Summary
En protokol til kendetegner kemiske sammensætning af udåndede ånde i realtid ved hjælp af sekundære nanoelectrospray ionisering koblet til massespektrometri er demonstreret med høj opløsning.
Abstract
Udåndede flygtige organiske forbindelser (VOC) har vakt stor interesse, da de kan tjene som biomarkører for klovesygediagnosticering og miljømæssige eksponering i en ikke-invasiv måde. I dette arbejde præsenterer vi en protokol til at karakterisere de udåndede VOC i realtid ved hjælp af sekundære nanoelectrospray ionisering koblet til høj opløsning massespektrometri (Sec-nanoESI-HRMS). Hjemmelavet sek-nanoESI kilden blev let nedsat baseret på en kommerciel nanoESI kilde. Hundredvis af toppe blev observeret i de baggrund-trækkes massespektre af udåndede ånde, og masse nøjagtighed værdier er-4.0-13,5 ppm og-20.3-1,3 ppm i positive og negative ion påvisning tilstande, henholdsvis. Toppene blev tildelt med nøjagtige elementært sammensat efter nøjagtige masse og isotopiske mønster. Mindre end 30 s bruges til en udånding måling, og det tager ca. 7 min. seks replikerede målinger.
Introduction
Med hurtig udvikling af moderne analyseteknikker, er hundredvis af flygtige organiske forbindelser (VOC) blevet identificeret i menneskelige udåndede ånde1. Disse flygtige organiske forbindelser for det meste skyldes alveolær luft (~ 350 mL for en sund voksen) og anatomisk døde rum luft (~ 150 mL)2, der er berørt af kroppen stofskifte3,4,5,6,7 ,8 og miljøforurening9, henholdsvis. Som et resultat, hvis der konstateres, er disse flygtige organiske forbindelser lovende anvendes som biomarkører for klovesygediagnosticering og miljømæssige eksponering i en ikke-invasiv måde.
Selvom gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) er mest anvendte teknik for kvalitativ og kvantitativ analyse af udåndede VOC2, har direkte MS teknikker, som er blevet udviklet til realtids ånde analyse, fordelene høje tid opløsning og enkle pre prøveforberedelse. Direkte MS teknikker, såsom proton overførsel reaktion MS (PTR-MS)10, valgt ion flow rør MS (SIFT-MS)11, sekundære electrospray Ionisation MS (SESI-MS)12,13 (også benævnt nemlig extractive electrospray ionisering MS, EESI-MS14,15), trace atmosfærisk gas analyzer (Bjarne)16 og plasma ionisering MS (PI-MS)17 er blevet undersøgt i de seneste år.
Blandt alle direkte MS-teknikker er Troels kendt som en universel bløde ionisering teknik19,20,21; og kilden er let at blive tilpasset og koblet til forskellige typer af massespektrometre, fx, tid for flyvning massespektrometer8,15, ion trap mass spectrometer14 og orbitrap massespektrometer12 ,18. Indtil nu, Troels-MS held har været anvendt til at diagnosticere lungesygdomme22, måle døgnrytme3,6,23, farmakokinetik7,8, og afslørende stofskifteveje4, osv. Senest har er en kommerciel SESI kilde blevet tilgængelige.
I denne undersøgelse, blev en letkøbt og kompakt sekundære nanoelectrospray ionisering kilde (Sec-nanoESI) oprettet og koblet til en høj opløsning massespektrometer. Real-time målinger af udåndede VOC i åndedrag blev præsenteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsigtig: Kontakt venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Brug passende personlige værnemidler, fx, laboratoriekittel, handsker, beskyttelsesbriller, fuld længde bukser og lukket tå sko).
1. konfigurere sek-nanoESI kilde
- Oprette en sek-nanoESI kilde ifølge Troels proces, dvs, er ånde gas indført for at skærer en electrospray plume og ioniseret af ladede dråber (figur 1). Kilder bygget i individuelle labs afhænger interface massespektrometer bruges24,25. Her, etablere sek-nanoESI source baseret på en kommerciel nanoESI kilde (figur 2) og gennemføre til en benchtop Quadrupol orbitrap massespektrometer.
Bemærk: Hoveddelen af kilden er et kubisk rustfrit stål kammer (længde 25 mm, I.D. 13 mm) (figur 2b) med et indløb (I.D. 4 mm) at indføre nanoESI kapillær ind i kammeret. Salen er således ikke helt forseglet (figur 2b). - Installere to rustfrit stål rør (længde 8 mm, OD 5 mm, I.D. 3 mm) på hver side af salen for gas levering.
