Summary
Megakaryocytes son derece saf bir nüfusa kablosunu elde edilebilir kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 için bir yöntem+ hücre izolasyon ve megakaryocyte farklılaşması burada açıklanmıştır.
Abstract
Trombosit üretim başta olmak üzere thrombopoiesis bilinen bir işlem kemik iliğinde görülür. Thrombopoiesis sırasında hematopoetik progenitör hücre ölümcül trombosit proplatelets olarak adlandırılan uzun sitoplazmik işlemlerden serbest bırakmak için ayırt megakaryocytes denilen formu trombosit öncüleri ayırt etmek. Megakaryocytes nadir hücreler kemik iliği sınırlı ve bu nedenle labaratuar kullanımı için yeterli sayıda hasat etmek zordur. Verimli üretim insan megakaryocytes, CD34 kültür tarafından elde vitro olabilir+ hücreleri uygun koşullar altında. Burada ayrıntılı protokolünü CD34 yalıtım açıklar+ hücreleri göbek kordonu kan örnekleri sıralama manyetik hücre. Serum-Alerjik koşullar altında son derece saf, olgun megakaryocytes üretmek için gerekli adımları açıklanır. Fenotipik analiz megakaryocyte farklılaşma ve proplatelet oluşumu ve trombosit üretim belirlenmesi ayrıntılarını da temin edilmektedir. Megakaryocyte farklılaşma ve/veya anti-trombosit antikorlar veya thrombopoietin mimetics gibi proplatelet oluşumu etkilemek effectors kültürlü hücrelere biyolojik işlevi incelemek için eklenebilir.
Introduction
Yalıtım birincil insan megakaryocytes (MK) düzenli labaratuar kullanımı için yeterli sayıda burada çekirdekli hücreler1~0.01% için hesap onların düşük frekanslı kemik iliğinde nedeniyle mümkün değildir. Ex vivo genişleme ve hematopoetik kök ve belirli büyüme faktörleri varlığında progenitör hücre farklılaşması bir uygun alternatiftir. Sitokinler kök hücre faktörü (SCF; c-kit ligand) ve İnterlökin (Il) -3 ve IL-11 de dahil olmak üzere bir dizi olmuştur MKs. Thrombopoietin (TPO) üretmek için kültür sistemlerinde istihdam megakaryocytic kültürler için en etkili büyüme ve farklılaşma faktörü olduğunu ve tek başına veya diğer sitokinler, SCF ve IL-32gibi ile etkilidir. TPO kök hücre popülasyonlarının yayılması ve MKs2olgunlaşma neden üzerinde hareket edebilir.
MK üretmek trombosit proplatelets adı verilen sitoplazmik çıkıntılar üzerinden ve, içinde vivo, yaklaşık 1 x 1011 trombosit günlük trombosit sayısı 150-400 x 109/l trombosit üretim vitro sürdürmek için kurulan 1000 kadar olmasıdır -kat vivo içinde 3tahmin ediyor ve bu artış CD34 kullanarak çok sayıda kültür koşulları vermiştir daha düşük+ MK ve trombosit üretim vitrogeliştirmek için hematopoetik progenitör hücre. CD34 ilk kaynak+ MK farklılaşma için kullanılan hücre insan periferik kan4oldu. Diğer hücre kaynakları kemik iliği5,6, embriyonik kök hücre/indüklenen pluripotent kök hücreler (ESC/IPSC)7ve göbek kordon kanı (UCB)8,9,10 yer alıyor . İnsan kemik iliği CD34+ 11 ve fare lineage negatif kemik iliği hücreleri5 üretmek MK ve trombosit içinde vitro; Yine de, insan kemik iliği kullanılabilirlik eksikliği CD34 kaynağı olarak kullanılmasını sınırlar+ hücreleri. Buna ek olarak, ESC ve IPSC hücre vitro trombosit üretim için sınırsız bir kaynağı temsil eder. Trombosit üretim bu hücrelerden besleyici hücreler fare OP9 hücreleri ve daha uzun kültür süre gibi gerektirir. Trombosit koşullarda besleyici-Alerjik türetilmiş daha az işlevsel12görünmektedir. trombosit IPSC kaynaklı ondan beri onlar-ebilmek var olmak genişlemek için büyük ölçüde klinik ortamlarında kullanımı olması muhtemel. Bu işlem lentiviral-aracılı iletim transkripsiyon faktörleri ve uzun vadeli hücre kültür13gerektirir.
