهذه العملية تتطلب توصيل لينتيفيرال بوساطة عوامل النسخ و ثقافة خلية طويل الأجل13.
UCB مصدر موجوداً من CD34+ الخلايا التي يمكن استخدامها في سهولة البحث إعدادات. TPO وحدها يمكن أن يعزز تمايز الحبل CD34 المستمدة من الدم+ الخلايا وهذا يؤدي إلى أعضاء الكنيست نقية جداً وناضجة دون الحاجة إلى مكملات مصل أو الثقافة المشتركة مع الخلايا المغذية. السيتوكينات الأخرى مثل صندوق إنقاذ الطفولة قد إنقاص التمايز من UCB CD34+ الخلايا، بينما يجند أنطوني-3 وايل-11 تشجيع الإنتاج غير ناضجة ميجاكاريوسيتيس14. ويصف هذا البروتوكول إنتاج عالية نقية الثقافات عضو الكنيست من دم الحبل السري CD34+ الخلايا في ظروف خالية من المصل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول أقره "جنوب شرق سيدني البشرية البحوث لجنة الأخلاقيات" وصدقت عليها "لجنة أخلاقيات البحوث البشرية" بجامعة نيو ساوث ويلز. وقدم دم الحبل السري التي تم الحصول عليها من الجهات المانحة صحية "سيدني حبل بنك الدم" (سيدني، نيو ساوث ويلز، أستراليا). واستخدمت وحدات تخزين ما يقرب من 100 مل لهذا الإجراء.
ملاحظة: يعمل في السلامة الأحيائية "الفئة الثانية" مجلس الوزراء باستخدام تقنية معقمة. تطهير الجزء خارجي كيس دم الحبل السري مع الإيثانول 70%. استخدام أدوات معقمة (مقص وملاقط) لهذا الإجراء.
1-سلك إعداد خلايا الدم وعزل CD34 الخلايا+
- إعداد فصل معقم المخزن المؤقت (SB) مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وفي الرقم الهيدروجيني 7.2، وتحتوي على 0.5% البقري الزلال ومم 2 يدتا.
- الاستغناء عن 10 مل من بينالي الشارقة في أنبوب 50 مل مخروطية (أنبوب واحد كل 10 مل دم مطلوب). باستخدام إبرة كليلة G18 التي شنت على حقنه 10 مل، رسم 10 مل دم من الكيس والاستغناء عن في أنابيب 50 مل تحتوي على 10 مل من س. ب.
- إضافة 15 مل من اللمفاويات فصل وسائط الإعلام (انظر الجدول للمواد) إلى الجزء السفلي من الأنبوب الذي يحتوي على الدم المخفف، خلق طبقتين.
ملاحظة: الاستغناء عن وسائل الإعلام ببطء في الجزء السفلي من الأنبوب لتفادي الخلط بين الطبقات المختلفة. - الطرد المركزي أنابيب في ز × 1,200 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع لا فاصل ولا التسارع.
- نقل الطبقة قرب مركز الأنبوبة التي تحتوي على الخلايا وحيدات النوى (حوالي 5-10 مل من كل أنبوبة) في أنبوب 50 مل جديدة باستخدام ماصة باستور. إضافة بينالي الشارقة لكل أنبوبة لإجمالي حجم 50 مل.
- الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 10 دقائق في تجاهل الرايت المادة طافية.
- ريسوسبيند الكريات الخلية بعناية مع ماصة باستور في 5-10 مل من الجمع بين SB. الخلايا مع وقف التنفيذ وإعادة التخزين إلى 50 مل مع س. ب.
- حساب عدد الخلايا باستخدام التلوين تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير أو الآلي الخلية مضادة (انظر الجدول للمواد). لتحديد النسبة المئوية ل CD34+ الخلايا في العينة، ريسوسبيند 2.5 × 105 خلايا في 100 ميليلتر من بينالي الشارقة ووصمة عار بإضافة 10 ميليلتر من الأجسام المضادة-CD34-PE لمدة 15-30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تحليل من خلال التدفق الخلوي (الشكل 1A).