- Udstyre to kvarts windows (I.D. 14 mm) på toppen og bunden af salen at kontrollere placeringen af spidsen af nanoESI kapillær og nanoESI spray enten af øjne eller en digital mikroskop.
- Svejse kammer at feje kegle af den massespektrometer.
Bemærk: Design kan ændre sig afhængigt af den særlige geometri af atmosfærisk tryk interface massespektrometer anvendes i enkelte laboratorier.
2. instrumentet optimering
- Kalibrere massespektrometer i både positiv og negativ ion påvisning tilstande efter fabrikantens anvisninger. Ved at anvende kalibrering, er massespektrometer parametre, såsom linse potentialer og påvisning betingelser, optimeret til at give god følsomhed og peak figur på en bestemt opløsningsværdi. Den masse opløsning på 70000 bruges her.
- Udføre komplet Q Exactive kalibreringer ved hjælp af kommercielle ESI kilden; men masse kalibrering kan udføres med enhver kompatibel kilder, herunder tilpassede dem.
- Indstil temperaturen af ion-overføringsrøret (ITT) af massespektrometer > 100 ° C. Selvom den højeste temperatur kan indstilles ved 350 ° C, kan det medføre nedbrydning af nogle forbindelser. 150° C bruges altså i dette eksperiment.
Bemærk: For massespektrometre featuring en prøveudtagning blænde i stedet for ITT, temperatur af prøveudtagning blænde er indstillet > 100 ° C. - For de ESI opløsningsmiddel og flow, Vælg den relevante ESI opløsningsmiddel på grundlag af egenskaber af opløsningsmiddel (fx, polaritet og volatilitet) og målrettede forbindelser (fx, proton affinitet). En blanding af vand og methanol i forskellige forhold har været almindeligt brugt som ESI opløsningsmiddel25. I dette eksperiment, bruge vand som indeholder 0,1% (v/v) myresyre, for høj ionisering effektivitet har været rapporteret dette opløsningsmiddel13,19,23. Indstille strømningshastigheden af ESI opløsningsmiddel i intervallet 0-1,5 μL/min og 200 nL/min.
Bemærk: Degas ESI opløsningsmiddel i 30 min før brug. - Optimere sek-nanoESI source parametre, primært nanoESI spænding og nanoESI kapillær tip holdning. Spændingen almindeligt spænder fra 2,0 til 4.5 kV. Brug 2.5 kV her.
Bemærk: Højere ESI spænding er anvendt som flow renteforhøjelser. Afstanden mellem spidsen og massespektrometer blænde kan justeres fra 1 til 5 mm. Efter optimering, bør den normaliserede intensitetsniveau (NL) observeret i massespektrum > 1 x 106 og variation af samlede ion kromatogrammet (TIC) bør være < 10% i både positiv og negativ ion påvisning tilstande. Masse spektrum og TIC er fremstillet i masseinterval m/z 50-750. - Anvende ren gas til kilden. Dette er et valgfrit trin, der tager sigte på at begrænse indflydelsen af VOC fra indendørs luft. Høj renhed nitrogen gas (N2, 99,99%) eller ren luft kan bruges. Med tilstedeværelsen af ren gas, NL observeret i massespektrum skal være > 1 x 105 og variation af TIC bør være < 10% i både positiv og negativ ion påvisning tilstande. Høj renhed N2 bruges her og leveret på 0,8 L/min.
Bemærk: Den samlede strømningshastighed af ren gas og ånde gas skal være højere end strømningshastigheden gennem blænde af de massespektrometer.
3. måling af udåndede ånde
- Indånde luften indendørs og udføre en normal udånding til ånder ud al luft i lungerne ved en konstant gennemstrømningshastighed. Overvåge udånding strømningshastighed enten af et manometer eller en synlig for emnet flowmåler. Brug Teflon (PTFE) slanger til at levere ånde gas23.
- For at forhindre kondensation af vanddamp inde i slangen, varme rør ved en temperatur på 80-100 oC7,23,27 eller bruge en Nafion tørretumbler28,29. I dette eksperiment udåndede emnet på 0,4 L/min. kontrolleres af en flowmåler.
- Tilslut indfaldende flowmåler til et Nafion rør (længde 60 cm) til at fjerne vanddamp i den udåndede ånde og forbinde outlet af flowmeteret til en PTFE slanger (længde 13 cm, I.D. 4 mm). Det tager < 30 s til en udånding måling.
- Udføre 4-6 replikerede målinger28,29.