UCB CD34 erişilebilir bir kaynak olduğunu+ kolayca kullanılabilir hücre araştırma ayarları. TPO yalnız kordon farklılaşma teşvik kan kaynaklı CD34+ hücreleri ve bu son derece saf, olgun MKs ezelî belgili tanımlık lüzum için serum takviyesi ya da besleyici hücreler ile ortak kültür için artış verir. Diğer sitokinler SCF farklılaşma UCB CD34 dan düşebilir gibi Flt-3 ligand ve IL-11 olgunlaşmamış megakaryocytes14üretimini teşvik ederken+ , hücreleri. Bu protokolünü açıklar yüksek saf MK kültürler kordon kanı CD34+ üretim koşullarında serum içermeyen hücreler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu iletişim kuralı Güney Doğu Sydney insan araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve University of New South Wales insan araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Göbek Kordon kanı sağlıklı bağış elde Sydney Kordon Kanı Bankası tarafından (Sydney, NSW, Avustralya) sağlandı. Yaklaşık 100 mL hacimli bu yordam için kullanılmıştır.
Not: Sınıf II Biyogüvenlik aseptik teknik kullanılarak kabine çalışmaz. Kordon kan torbası % 70 etanol ile dış dezenfekte etmek. Steril aletlerin (makas, cımbız) için bu yordamı kullanın.
1. kordon kan hücresi hazırlık ve CD34 yalıtım+ hücreleri
- Steril ayrılık arabellek (SB) fosfat tamponlu tuz (PBS) ile pH 7.2 ve içeren % 0.5 sığır serum albümin ve 2 mM EDTA, hazır olun.
- SB 10 mL (bir tüp 10 mL kan başına gereklidir) 50 mL konik tüp içine dağıtmak. Bir 10 mL şırınga monte G18 künt iğne kullanarak, 10 mL kan çantasından çizmek ve SB 10 mL içeren 50 mL tüpler içine dağıtmak.
- Lenfosit ayrılık medya ( Tablo malzemelerigörmek) 15 mL tüp iki katman oluşturma seyreltilmiş kan içeren altýna ekleyin.
Not: medya yavaş yavaş farklı katmanları karıştırma önlemek için tüp altındaki dağıtmak. - Tüpler, 1200 × g (RT) oda sıcaklığında 30 dakika santrifüj kapasitesi yok break ve hiç ivme ile.
- Aktarım katmanı içeren mononükleer hücreler (yaklaşık 5-10 mL her tüp) Pasteur pipet kullanarak yeni 50 mL tüp tüp merkezine yakın. SB her tüpün toplam hacmiyle 50 mL ekleyin.
- 400 × g RT. atma, 10 min için de süpernatant santrifüj kapasitesi.
- Askıya alınan hücrelerin hücre topakları SB. birleştirin 5-10 ml Pasteur pipet ile dikkatli bir şekilde resuspend ve 50 mL ile SB ses getirmek.
- Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre kullanarak veya otomatik hücreleri hesaplama counter ( Tablo malzemelerigörmek) hücre. CD34 yüzdesini belirlemek için+ örnek, resuspend 2.5 × 105 100 µL SB ve leke hücrelerde 4 ° C'de anti-CD34-PE antikor için 15-30 dakika 10 µL ekleyerek hücreleri Akış Sitometresi (şekil 1A) tarafından analiz.
- Santrifüj tüpleri 4 ° C'de 10 dakika için 400 × g de Süpernatant atmak.
Not: Eğer değilse hemen gerekli, mononükleer hücreler bu aşamada donmuş olabilir. - SB 300 µL 108 hücre başına hücrelerde resuspend. FcR insan IgG 100 µL ekleyin (Reaktif, engelleme bkz: Malzemeler tablo) ve CD34 manyetik boncuklar 108 hücre başına 100 µL. Karışımı yavaşça ve 30-40 dk 4 ° C'de kuluçkaya.