- أنابيب الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
ملاحظة: إذا لم يكن المطلوبة فورا، يمكن تجميد الخلايا وحيدات النوى في هذه المرحلة. - ريسوسبيند الخلايا في 300 ميليلتر من SB الواحد 108 خلايا. إضافة 100 ميليلتر من مفتش البشرية FcR (حجب الكاشف، انظر الجدول للمواد) و 100 ميليلتر من CD34 المغناطيسي الخرز الواحدة 108 خلايا. المزيج بلطف واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة.
ملاحظة: مطلوب تعليق خلية مفردة (إذا لزم الأمر، تمر الخلايا على الرغم من عامل تصفية 30 ميكرومتر قبل إضافة الكواشف). استخدام وحدات التخزين كاشف الموصوفة هنا ل 108 خلايا أو أقل. لأكثر من 108 خلايا، رفع مستوى الكواشف (SB، عرقلة الحل، والخرز المغناطيسي CD34) تبعاً لذلك. - إعداد العمود فصل ليرة سورية خلال فترة الحضانة بوضع العمود LS في حامل مغناطيسية والغسيل مع 3 مل من تجاهل SB. النفايات السائلة.
ملاحظة: يمكن تحميل LS فصل الأعمدة يصل إلى 2 × 108 مجموع الخلايا. تتوفر الأعمدة الأصغر والأكبر. - أضف 5-10 مل من بينالي الشارقة إلى خليط الخلية وأجهزة الطرد المركزي في 400 × ز للحد الأدنى 10 تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا في 1.5 مل من بينالي الشارقة وتحميل تعليق خلية (1.5 مل) على العمود ليرة سورية. جمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا غير المسماة في أنبوب جمع 15 مل (كسر السلبية #1). واسمحوا السائل واستنزاف أغسل العمود مع 1.5 مل من س. ب.
- تحميل التدفق التي تم جمعها من خلال (3 مل) مرة أخرى إلى العمود وجمع من خلال التدفق في أنبوب جمع 15 مل نفس (كسر السلبية #1). أغسل العمود LS 3 مرات مع 3 مل من س. ب.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن الملون الخلايا في كسر السلبية (12 مل) مع جسم CD34 المضادة للتأكد من القبض على CD34+ الخلايا حسب العمود ليرة سورية. - إزالة عمود من الفاصل المغناطيسي وتدفق الخلايا ببطء مع المكبس حقنه في أنبوب 15 مل جديدة مع 2 مل من س. ب.
- مكان العمود مرة أخرى على فاصل مغناطيسي وتحميل 2 مل الخلايا مرة أخرى في العمود. التدفق من خلال جمع وتغسل مع 2 مل س. ب. هذا هو الكسر السلبية #2 (4 مل).
- إزالة العمود LS من فاصل مغناطيسي وإضافة 2 مل خلايا SB. دافق ثبات وحزم مع المكبس حقنه لجمع CD34+ الكسر في الخلية. عد الخلايا باستخدام التلوين تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير أو العداد الآلي الخلية.
- أنبوب الطرد المركزي مع الكسر الإيجابية في ز × 400 لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام الحرة المصل ل CD34+ الخلايا (الإدارة المستدامة للغابات، انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: إذا لم يكن المطلوبة فورا، الخلايا يمكن أن تجمد في النتروجين السائل في هذه المرحلة.
2. الاختيار النقاء من CD34 عزل الخلايا+
- وصمة عار 2 × 104 خلايا من الكسر إيجابية مع 10 ميليلتر المضادة-CD34-PE جسم وجسم المضادة-CD45-بيركب 20 ميليلتر لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية (استخدام أنبوب منفصل لضوابط ايستب) (الشكل 1B).
- أضف 1 مل من بينالي الشارقة لغسل. الطرد المركزي في 400 غ × للحد الأدنى 10 ريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من س. ب.
- أداء تحليل تدفق سيتوميتريك وبوابة السكان خلية حية لاستبعاد الحطام (الشكل 1B). البوابة للسكان إيجابية PE وبيركب استخدام PE وبيركب ايستب عناصر التحكم (الشكل 1B) وتحديد النسبة المئوية ل CD34+/CD45+ الخلايا.
