Очень чисто населения megakaryocytes могут быть получены из пуповинной крови производные CD34+ клеток. Метод для CD34+ изоляции и мегакариоцитов дифференцировки клеток описана здесь.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мегакариоцитов дифференциации и образование тромбоцитов от человека пуповинной крови производные CD34 клетки+
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Производство тромбоцитов происходит главным образом в костном мозге в процессе, известном как thrombopoiesis. Во время thrombopoiesis прародитель гемопоэтических клеток дифференцировать в форме прекурсоров тромбоцитов под названием megakaryocytes, которые неизлечимо дифференцировать выпустить тромбоцитов долго цитоплазматических процессов, называемых proplatelets. Megakaryocytes являются редкие клетки, ограничивается костного мозга и поэтому трудно урожай в достаточном количестве для лабораторного использования. Эффективное производство человеческого megakaryocytes может быть достигнуто в пробирке путем культивирования CD34+ клеток при подходящих условиях. Протокол, здесь подробно описывает изоляции CD34+ клеток, магнитные ячейку Сортировка от образцов пуповинной крови. Описаны необходимые шаги для получения чистой, зрелый megakaryocytes сыворотки свободных условиях. Предоставляются также детали фенотипического анализа мегакариоцитов дифференциации и определение производства proplatelet формирования и тромбоцитов. Эффекторы, влияющих мегакариоцитов дифференциации и/или proplatelet формирования, такие как антитела анти-тромбоцитарный или thrombopoietin mimetics, могут быть добавлены культивируемых клеток, чтобы изучить биологические функции.
Введение
Изоляция адекватного числа первичных человеческих megakaryocytes (MK) для использования регулярных лабораторных невозможно из-за их низкой частоты в костном мозге, где они составляют ~0.01% ядерных клеток1. Удобной альтернативой является расширение ex vivo и дифференциации кроветворных стволовых и прогениторных клеток при наличии определенных факторов роста. Количество цитокинов, включая фактор стволовых клеток (СКФ; c комплект лигандом) и интерлейкина (IL) -3 и Ил-11 были заняты в системах культуры производить МКС. Thrombopoietin (ТПО) является наиболее эффективным фактором роста и дифференцировки для мегакариоцитарная культур и являе....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол был одобрен Юго Восточный Сидней человека Комитет по этике исследований и ратифицирован человека Комитет по этике исследований в Университете Нового Южного Уэльса. Пуповинная кровь, полученные от здоровых доноров была представлена в Сиднее банк пуповинной крови (Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия). Для этой процедуры были использованы томов приблизительно 100 мл.
Примечание: Работа в класс II биобезопасности, кабинет с помощью асептической техники. Обеззараживанию экстерьер пуповинной крови мешок с 70% этиловом спирте. Для этой процедуры используйте стерильные инструменты (ножницы, пинцеты).
1. кабе....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол позволяет подготовки высоко чистых культур МК из пуповинной крови производные CD34+ клеток. Процент CD34+ клеток в пуповинной крови составляет примерно 1,3%15 (рис. 1A) и общее количество мононуклеарных клеток (шаг 1.8) колеблется от 90-300 x 106 единицу UCB. Чистота CD34 +/ CD45 + клеток после изоляции колеблется от 90 до 99% (рис. 1B). MK (определяется как C.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанные здесь подходит для последовательного производства МК и тромбоцитов в культуре из пуповинной крови. Эти клетки могут использоваться для изучения различных процессов, таких как воздействие наркотиков или биологической деятельности на МК распространения, дифференциация, proplatelet формирования и тромбоцитов производства.
В литературе были представлены разнообразные культуры средств массовой информации и цитокина комбинаций. Добавление цитокинов, таких как фактор стволовых кле.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы признают поддержке здравоохранения Австралии и Совет медицинских исследований (проект Грант 1012409 связан с БХК).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Cell Culture Reagents | |||
| Рекомбинантный человеческий TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Бессывороточная среда для CD34+ клеток |
| Название< | strong>Company< | strong>Каталожный номер | Comments |
| >CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | Этот набор включает в себя реагент, блокирующий IgG человека FcR, и микрогранулы CD34. Эти шарики содержат клон антител к CD34 QBEND/10. Используйте другой клон анти-CD34 для проверки чистоты (например, клон 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Среда для разделения лимфоцитов (плотность 1,077 г/мл) |
| Стерильный разделительный буфер (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | Этот буфер содержит фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,2, содержащий 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 2 мМ ЭДТА. Его можно готовить с использованием стерильных компонентов клеточной культуры. Дегазируйте перед использованием, потому что пузырьки воздуха могут блокировать колонку. |
| Name | Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| <>Проточная цитометрия и реагенты для окрашивания клеток | |||
| PE Мышиный античеловеческий CD34 | BD Biosciences | 340669 | клон 8G12. Это может быть использовано для проверки чистоты CD34. Конечная концентрация антител 1:10 разведение. |
| PerCP мышиный античеловеческий CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 разведение |
| PerCP контроль изотипа | BD Biosciences | 349044 | 1:10 разведение |
| FITC мышиный античеловеческий CD41a | BD Biosciences | 340929 | Конечная концентрация антител 1:5 разведение. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | Это антитело также может быть использовано для обнаружения зрелых MK (процент положительных клеток обычно ниже, чем при использовании анти-CD42a). Конечная концентрация антител 1:10 разведение. |
| Alexa Fluor 647 Мышиный античеловеческий CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | в настоящее время распространяется компанией Bio-Rad. Конечная концентрация антител 1:10 разведение. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | настоящее время распространяется компанией Bio-Rad. Контроль изотипа антитела |
| Анти фон Виллебранд фактор кролика поликлональный | Abcam | AB6994 | 1:200 разведение |
| V450 мышь анти-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1:20 разведение |
| V450 контроль изотипа | BD Biosciences | 580373 | 1:20 разведение |
| PAC1-FITC антитело | BD Biosciences | 340507 | 1:10 разведение |
| Anti CD62p мышь моноклональный | Abcam | AB6632 | 1:200 разведение |
| Alexa Fluor 488 козий анти-кролик IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 разведение |
| Alexa Fluor 594 козий анти-мышиный IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 разведение |
| Ig Isotype Control коктейль-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype Control антитело |
| Пропидиум йодид | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Абсолютные счетные бусины | Молекулярные зонды, Invitrogen | C36950 | Счетные бусины |
| Название | Company | Номер в каталоге | >Комментарии |
| Материалы | |||
| LS колонки | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Меньшие и большие колонны также коммерчески доступны |
| MidiMACS Сепаратор | магнит Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL круглое дно полипропиленовые трубки FACS, с защелкивающейся крышкой, стерильные | технологии in vitro | 352063 | |
| стеклянные стекла | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Монтажный материал с DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Монтажный материал Antifade с DAPI |
| strong>Название>< | >Каталожный номер | >Комментарии | |
| >Оборудование | |||
| Инвертированный микроскоп | Leica | DMIRB инвертированный микроскоп | |
| Флуоресцентный микроскоп | Zeiss | Vert.A1 | |
| Анализатор клеток | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Цитоспиновая центрифуга | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Название | Company | Catalog Number | Комментарии |
| Software | |||
| Программное обеспечение для анализа клеток | BD Biosciences | FACS Программное обеспечение Diva Программное обеспечение | |
| анализа одиночных клеток | Tree Star | FlowJo | |
| Программное обеспечение для флуоресцентного микроскопа | Zeiss | Zen 2 blue edition |
Ссылки
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-m....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