Not: Bir tek hücre süspansiyon gereklidir (gerekirse, hücreleri yine de 30 µm filtre reaktifler eklemeden önce geçmek). Burada açıklanan 108 hücreler için veya daha az reaktif birimler kullanın. 10'dan fazla8 hücreler için buna göre reaktifleri (SB, çözüm ve CD34 manyetik boncuklar engelleme) ölçeklendirin. - LS ayrılık sütun kuluçka döneminde LS sütun bir manyetik tutucu içinde yerleştirerek ve atık SB. atma 3 mL ile yıkama hazırlayın.
Not: LS ayrılık sütunları ilâ 2 × 108 toplam hücreleri ile yüklenebilir. Küçük ve büyük sütunlar kullanılabilir. - 5-10 mL SB hücre karışıma ekleyin ve 10 dakika süreyle 400 × g, santrifüj süpernatant atın.
- Hücreleri SB 1.5 ml resuspend ve LS sütun üzerine hücre süspansiyon (1,5 mL) yükleyin. 15 mL toplama tüp (negatif kesir #1) etiketlenmemiş hücreleri içeren aracılığıyla akış toplamak. Sıvı drenaj ve sütun SB 1,5 mL ile yıkamak izin.
- (3 mL) ile toplanan akışı sütuna geri yüklemek ve aynı 15 mL toplama tüp (negatif kesir #1) aracılığıyla akış toplamak. LS sütun 3 kez SB 3 mL ile yıkayın.
Not: gerekirse, negatif kesir (12 mL) hücrelerde CD34 yakalanması tespit etmek için anti-CD34 antikoru ile Boyanabilen+ hücreleri tarafından LS sütun. - Sütun manyetik ayırıcı kaldırın ve hücrelerin yavaş yavaş şırınga lavabo pompası ile SB 2 mL ile yeni bir 15 mL tüp içine boşalt.
- Sütun geri manyetik ayırıcı ve yük hücreleri 2 mL sütuna yerleştirin. Aracılığıyla akış toplamak ve 2 mL SB ile yıkayın. Bu negatif kesir #2 (4 mL) olduğunu.
- Manyetik ayırıcı LS sütun kaldırın ve 2 mL SB. Flush hücre sürekli ve sıkıca ekleyin CD34 toplamak için enjektör pompası ile+ hücre kesir. Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak.
- Santrifüj tüpü ile 400 × g 4 ° C'de 15 dakika de olumlu kesir Süpernatant atmak. CD34 için serum-Ücretsiz medya hücrelerde resuspend+ hücreleri (SFM, Tablo malzemelerigörmek).
Not: Eğer değilse hemen gerekli, hücreler sıvı azot içinde bu aşamada donmuş olabilir.
2. saflık denetimi izole CD34+ hücreleri
- Pozitif kesir 10 µL anti-CD34-PE antikor ve 20 µL anti-CD45-PerCP antikor 4 ° c (ayrı bir tüp kullanımı izotip denetimleri) 15 dakika ile 2 x 104 hücrelerden leke (şekil 1B).
- SB yıkamak için 1 mL ekleyin. 400 × g 10 dakika süreyle de SB 200 µL Resuspend Pelet santrifüj kapasitesi.
- Akış sitometrik çözümlemesi gerçekleştir ve enkaz (şekil 1B) dışlamak için canlı hücre nüfus kapısı. Kapıyı PE ve PerCP izotip denetimleri (şekil 1B) kullanarak PE ve PerCP olumlu nüfus için ayarla ve CD34 yüzdesini belirlemek+/CD45+ hücreleri.
3. megakaryocyte farklılaşma
- Tohum 5 × 105 hücre/mL CD34+ hücreleri iyi bir 12-şey plaka başına 50 ng/mL rekombinant insan thrombopoietin ile (rhTPO) takıma SFM 2 ml. Hücreleri 37 ° c, % 5 CO2 oksijen bir atmosferde kuluçkaya. Önce analiz için gerekli Konfluent hücrelerdir, hücreleri hasat ve birden çok wells taze medya ve rhTPO ile ayrılmıştır.
Not: İki ya da üç kuyular farklılaşma farklı zaman noktalarda (örneğin, gün 7, 9 ve 10) izlemek için özel olarak hazırlanmalıdır. - Hücre farklılaşması hücre diğer Wells bozmadan izlemek için bir kenara kuyulardan hasat.