3-megakaryocyte التمايز
- البذور 5 × 105 خلايا/مل CD34+ الخلايا في 2 مل من الإدارة المستدامة للغابات وتستكمل مع 50 نانوغرام/مل الماشوب البشري ثرومبوبويتين (رهتبو) كل بئر في لوحة 12-جيدا. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 في جو هوميديفيد. إذا كانت الخلايا المتلاقية قبل أن تكون مطلوبة من أجل التحليل، حصاد الخلايا وتقسيمها إلى الآبار متعددة مع وسائط جديدة ورهتبو.
ملاحظة: ينبغي إعداد الآبار اثنين أو ثلاثة على وجه التحديد لرصد التمايز في نقاط زمنية مختلفة (مثلاً، أيام 7 و 9 و 10). - حصاد الخلايا من الآبار التي خصصت لرصد التمايز دون الإخلال بالخلايا الموجودة في الآبار الأخرى.
- الخلايا وصمة عار مع الأجسام المضادة-GPIIb/CD41-فيتك 20 ميليلتر ومكافحة--جبيكس/CD42a-أليكسا ميليلتر 10 فلور 647 جسم في حجم نهائي 100 ميليلتر. أنبوب إعداد عنصر تحكم باستخدام الأجسام المضادة التي تحكم ايستب كل منهما. احتضان لمدة 15-30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- أضف 1 مل من بينالي الشارقة لغسل.
- أضف 1 مل من بينالي الشارقة لغسل. أجهزة الطرد المركزي في 400 غ × للحد الأدنى 10 ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من بينالي الشارقة وتدور على شريحة زجاجية في 1,000 ز x للحد الأدنى 5 إصلاح الخلايا على الشريحة بالغمس في الميثانول 30 س. الهواء الجاف، لإضافة 20 ميليلتر من تصاعد الوسائط التي تحتوي على DAPI (انظر الجدول للمواد) ، تغطية مع ساترة، ووضع تصور لاستخدام مجهر فلوري (الشكل 2A).
- يغسل مع 2 مل PBS/0.1% تريتون-X 100 والطرد المركزي في ز × 400 لمدة 10 دقائق، ريسوسبيند في 100 ميليلتر من نفس المخزن المؤقت وإضافة أليكسا مفتش 594 المضادة الماوس والارنب المضادة IgG-أليكسا 488 (1: 100). احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ويغسل مع 2 مل PBS/0.1% تريتون-X 100، ريسوسبيند في 100 ميليلتر من نفس المخزن المؤقت، وإضافة 20 ميليلتر لمكافحة CD42b-آسيا والمحيط الهادئ. ثم تدور الخلايا على الشرائح الزجاجية كما هو موضح في الخطوة 3.6.1 وإعداد العينات للتصور مجهرية كما هو موضح في الخطوة 3.6.1.
- أغسل مرة واحدة مع 1 مل من بينالي الشارقة وريسوسبيند بيليه في 300 ميليلتر من سترات ناقص التوتر المخزن المؤقت (1.25 مم سترات الصوديوم، كلوريد الصوديوم 2.5 مم، 3.5 مم سكر العنب) التي تحتوي على 20 ميكروغرام/مل propidium يوديد و 0.05% 100 تريتون العاشر. احتضان لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية محمية من الضوء.
- إضافة رناسي إلى تركيز نهائي 20 ميكروغرام/مل واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء. تحديد كثافة يوديد propidium بالتدفق الخلوي بتجميع الأحداث 30,000 إلى 50,000 السكان CD41-فيتك+ (الشكل 2).
4-بروبلاتيليت العد وتعداد الصفائح الدموية وتنشيط الصفائح الدموية
- حصاد الخلايا (من الخطوة 3.1) في يوم 8 أو 9 من التمايز والبذور في 1 × 104 خلايا/بئر لوحات 48-جيدا في 200 ميليلتر للإدارة المستدامة للغابات جديدة تستكمل مع 50 نانوغرام/مل رهتبو. الثقافة لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية، 5% CO2-
ملاحظة: لأغراض كوانتيتيشن، البذور الآبار في ثلاث نسخ. مطلوب هذه الكثافة المنخفضة للتصور والعد من بروبلاتيليت تحمل بروبلاتيليتس MK. وعادة ما تبدأ في الظهور بعد يومين ثقافة. الذروة ما بين 4 و 5 أيام. - عد عضو الكنيست بروبلاتيليت الحاملة في البئر كله على مجهر ضوء مقلوب استخدام 10 X أو 20 X أهداف.