- For at minimere forstyrrende virkninger, har deltagerne fra spise, drikke og børste deres tænder mindst 30 min. før målingerne23.
Bemærk: For at minimere påvirkning af VOC fra indendørs luft, det er blevet rapporteret til at indånde ren gas i stedet for indendørs luft26. Når en Nafion slanger bruges, kan nogle polære forbindelser gå tabt. - Under måling, hold øje hvis ion intensitet overstiger den lineære detektionsgraensen for instrumentet eller ej. Mætning af signal kan føre til en artefakt peak, der praktisk taget ikke skyldes sammensat i prøven. Ved indånding gennem næsen, vil en del af omgivende flygtige organiske forbindelser og partikler fjernes; Det er imidlertid værd at bemærke, at forbindelser i den nasale passager kan også blive opdaget.
4. få en ånde fingeraftryk og en tid spor af et stof
- Opnå kromatogrammer og massespektre. Bruge software (f.eks. Xcalibur) til at registrere kromatogrammer og massespektre. Fordi det er direkte MS analyse og ingen chromatografiske separation udføres, samlede ion kromatogrammet (TIC) faktisk angiver tid sporingen af alle de signaler, der er registreret i de massespektre og udpakkede ion kromatogrammet (EIC) viser tid spor af en angivne sammensatte.
Bemærk: For andre kommercielle massespektrometre kromatogrammer og massespektre kan opnås ved tilsvarende data erhvervelse software. - Opnå en udåndede ånde fingeraftryk ved at vælge et antal scanninger i TIC når udåndes ånde måles. Få massespektrum, som repræsenterer et gennemsnit af disse scanninger af softwaren.
- For at fjerne baggrunden toppe fra ånde fingeraftryk, skal du bruge værktøjet fratræk baggrund i softwaren. Der henvises til brugervejledningen fra producenten. Kort sagt, Vælg det samme antal scanninger, når ingen åndedrag prøve er indført, og fratræk baggrund masse spektrum fra ånde fingeraftryk.
Bemærk: I denne metode defineres tærsklen til at identificere funktioner i ånde fingeraftrykket som tre gange standardafvigelsen af baggrunden signal. For andre kommercielle massespektrometre kan baggrund subtraktion udføres af de tilsvarende data erhvervelse software.
- For at fjerne baggrunden toppe fra ånde fingeraftryk, skal du bruge værktøjet fratræk baggrund i softwaren. Der henvises til brugervejledningen fra producenten. Kort sagt, Vælg det samme antal scanninger, når ingen åndedrag prøve er indført, og fratræk baggrund masse spektrum fra ånde fingeraftryk.
- Få en tid spor af et bestemt stof. Vælg peak af et målrettet sammensatte i ånde fingeraftryk, og tiden spor af stoffet er erhvervet senere af softwaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser de ånde fingeraftryk i masseinterval m/z 50-750 registreres under både positive og negative ion påvisning tilstande. 291 toppe (peak intensitet > 5.0x104) og 173 toppe (peak intensitet > 3.0x104) er blevet observeret i baggrunden-trækkes ånde fingeraftryk i positive og negative ion påvisning tilstande, henholdsvis. For at identificere toppe i de massespektre, henvises til tidligere publikationer for detaljer12,18,24,29. Kort sagt er både flygtige metabolitter og VOC fra indendørs luft konstateret. For eksempel, resultater peak på m/z 74.0606 (figur 3a) fra udåndede N, N-dimethylformamid eller aminoactone ifølge Human Metabolome Database (HMDB); toppe m/z 462.1447 og m/z 536.1638 (figur 3a) er fra den adukter af udåndede ammoniak og radikaler (laboratorium kontaminanter)12. De typiske masse nøjagtighed værdier i positiv og negativ ion påvisning tilstande er-4.0-13,5 ppm og-20.3-1,3 ppm, henholdsvis. Figur 4 præsenterer tid spor af indol, en typisk endogene sammensatte, som er registreret af seks replikerede målinger af udåndede ånde fra ét emne. Det tager mindre end 7 min til alle seks målinger.