- 20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antikor hücrelerle leke ve 10 µL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 antikor son hacmi 100 µL. bir denetim kurmak tüp ilgili izotip kontrol antikorları kullanarak. 15-30 dk 4 ° C'de için kuluçkaya
- SB yıkamak için 1 mL ekleyin.
- SB yıkamak için 1 mL ekleyin. Vasıl 400 × g 10 dakika süreyle santrifüj Resuspend Pelet 100 µL SB ve spin 1000 x g 5 dk. düzeltme hücrelerin metanol için 30 s. hava kuru, daldırma tarafından slayt üzerinde de bir cam slayt üzerine eklemek DAPI içeren medya montaj 20 µL ( Tablo malzemelerigörmek) , kapak ile coverslip ve floresan mikroskop (şekil 2A) kullanarak görselleştirmek.
- 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 ile yıkayın ve vasıl 400 × g 10 dk santrifüj kapasitesi, aynı arabellek 100 µL içinde resuspend ve anti-fare IgG-Alexa 594 ve anti-tavşan IgG-Alexa 488 (1: 100) ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya, 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 ile yıkayın, aynı arabellek 100 µL içinde resuspend ve CD42b-APC anti, 20 µL ekleyin. Sonra hücreleri cam slayta 3.6.1. adımda açıklandığı gibi spin ve örnekleri mikroskobik görselleştirme için 3.6.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.
- Bir keresinde SB 1 mL ile yıkama ve Pelet Hipotonik sitrat arabellek (1,25 mM sodyum sitrat, 2.5 mM Sodyum Klorür, 3.5 mM dekstroz) içeren 20 µg/ml propidium iyodür ve %0,05 300 µL resuspend Triton-X 100. Işıktan korunan 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
- 20 µg/mL nihai bir konsantrasyon RNase ekleyin ve ışıktan korunan 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Propidium iyodür yoğunluğunu Akış Sitometresi tarafından 30.000-50.000 olaylar (şekil 2C) CD41-FITC+ nüfusunun toplayarak belirlemek.
4. proplatelet sayımı, trombosit numaralandırma ve trombosit aktivasyon
- Günde 8 veya 9 farklılaşma ve tohum 1 × 104 hücreleri/kuyuda taze SFM 50 ng/mL rhTPO ile takıma 200 µL 48-şey levha, hücrelerden (Adım 3.1) hasat. 37 ° C, % 5, 5 gün boyunca kültür CO2.
Not: nüsha wells Nefelometri amaçlar için tohum. Bu düşük yoğunluklu görselleştirme için gereklidir ve proplatelet-MK. Proplatelets genellikle yatak saymaya başla kültür 2 gün sonra görünen. 4 ve 5 gün tepedir. - Yatak proplatelet MK tüm iyi bir ters ışık mikroskobu 10 X-20 X hedefleri kullanarak üzerinde saymak.
Not: hücreleri oda sıcaklığında uzun süre tutarak büzülme proplatelet uzantıları neden olur bu yana bir ısıtmalı (37 ° C) mikroskop sahne, tercih edilir. Proplatelets MK vücuttan uzun uzantıları olarak gözlenir. Her MK birkaç proplatelet çıkıntılar olabilir. Proplatelets geliştirirken, MK gövdesi boyutu azalır. - Hücre hasat ve vasıl 400 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. 20 µL Anti-insan CD41-FITC antikor, hücrelerle 3.3 ve 3.4 adımlarda açıklandığı gibi leke. Yatak proplatelet MK (pbMK) yüzdesini hesaplamak: pbMK (%) = [(Proplatelet taşıyan MKs/de) / (Toplam CD41+ hücreleri / de)] x 100
- Trombosit kültür orta serbest saymak için yavaşça hücreleri Pasteur pipet ile karıştırın ve 100 µL gün 14 veya 15 kültür toplamak.
- 20-30 dk 4 ° C'de 20 µL Anti-insan CD41-FITC antikor ile leke İlgili izotip kontrol antikor kullanarak bir denetim tüp kadar ayarla.
- SB 150 µL ve boncuk sayma 50 µL ekleyin.