ملاحظة: مرحلة مجهر ساخنة (37 درجة مئوية) الأفضل، نظراً لحفظ الخلايا في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة يسبب انكماش ملحقات بروبلاتيليت. ولوحظت بروبلاتيليتس كامتدادات طويلة من الجسم عضو الكنيست. قد يكون لكل عضو الكنيست عدة نتوءات بروبلاتيليت. كما وضع بروبلاتيليتس، يقلل الجسم من عضو الكنيست في الحجم. - حصاد الخلايا والطرد المركزي في ز 400 x لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وصمة عار الخلايا مع 20 جسم الإنسان لمكافحة CD41-فيتك ميليلتر، كما هو موضح في الخطوات 3.3 و 3.4. حساب النسبة المئوية لعضو الكنيست الحاملة بروبلاتيليت (ببمك): ببمك (%) = [(أعضاء الكنيست بروبلاتيليت الحاملة/حسنا)/(مجموع CD41+ الخلايا/حسنا)] x 100
- لعد الصفائح الدموية التي تطلق في المتوسط الثقافة، بلطف مزيج الخلايا مع ماصة باستور وجمع 100 ميليلتر في يوم 14 أو 15 من الثقافة.
- وصمة عار مع 20 ميليلتر المضادة الإنسان CD41-فيتك جسم لمدة 20-30 دقيقة في 4 درجات مئوية. إنشاء أنبوب مراقبة استخدام جسم التحكم ايستب كل منهما.
- إضافة 150 ميليلتر من بينالي الشارقة و 50 ميليلتر من عد الخرز.
- بالنسبة لتحليل تدفق سيتوميتريك، تعيين منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب لتسجيل النطاق. استخدام الصفائح الدموية البشرية العادية من البلازما الغنية بالصفائح الدموية ملطخة فيتك CD41 كما هو موضح في قسم 4.4.1 لتعيين النابضة للصفائح الدموية (الشكل 3A).
- تحليل الصفائح الدموية الملون مع عد الخرز بالتدفق الخلوي. جمع الأحداث 1,000 لعد الخرز استخدام منتدى التعاون الأمني مقابل SSC مبعثر مؤامرة (الشكل 3A). حساب عدد الصفائح الدموية استناداً إلى الأحداث الإيجابية CD41-فيتك (الشكل 3B) باستخدام الصيغة:
الصفائح الدموية كل ميليلتر = [(عدد من الأحداث الإيجابية فيتك CD41)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/نموذج وحدة التخزين)]
- لتحليل تنشيط الصفائح الدموية، بلطف مزيج الخلايا مع ماصة باستور وجمع 100 ميليلتر في يوم 14 أو 15 من الثقافة. إضافة 1 مل تيرودي في المخزن المؤقت (137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، مجكل 1 مم2، 1.8 مم كاكل2، 0.2 مم نا2هبو4, 12 ملم ناكو3، 5.5 ملم د-الجلوكوز، الرقم الهيدروجيني 6.5) وأجهزة الطرد المركزي في 200 غ س لمدة 5 دقائق بيليه الخلايا.