Figur 1. Skematisk SESI-MS analyse af VOC i udåndede ånde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. (a) en skematisk diagram og (b) et foto af Sec-nanoESI source anvendes i dette eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Baggrund-trækkes ånde fingeraftryk er fremstillet i (a) positive og (b) negative ion påvisning tilstande i masseinterval m/z 50-750. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 4. Tid spor af indol opdaget af seks replikerede målinger af udåndede ånde fra ét emne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konstruere sek-nanoESI source baseret på en kommerciel nanoESI kilde, er ionisering effektivitet højere end ved hjælp af en ESI kilde30. Derudover ionisering effektivitet er yderligere forbedret i et lukket kammer, da det isolerer processen fra luften omgivende baggrund, og på samme tid letter blanding mellem gas-prøven og spray plume. Ved hjælp af en sek-nanoESI, skal mindre parametre optimeres i forhold til en ESI kilde, hvilket gør det lettere for installation, anvendelse og vedligeholdelse.
Hvis ingen signal er observeret eller følsomhed aftager også væsentligt, når du udfører ånde analyse af Sec-nanoESI-MS, bør man undersøge placeringen af spray kapillær tip og også dannelsen af dråber på spidsen af kapillar. Juster spidsen med blænde af de massespektrometer. Ændre spray kapillær til en ny, hvis spray kapillær er blokeret eller spidsen er forurenet. Ellers Tjek om ITT af instrumentet er blokeret eller forurenet. Udskift eller Rens i ITT hvis nødvendigt. Slå fra ESI spænding før kontrol spray kapillær. Indstil temperaturen af ITT ved stuetemperatur og vente, indtil temperaturen falder.
Troels-HRMS har vist sig for at være en følsom og selektiv teknik til real-time ånde analyse4,6,12. I de sidste par år, har denne teknik været anvendt med succes til måling døgnrytmen variation3,6, overvågning farmakokinetik7,8, identificere stofskifteveje5, osv . Sidst, har aminosyrer i menneskelige ånde været succesfuldt kvantificeres ved Troels-MS for første gang, der er bemærkelsesværdige fremskridt i kvantitativ analyse5. Med yderligere undersøgelser, kunne Troels-HRMS etablere sig som et nyttigt og effektivt noninvasive klinisk metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde er blevet økonomisk støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 91543117).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultrapure water | Merck Millipore, USA | MPGP04001 | Resistance >18.2 MΩ·cm |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, USA | F0507 | Corrosive to the respiratory tract. |
| Nitrogen gas | Guangzhou Shiyuan Gas Co. Ltd., China | N.A.a | Purity >99.99% |
| Q Exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific, USA | 02634L(S/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| NanoESI source | Thermo Scientific, USA | ES002373(S/N); ES071(P/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| Nano LC pump | Thermo Scientific, USA | 5041.0010A(P/N) | / |
| Xcalibur software (Version 3.0) | Thermo Scientific, USA | BRE0008596 | / |
| Dino-Lite Digital Microscope | Tech Video System (SuZhou) Co.Ltd., China | CQ401833R(S/N) | / |
| Nafion tubing | Perma Pure LLC, USA | ME60 | / |
| PTFE tubing (I.D. 4 mm) | Dongguan Hongfu Insulating Material Co. Ltd., China | N.A. | Beware of the possible loss of polar compounds |
| Mass flow controller | Line-Tech, Korea | M15122007 (S/N) | / |
| Flow meter | Yuyao Industrial Automation Meter Factory, China | 40784 | / |
| aN.A.: not available. |
References
- De Lacy Costello, B., et al. A review of the volatiles from the healthy human body. J. Breath Res. 8 (1), 014001-014030 (2014).
- Phillips, M., Greenberg, J. Ion-trap detection of volatile organic compounds in alveolar breath. Clin. Chem. 38 (1), 60-65 (1992).
- Martínez-Lozano Sinues, P., et al. Circadian variation of the human metabolome captured by real-time breath analysis. PLoS One. 9 (12), 0114422-0114438 (2014).
- Garcia-Gomez, D., et al. Secondary electrospray ionization coupled to high-resolution mass spectrometry reveals tryptophan pathway metabolites in exhaled human breath. Chem. Common. 52 (55), 8526-8528 (2016).
- Garcia-Gomez, D., et al. Real-time quantification of amino acids in the exhalome by secondary electrospray ionization-mass spectrometry: A proof-of-principle Study. Clin. Chem. 62 (9), 1230-1237 (2016).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Kohler, M., Brown, S. A., Zenobia, R., Dallmann, R. Gauging circadian variation in ketamine metabolism by real-time breath analysis. Chem. Common. 53 (14), 2264-2267 (2017).
- Gamez, G., et al. Real-time, in vivo monitoring and pharmacokinetics of valproic acid via a novel biomarker in exhaled breath. Chem. Common. 47 (17), 4884-4886 (2011).
- Li, X., et al. Drug pharmacokinetics determined by real-time analysis of mouse breath. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (27), 7815-7818 (2015).