- Akış sitometrik çözümlemesi için FSC ve SSC ölçek oturum için ayarlayın. Kullanım normal insan kan trombosit trombosit açısından zengin plazma üzerinden CD41-FITC ile trombosit (şekil 3A) geçişi ayarlamak için 4.4.1 bölümünde açıklandığı gibi lekeli.
- Akış Sitometresi tarafından boncuk sayma ile lekeli trombosit analiz. FSC SSC dağılım çizim (şekil 3A) karşı kullanarak boncuk sayma 1000 olayları toplamak. Formülü kullanarak CD41-FITC olumlu olayları üzerinde (şekil 3B) alan trombosit sayısını hesaplar:
Trombosit µL başına = [(CD41-FITC olumlu olayların numara)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/örnekleme birimi)]
- Trombosit aktivasyon analiz etmek için yavaşça hücreleri Pasteur pipet ile karıştırın ve 100 µL gün 14 veya 15 kültür toplamak. 1 mL Tyrode'nın arabellek (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 0.2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5.5 mM D-glikoz, pH 6,5) ve santrifüj 200 x g hücreleri cips için 5 dakika için ekleyin.
- Toplamak süpernatant ve santrifüj vasıl 800 x g platelet boyutlu parçacıklar cips için 10 dakika için.
- Süpernatant atın ve Tyrode'nın arabellek 100 µL içinde resuspend. PAC1-FITC antikor ve adenozin nükleotittir (ADP) 20 µL bir son konsantrasyon 20 µM. için eklemek FITC olumlu olaylar yüzdesini belirlemek için Incubate, oda sıcaklığında 20 dk. analiz Akış Sitometresi ile için. Pozitif kontrol (şekil 3 c) olarak aynı şekilde tedavi taze insan trombosit kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı son derece saf MK kültürler kablosu hazırlanması sağlayan kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 yüzdesi+ hücreleri kablosunu prize kan mı yaklaşık %1,315 (şekil 1A) ve mononükleer hücreler (Adım 1.8) Aralık 90-300 x 10'dan toplam sayısı6 UCB birim başına. CD34 saflığı +/ hücreleri CD45 + 90 yalıtım aralığından % 99 (şekil 1B) sonra. MK (CD41 tanımlanan+ hücreleri) erken serum-Alerjik CD34 içinde gözlenen+ hücre kültürleri rhTPO huzurunda. 7 günde yüzdesini olgun MK (CD41+ ve CD42a+ hücreleri) genellikle 30-%40 (şekil 1 c) olduğunu. CD41 en üst düzeyde+ ve CD42a+ Çift Kişilik pozitif hücrelerinin (% 90-99) 10 ve farklılaşma (şekil 1 c) 12 gün arasında görülmektedir. Esas olarak kordon kanı kaynak ve CD34 saflığı gözlenen değişkenliğin bağlıdır+/CD45+ adım 1.17 izole hücreler. 5-10 giriş CD34 başına 10 gün aralıklardaki olgun MK verimini+ hücre. MK olgun (CD41+/CD42b+) floresan altında gözlenen mikroskobu şekil 2Agösterilir. Kültürlü MK büyük, genellikle multinucleated hücreler (şekil 2A, ok uçları) görünür. MK'ın taneli içerik vWf (yeşil) ve CD62p (p-selektin, kırmızı) boyama (şekil 2B) tarafından tespit edilmiştir. Kültürlü MKs gözlenen Ploitlik dağıtım şekil 2Ciçinde gösterilir.
Proplatelets uzun, boncuklu lifler veya MK vücuttan genişletmek filamentler vardır. Proplatelets birkaç yüz mikrometre uzun16 ve şube ve şişmiş bölgeleri içerir. Proplatelet MK taşıyan bir karakteristik şekil 2Bolarak gösterilmektedir. Yatak proplatelet MK (pbMK) yüzde 1.3 ± %0.17 idi.
Trombosit analiz ve protokol açıklandığı gibi sayılır. Şekil 3B' de gösterildiği süpernatant hücre kültüründe en trombosit içinde periferik kan trombosit ve trombosit işaret CD41 pozitif (şekil 3B) kapısı analitik düşmek. Trombosit verim MK. kültüründe üretilen trombosit başına 42 trombosit için 19 bu yöntemi aralığından trombosit agonistler harekete geçirmek özel PAC1 Monoklonal antikor (şekil 3 c) artan bağlama tarafından belirlenen ADP gibi tarafından etkinleştirilebilir .