- جمع المادة طافية وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 10 دقيقة بيليه الجسيمات الحجم الصفائح الدموية.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 100 ميليلتر تيرودي في المخزن المؤقت. إضافة 20 ميليلتر من جسم PAC1-فيتك و diphosphate الأدينوزين (ADP) بتركيز نهائي من 20 ميكرومتر. إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة ل 20 دقيقة تحليل بالتدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية للأحداث الإيجابية فيتك. استخدام الصفائح الدموية البشرية الطازجة يعامل بنفس الطريقة كعنصر إيجابي (الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح هذا البروتوكول إعداد عالية نقية الثقافات عضو الكنيست من الحبل CD34 المستمدة من الدم+ الخلايا. النسبة المئوية ل CD34+ الخلايا في الحبل الدم هو حوالي 1.3%15 (الشكل 1A)، والعدد الكلي للخلايا وحيدات النوى (الخطوة 1.8) يتراوح بين 90-300 × 106 لكل وحدة UCB. نقاء CD34 + CD45 + الخلايا بعد عزلة يتراوح من 90 إلى 99 في المائة (الشكل 1B). عضو الكنيست (ويعرف CD41+ الخلايا) لوحظت مبكرا في CD34 خالية من المصل+ خلية الثقافات حضور رهتبو. في يوم 7، النسبة المئوية لتنضج MK (CD41+ و CD42a+ الخلايا) عادة 30-40 ٪ (الشكل 1). مستويات أعلى من CD41+ و CD42a+ الخلايا إيجابية مزدوجة (90-99%) يلاحظ بين أيام 10 و 12 تمايز (الشكل 1). تقلب لاحظ يعتمد أساسا على مصدر دم الحبل السري ونقاء CD34+/CD45+ الخلايا المعزولة في خطوة 1.17. العائد من عضو الكنيست ناضجة في اليوم 10 يتراوح بين 5-10 كل CD34 الإدخال+ الخلية. ينضج عضو الكنيست (CD41+/CD42b+) لاحظ تحت فلوري مجهرية مبينة في الشكل 2 ألف. عضو الكنيست مثقف تظهر الخلايا الكبيرة، وعادة ما مولتينوكليتيد (الشكل 2A، رؤوس الأسهم). محتوى لعضو الكنيست الحبيبية تحددها vWf (أخضر) و CD62p (سيليكتين ف، أحمر) تلوين (الشكل 2). ويرد في الشكل 2توزيع ploidy لوحظت في الكنيست مثقف.
بروبلاتيليتس هي ألياف طويلة ومطرز أو خيوط تمتد من الجسم عضو الكنيست. ويمكن بروبلاتيليتس عدة مئات ميكرومتر طويلة16 وتحتوي على فروع ومناطق منتفخة. ويتضح سمة بروبلاتيليت الحاملة عضو الكنيست في 2D الشكل. وكانت نسبة بروبلاتيليت الحاملة MK (ببمك) 1.3 ± 0.17 في المائة.
ويمكن تحليل الصفائح الدموية وتحسب على النحو المبين في البروتوكول. كما هو موضح في الشكل 3، تقع معظم الصفائح الدموية في ثقافة الخلية طافية داخل البوابة التحليلية للصفائح الدموية المحيطية، وهي إيجابية بالنسبة لعلامة الصفائح الدموية CD41 (الشكل 3B). يمكن تنشيط الصفيحات العائد من هذا الأسلوب تتراوح بين 19 إلى 42 الصفائح الواحدة والصفائح الدموية MK. المنتجة في الثقافة التي يضع الصفائح الدموية مثل ADP كما يحددها زيادة ربط [مونوكلونل] جسم (الشكل 3) PAC1 الخاصة بالتنشيط .
الشكل 1: التدفق الخلوي قطع CD34+ الخلية العزلة وعضو الكنيست من التمايز في الثقافة- (أ) وحيدات النوى الخلايا (بوابات كما هو مبين في اللوحة اليسرى) تنقيته من دم الحبل السري البشري (الخطوة 1.8) كانت ملطخة بالأجسام المضادة-CD34-PE لتحديد النسبة المئوية CD34+ الخلايا في العينة (1.3%، اللوحة اليمنى). (ب) بعد الانفصال، وكان الملون الكسر الإيجابية (الخطوة 1.17) مع مكافحة-CD34-PE ومكافحة CD45 بيركب الأجسام المضادة. CD34 المخصب+ السكان هو المبين في الشكل (98.1%، اللوحة اليمنى، الربع الأيمن العلوي). (ج) تحليل المظهرية لعضو الكنيست متباينة في المختبر من الخلايا CD34 + لمدة 7 أيام أو 11 يوما كانت ملطخة بالأجسام المضادة CD41 ومكافحة CD42a. عضو الكنيست الناضجة إيجابية بالنسبة لكلا CD41+ و CD42a+ (الربع الأيمن العلوي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: عضو الكنيست تلطيخ، بلويدي، وتشكيل بروبلاتيليت