- Amorim, L. L. A., Cardeal, Z. L. Breath air analysis and its use as a biomarker in biological monitoring of occupational and environmental exposure to chemical agents. J. Chromatogr. B. 853 (1-2), 1-9 (2007).
- Bajtarevic, A., et al. Noninvasive detection of lung cancer by analysis of exhaled breath. BMC Cancer. 9, 348 (2009).
- Smith, D., Wang, T. S., Pysanenko, A., Španěl, P. A selected ion flow tube mass spectrometry study of ammonia in mouth- and nose-exhaled breath and in the oral cavity. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22 (6), 783-789 (2008).
- Li, X., Huang, L., Zhu, H., Zhou, Z. Direct human breath analysis by secondary nano-electrospray ionization ultrahigh resolution mass spectrometry: Importance of high mass resolution and mass accuracy. Rapid Commun. Mass Spectrom. 31 (3), 301-308 (2017).
- Martínez-Lozano, P., Fernandez de la Mora, J. Electrospray ionization of volatiles in breath. Int. J. Mass Spectrom. 265 (1), 68-72 (2007).
- Zeng, Q., et al. Detection of creatinine in exhaled breath of humans with chronic kidney disease by extractive electrospray ionization mass spectrometry. J. Breath Res. 10 (1), 016008-016015 (2016).
- Chen, H. W., Wortmann, A., Zhang, W. H., Zenobi, R. Rapid in vivo fingerprinting of nonvolatile compounds in breath by extractive electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 46 (4), 580-583 (2007).
- Benoi, F. M., Davldson, W. R., Lovett, A. M., Nacson, S., Ngo, A. Breath analysis by atmospheric pressure ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 55 (4), 805-807 (1983).
- Bregy, L., Martínez-Lozano Sinues, P., Nudnova, M. M., Zenobi, R. Real-time breath analysis with active capillary plasma ionization-ambient mass spectrometry. J. Breath Res. 8 (2), 027102-027110 (2014).
- Gaugg, M. T., et al. Expanding metabolite coverage of real-time breath analysis by coupling a universal secondary electrospray ionization source and high resolution mass spectrometry-a pilot study on tobacco smokers. J. Breath Res. 10 (1), 016010-016020 (2016).
- Martínez-Lozano, P., Zingaro, L., Finiguerra, A., Cristoni, S. Secondary electrospray ionization-mass spectrometry: breath study on a control group. J. Breath Res. 5 (1), 016002-016012 (2011).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Zenobi, R., Kohler, M. Analysis of the exhalome a diagnostic tool of the future. Chest. 144 (3), 746-749 (2013).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Fernandez de la Mora, J. Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure Ionization-Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (21), 8210-8215 (2008).
- Martínez-Lozano Sinues, P., et al. Breath analysis in real time by mass spectrometry in chronic obstructive pulmonary disease. Respiration. 87 (4), 301-310 (2014).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Kohler, M., Zenobi, R. Monitoring diurnal changes in exhaled human breath. Anal. Chem. 85 (1), 369-373 (2013).
- Chen, H. W., Zenobi, R. Neutral desorption sampling of biological surfaces for rapid chemical characterization by extractive electropray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 3 (9), 1467-1475 (2008).
- Li, X., Hu, B., Ding, J., Chen, H. W. Rapid characterization of complex viscous samples at molecular levels by neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 7 (6), 1010-1025 (2011).
- Gordon, S. M., Szidon, J. P., Krotoszynski, B. K., Gibbons, R. D., O'Neill, H. J. Volatile organic compounds in exhaled air from patients with lung cancer. Clin. Chem. 31 (8), 1278-1282 (1985).
- Ding, J. H., et al. Development of extractive electrospray ionization ion trap mass spectrometry in vivo breath analysis. Analyst. 134 (10), 2040-2050 (2009).
- Basum, G., Dahnke, H., Halmer, D., Hering, P., Mürtz, M. Online recording of ethane trances in human breath via infrared laser spectroscopy. J. Appl. Physiol. 95 (6), 2583-2590 (2003).
- Tøien, Ø Automated open flow respirometry in continuous and long-term measurements: design and principles. J. Appl. Physiol. 114 (8), 1094-1107 (2013).
- Huang, L., Li, X., Xu, M., Huang, Z. X., Zhou, Z. Identification of relatively high molecular weight compounds in human breath using secondary nano electrospray ionization ultrahigh resolution mass spectrometry. Chem. J. Chinese U. 38 (5), 752-757 (2017).