Resim 1: Akış Sitometresi araziler CD34+ hücre izolasyon ve MK farklılaşma kültür. İnsan kordon kanı (Adım 1.8) saf (sol panelin gösterildiği gibi geçişli)(a)mononükleer hücreler CD34 yüzdesini belirlemek için anti-CD34-PE antikor ile lekeli+ hücreleri örnek (% 1,3, doğru kapı aynası). (B) ayrılıktan sonra olumlu kesir (Adım 1.17) anti-CD34-PE ve anti-CD45 PerCP antikorlar ile lekeli. Zenginleştirilmiş CD34+ nüfusu (%98,1, doğru kapı aynası, üst sağ çeyreği) şekilde belirtilir. (C) MK fenotipik analizini vitro hücrelerden CD34 + 7 gün için ayrıştırılan veya 11 gün anti-CD41 ve anti-CD42a antikorları ile lekeli. Olgun MK için her iki CD41 olumlu+ ve CD42a+ (üst sağ çeyreği). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: MK boyama, Ploitlik ve proplatelet oluşumu vitro. (A)gün 11 MK anti-CD41-PE ve CD42b-APC antikorlar ile lekeli floresan görüntülerini. Çekirdeklerin DAPI ile lekeli. Sarı ok ucu çok nükleer MKs. ölçek bar, 30 µm. (B) floresan görüntülerini gün 14 MK ile lekeli vWf anti (yeşil), CD62p (kırmızı) ve anti-CD42b-APC (macenta) antikorları anti gösterir. Çekirdeklerin DAPI ile lekeli. Ölçek çubuğu, CD41 Ploitlik dağılımını gösteren 15 µm (C) temsilcisi gating strateji+ olaylar. Grafik (alt paneli) Ploitlik sınıfları gözlenen dağılımını gösterir (n = 4), hata çubukları, SD (D) yatak proplatelet MK karakteristik morfolojisi gösterilir. MK vücut okla gösterilir. MK (proplatelets) uzanan uzun sitoplazmik süreçleri ok uçları tarafından belirtilir. Bazı alanlarda/alanları görünümün bir veya iki MK üreten olup olmadığını proplatelet bu uzantılar açık olamayabilir. Bu bir yatak proplatelet MK. 10 X objektif bir ters mikroskopla çekilen görüntüleri olarak sayılması. Ölçek çubuğu, 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Trombosit bolluk vitro ve trombosit aktivasyon üretilen. (A)insan trombosit trombosit açısından zengin plazma üzerinden ön ve yan dağılım (sol panelde) günlük ölçeği kullanarak analitik kapısı ayarlamak için kullanılmıştır. Doğru kapı aynası MK kültürlerden hücreleri gösterir. Trombosit üretilen vitro insan trombosit için tanımlanan analitik kapısında görülmektedir. Hücreleri ve sayım boncuk şekilde belirtilmiştir. PLT, trombosit (B) trombosit üretilen vitro anti-CD41 antikor ile lekeli. Trombosit açısından zengin plazma üzerinden insan trombosit ileri için günlük ölçek ve yan dağılım kullanarak analitik kapısı ayarlamak için ve CD41-FITC kapısı profilinde karşılaştırmak için kullanılmıştır. C-FITC, FITC izotip kontrol (C) trombosit tedavi ADP tarafından 20 µM. insan trombosit son bir konsantrasyon trombosit açısından zengin plazma aşağıdaki etkinleştirme denetimi (üst panelleri) olarak kullanılmıştır. Trombosit kültüründe üretilen alt panelleri gösterilir. PAC1 bağlama antikor trombosit aktivasyon gösterir. C-FITC, FITC izotip kontrol. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol MK ve trombosit kültür göbek kordon kanı üzerinden tutarlı üretimi için uygundur. Bu hücreler MK yayılması, farklılaşma, proplatelet oluşumu ve trombosit üretim uyuşturucu veya biyolojik etkinlikler etkisi gibi çeşitli işlemler çalışma için kullanılabilir.