في المختبر. (أ) الصور الفلورية من عضو الكنيست يوم 11 ملطخة بمكافحة--CD41--PE والأجسام المضادة CD42b-آسيا والمحيط الهادئ. كانت الملون الأنوية مع DAPI. السهم الأصفر يشير إلى النووية متعددة أعضاء الكنيست-جدول بار، الصور الفلورية 30 ميكرومتر. (ب) من عضو الكنيست يوم 14 ملطخة بمكافحة فوف (الأخضر)، لمكافحة CD62p (أحمر) والأجسام المضادة--CD42b--آسيا والمحيط الهادئ (أرجواني). كانت الملون الأنوية مع DAPI. مقياس بار، واستراتيجية النابضة الممثل 15 ميكرون (ج) تبين توزيع بلويدي CD41+ الأحداث. الرسم البياني (أسفل اللوحة) يبين توزيع فئات ploidy الملاحظة (n = 4)، أشرطة الخطأ، تظهر مورفولوجية مميزة من عضو الكنيست بروبلاتيليت تأثير التنمية المستدامة. (د). تتم الإشارة إلى الجسم عضو الكنيست بالسهم. يتم الإشارة إلى العمليات هيولى طويلة تمتد من عضو الكنيست (بروبلاتيليتس) برؤوس الأسهم. وقد يكون غير واضح في بعض المناطق/الحقول لعرض ما إذا كان عضو الكنيست واحد أو اثنين يتم إنتاج هذه الملحقات بروبلاتيليت. وهذا ينبغي أن يحسب كأحد بروبلاتيليت الحاملة MK. الصور الملتقطة مجهر مقلوب، 10 X الهدف. مقياس بار، 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: وفرة من الصفائح الدموية ينتج التنشيط في المختبر ، والصفائح الدموية. واستخدمت الصفائح الدموية البشرية (A) من البلازما الغنية بالصفائح الدموية لتعيين بوابة التحليلية باستخدام مقياس لوغاريتمي مبعثر أمامية وجانبية (اللوحة اليمنى). اللوحة اليسرى تظهر الخلايا من الثقافات عضو الكنيست. الصفائح الدموية المنتجة في المختبر ولوحظت في بوابة تحليلية محددة للصفائح الدموية البشرية. الخلايا والخرز العد مبينة في الشكل. معاهدة قانون البراءات، الصفائح الدموية الصفائح الدموية (ب) المنتجة في المختبر كانت ملطخة بالأجسام المضادة CD41. الصفائح الدموية البشرية من البلازما الغنية بالصفائح الدموية واستخدمت لتعيين بوابة التحليلية باستخدام مقياس لوغاريتمي للأمام والجانب مبعثر ومقارنة الشخصية داخل بوابة CD41-فيتك. ج-فيتك، ايستب فيتك مراقبة الصفيحات (ج) استخدمت التنشيط بعد العلاج ADP إلى تركيز نهائي من 20 ميكرومتر. البشرية الصفائح الدموية من البلازما الغنية بالصفائح الدموية كعنصر تحكم (لوحات العلوي). الصفائح الدموية التي أنتجت في الثقافة تظهر في لوحات أقل. ملزمة من PAC1 جسم يشير إلى تنشيط الصفائح الدموية. ج-فيتك، فيتك ايستب التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول الموصوفة هنا مناسبة لإنتاج متسقة لعضو الكنيست والصفائح الدموية في الثقافة من دم الحبل السري. يمكن استخدام هذه الخلايا لدراسة مختلف العمليات مثل تأثير المخدرات أو الأنشطة البيولوجية على انتشار عضو الكنيست، والتمايز، وتشكيل بروبلاتيليت، وإنتاج الصفائح الدموية.
قدمت مجموعة متنوعة من وسائط الثقافة وتركيبات سيتوكين في الأدب. إضافة السيتوكينات مثل عامل الخلايا الجذعية ويجند أنطوني-3، 3 إيل وايل-6 يدعم CD34+ خلية الانتشار. ومع ذلك، النتائج هذا التوسع في انخفاض MK النقاء في الثقافة14. الطريقة المعروضة هنا، باستخدام وسائل الإعلام الحرة المصل ورهتبو وحدها، لا تسمح بتوسع كبير في الخلايا السلف، ولكن يسمح بانتشار ميجاكاريوسيتيك أونيلينيجي والتمايز وإنتاج متسقة من عضو الكنيست (90-99% CD41+ CD42a+ الخلايا إيجابية مزدوجة) دون تلويث من الأنساب الأخرى. فترة الثقافة لتشكيل عضو الكنيست من 10 إلى 12 يوما دون الحاجة إلى دعم اللحمية أو الخلايا المغذية. وهذا يقارن إيجابيا مع الأساليب الأخرى التي تتطلب فترات (أكثر من 20 يوما) الثقافة أكبر17،18. العائد الصفائح الدموية من هذا البروتوكول هو 19-42 الصفائح الدموية كل عضو الكنيست أو حتى 420 الصفائح الواحدة CD34 الإدخال+ الخلية. معظم البروتوكولات تسفر عن انخفاض الصفيحات غلة18،19.
على الرغم من أن العائد مرتفع مقارنة بالأساليب الأخرى، مصادر كبيرة من الخلايا CD34 مطلوبة لإنتاج عدد كاف من الصفائح الدموية للاستخدام العلاجي. MK دم الحبل السري ناضجة بمعدل أقل وهي عموما أصغر (من الطبقات الدنيا بلويدي)، وخفضت إنتاج الصفائح الدموية قدرة20. ومع ذلك، UCB الطازجة عموما مورد أكثر يسرا وهذا يمثل ميزة كبيرة للباحثين. وكانت الطرق الأخرى التي يمكن أن تنتج غلات أعلى من عضو الكنيست والصفائح الدموية مع الأهداف العلاجية أيضا وصف13،17.
وهناك بعض المصادر من تقلب النظر في: A) نوعية وحدة دم الحبل السري. دم الحبل السري التي تم جمعها خلال 24 ساعة فقط ينبغي أن تستخدم كمصدر ل CD34+ الخلايا. يجب أن يتم أيضا تجاهل وحدات دم الحبل السري الذي يحتوي على جلطات. ب) النسبة المئوية ل CD34+ الخلايا في خلية وحيدات النوى الكسر (الخطوة 1.8): استخدام الكسور الخلايا وحيدات النوى مع أقل من 0.3% CD34+ الخلايا قد يؤدي انخفاض غلة نقاوة منخفضة نسبيا CD34+ الخلايا. لا ينصح بهذه الخلايا للتمايز عضو الكنيست. من الضروري السماح لاستنزاف السائل بقوة الجاذبية فقط (مثلاً، خطوات 1.13 1.14، 1.16). في حالة انسداد العمود، من المستحسن إزالة العمود من المغناطيس ودفع الخلايا بلطف مع المكبس حقنه في أنبوب جديد وإعادة تحميل على عمود جديد متوازن.
عدد من الشروط التي تؤثر على عدد الصفائح الدموية ووظيفتها. قلة الصفيحات يشير إلى انخفاض ملحوظ في عدد الصفائح الدموية التي يمكن أن تؤدي إلى نزيف داخلي وخارجي. شروط المناعة الذاتية مثل الصفيحات المناعي (أي تي بي)، والمخدرات التي يسببها نقص الصفيحات (ديتب) أسباب معروفة الصفيحات،من21إلى22. الأمراض المناعية الأخرى مثل الذئبة الحمامية الجهازية والتهاب المفاصل ويمكن أيضا آثار ضارة على الصفائح الدموية. أسباب عدم المناعة الصفيحات تشمل علاج السرطان والصدمات الحادة والتهابات، وفشل نخاع العظام والجراحة. بسبب استخدام ارتفاع الصفائح الدموية بالمرضى الذين يخضعون لعلاج كيميائي أو تلقي عمليات زرع الخلايا الجذعية، نقل الصفائح الدموية زيادة مطردة على مدى العقود الماضية. عضو الكنيست والصفائح الدموية البحث ستساعد بلا شك في تطوير إنتاج الصفائح الدموية الواسعة النطاق للتطبيقات السريرية. أن منع حدوث نقص الصفائح الدموية توافر في المختبر إنتاج الصفائح الدموية الوظيفية والسماح بنقل الصفائح الدموية في المرضى المقاوم للحرارة. عضو الكنيست التمايز والصفائح الدموية الإنتاج في المختبر هي أدوات حاسمة لدراسة وفهم الحالات المرضية والآليات الفسيولوجية التي تؤدي إلى تشكيل الصفائح الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب تقر بالدعم "الصحي الأسترالي" و "مجلس البحوث الطبية" (مشروع المنح 1012409 مرتبطة بالبيلاروسية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H.
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