Çeşitli kültür medya ve sitokin kombinasyonları literatürde mevcuttur. Toplama+ kök hücre faktörü, Flt-3 ligand, IL-3 ve Il-6 destekler CD34 gibi sitokinler, hücre çoğalması. Ancak, bu genişleme azaltılmış MK saflık kültür14sonuç. Burada serum-Ücretsiz medya ve rhTPO yalnız, kullanarak anlatılan yöntemi progenitör hücrelerinin önemli genişleme izin vermez ancak unilineage megakaryocytic yayılması ve farklılaşma ve MK tutarlı üretim izni (90-%99 CD41+ CD42a+ Çift Kişilik pozitif hücrelerinin) diğer soy kirlenme olmadan. MK oluşumu için kültür süresi 10-12 gün stromal destekleyen veya besleyici hücreler için gerek kalmadan olur. Bu olumlu büyük kültür dönemleri (20 gün içinde)17,18gerektiren diğer yöntemleri ile karşılaştırır. 19-42 trombosit MK başına veya giriş CD34 başına 420 trombosit kadar trombosit verimidir mevcut iletişim kuralından+ hücre. Çoğu iletişim kuralları sonuç düşük trombosit içinde18,19üretir.
Verim diğer yöntemleri göreli olarak yüksek olsa da, CD34 hücrelerinin büyük kaynaklarına trombosit terapötik kullanım için yeterli sayıda üretmek için ihtiyaç vardır. Kordon kan MK daha düşük bir oranda olgun, (alt Ploitlik sınıfları) genellikle küçüktür ve trombosit üretim kapasitesi20azalttı. Yine de, taze UCB genellikle daha erişilebilir bir kaynaktır ve bu araştırmacılar için önemli bir avantaj temsil eder. MK ve trombosit tedavi amacı ile daha yüksek verimleri üretebilir başka yöntemler de açıklanan13,17olmuştur.
Bazı kaynaklar göz önünde bulundurulacak değişkenlik vardır: A) kalite kordon kanı birimi. Sadece 24 saat içinde toplanan kordon kanı CD34 kaynağı olarak kullanılması gereken+ hücreleri. Kordon kan pıhtıları içeren birimleri de atılmalıdır. B) CD34 yüzdesi+ hücre mononükleer hücre kesir (Adım 1.8): mononükleer hücre kesirler+ az %0,3 CD34 ile kullanarak hücreleri hücre içinde düşük verimleri nispeten düşük saflık CD34+ neden olabilir. Bu hücreler MK farklılaşma için tavsiye edilmez. Sadece yerçekimi zorla sıvı drenaj izin vermek önemlidir (örneğin, adımlar 1.13, 1.14, 1.16). Sütun tıkanması durumunda, bu sütunu mıknatıs kaldırın, şırınga pistonu hafifçe hücrelerle yeni bir tüp içine itmek ve yeni bir denge sütun yeniden önerilir.
Bir dizi koşul trombosit sayısı ve işlevini etkiler. Trombositopeni dış ve iç kanama için yol açabilir platelet sayıları belirgin bir düşüş gösterir. İmmün trombositopeni (ITP) ve ilaca bağlı trombositopeni (DITP) gibi koşulları oto-immün trombositopeni21,22iyi bilinen nedenleri. Sistemik lupus Eritematozus ve romatoid artrit gibi diğer immün hastalıklar da trombosit zararlı etkileri olabilir. Non-immün trombositopeni kanser tedavisi, ağır travma, enfeksiyon, kemik iliği yetmezliği ve cerrahi nedenler. Trombosit kemoterapi gören veya kök hücre nakli alan hastalar tarafından yüksek kullanımı nedeniyle, trombosit transfüzyonu giderek son on yıl içinde artmıştır. MK ve trombosit araştırma hiç şüphesiz büyük ölçekli trombosit üretim için klinik uygulamaları geliştirmede size yardımcı olacaktır. Availability-in vitro üretilen fonksiyonel trombosit trombosit sıkıntısı önlemek ve trombosit transfüzyonları dirençli hastalarda içine izin. MK farklılaşma ve trombosit üretim vitro çalışma ve patolojik koşulları ve trombosit oluşumuna yol açan fizyolojik mekanizmalar anlayışı önemli araçlardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Avustralya sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (grant 1012409 BHC için bağlı proje) desteğiyle kabul etmiş oluyorsunuz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H.
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
