Summary
Протокол для характеризующие химический состав выдыхаемого воздуха в режиме реального времени с помощью вторичных nanoelectrospray ионизации в сочетании с высоким разрешением, которую продемонстрировал масс-спектрометрии.
Abstract
Выдохнул летучих органических соединений (Лос) вызвали значительный интерес, поскольку они могут служить биомаркеров для диагностики заболеваний и воздействия на окружающую среду в неинвазивным способом. В этой работе мы представляем протокол характеризовать выдыхаемого Лос в режиме реального времени с помощью вторичных nanoelectrospray ионизации, в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения (Sec-nanoESI-HRMS). Домашний сек nanoESI источник легко создан основанный на источник коммерческих nanoESI. Сотни пики были замечены в фон вычитается массового спектры выдыхаемого воздуха, и массовые точность значения -4.0-13,5 промилле и-20.3-1.3 ppm в режимах обнаружения положительных и отрицательных ионов, соответственно. Пики были назначены с точной компоновки согласно Точная масса и изотопные шаблон. Менее 30 s используется для измерения один выдох, и она занимает около 7 мин для шести реплицированной измерений.
Introduction
С быстрым развитием современных аналитических методов сотни летучих органических соединений (Лос) были определены в человека выдыхаемого воздуха1. Эти Лос главным образом результатом альвеолярного воздуха (~ 350 мл для здорового взрослого) и анатомические Мертвое пространство воздуха (~ 150 мл)2, которые страдают от тела метаболизм3,4,5,6,7 ,8 и9загрязнения окружающей среды, соответственно. В результате если определены, эти Лос перспективным для использования в качестве биомаркеров для диагностики заболеваний и воздействия на окружающую среду в неинвазивным способом.
Хотя газовой хроматографии с масс-спектрометрии (ГХ-МС) является наиболее широко используемым методом для качественного и количественного анализа выдыхаемого Лос2, прямые методы в MS, которые были разработаны для анализа в реальном времени дыхание, имеют преимущества Настало время резолюции и простой пример предварительной подготовке. Прямые MS методы, такие как Протон передачи реакции10мс (PTR-МС) выбран шланг потока ионов мс (SIFT-МС)11, электроспрей вторичной ионизации мс (СЕСИ-МС)12,13 (также названный как добывающих электроспрей ионизации MS, EESI MS14,15), трассировки атмосферного газа анализатор (TAGA)16 и плазмы ионизации мс (Пи-МС)17 были расследованы в последние годы.
Среди всех прямых методов MS СЕСИ хорошо известен как универсальная мягкая ионизация техника19,20,21; и источник легко настроить и в сочетании с различными типами масс-спектрометры, например, время полета масс-спектрометр8,15, ионная ловушка Масса спектрометра14 и Орбитрэп масс-спектрометр12 ,18. До сих пор, СЕСИ-МС успешно используется в диагностике22респираторных заболеваний замер Циркадный ритм3,6,23, фармакокинетики7,8, и выявление метаболических4и т.д. Совсем недавно коммерческий источник СЕСИ стала доступна.
В этом исследовании источник ионизации легким и компактным вторичных nanoelectrospray (Sec-nanoESI) была создана и в сочетании с высоким разрешением масс-спектрометр. Были представлены в реальном времени измерения выдыхаемого Лос в дыхании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Предупреждение: Обратитесь все соответствующие листы данных безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Пожалуйста, используйте надлежащие средства личной защиты, например, лаборатории пальто, перчатки, защитные очки, полная длина брюки и закрыты носок обуви).
1. Настройте источник Sec-nanoESI
- Настройка источника сек nanoESI соответствии с СЕСИ процессом, т.е., дыхание газ вводится пересекаются электроспрей шлейфа и ионизированной заряженных капель (рис. 1). Источники, построен в отдельных лабораториях зависит от интерфейса масс-спектрометр используется24,25. Здесь, настроить источник Sec-nanoESI, основанный на источнике коммерческих nanoESI (рис. 2) и осуществить benchtop квадрупольного Орбитрэп масс-спектрометр.
Примечание: Основной источник представляет собой кубических камеру из нержавеющей стали (длиной 25 мм, и.д. 13 мм) (рис. 2b) с входом (и.д. 4 мм) представить nanoESI капилляров в камеру. Таким образом, Камера не является полностью закрыт (рис. 2b). - Установите две трубы из нержавеющей стали (длиной 8 мм, диаметр 5 мм, и.д. 3 мм) на каждой стороне камеры для поставки газа.
- Оборудуйте два кварцевые окна (и.д. 14 мм) на верхней и нижней палаты проверить положение кончика nanoESI капилляров и nanoESI спрей глаза или цифровой микроскоп.
- Сварного шва к камере конус развертки масс-спектрометр.
Примечание: Дизайн может измениться в зависимости от конкретного геометрии интерфейса атмосферное давление масс-спектрометр используется в отдельных лабораториях.
2. инструмент оптимизации
- Калибровка масс-спектрометр в обоих режимах обнаружения положительных и отрицательных ионов, в соответствии с инструкциями производителя. Применяя калибровки, масс-спектрометр параметры, такие как объектив потенциалов и выявление условий, оптимизированы для дать хорошую чувствительность и пик формы в значение указанной резолюции. Здесь используется массового урегулирования 70000.
- Выполнить полный Q Exactive калибровка с помощью коммерческого источника еси; Однако массовые калибровки может выполняться с любых совместимых источников, включая пользовательские.
- Установите температуру Ион подводящего патрубка (ITT) масс-спектрометр > 100 ° c. Хотя высокая температура может быть установлен в 350 ° C, это может привести к разложения некоторых соединений. Таким образом 150° C используется в этом эксперименте.
Примечание: Для масс-спектрометров с отверстием выборки вместо ITT, температура отверстия выборки устанавливается > 100 ° C. - Для скорости потока и растворителей ESI выберите соответствующий ESI растворитель на основе свойств растворителя (например, полярности и волатильность) и целевых соединений (например, протонного сродства). Смесь воды и метанола в различных соотношениях широко используется в качестве растворителя ESI25. В этом эксперименте, используйте воду содержащие 0,1% (v/v) муравьиной кислоты, для высокой ионизации эффективность была сообщили этого растворителя13,19,23. Установите скорость потока ESI растворителя в диапазоне 0-1,5 мкл/мин и 200 nL/мин.
Примечание: Дега ESI растворителя на 30 минут перед использованием. - Оптимизируйте параметры источника сек nanoESI, главным образом nanoESI напряжения и nanoESI капиллярной кончик позиции. Напряжение обычно составляет от 2.0 до 4,5 кв. Здесь использование 2,5 кв.
Примечание: Выше напряжение ESI применяется как увеличивает скорость потока. Расстояние между кончиком и масс-спектрометр отверстия может регулироваться от 1 до 5 мм. После оптимизации, нормализованных интенсивности уровень (NL) наблюдается в массовых спектр должно быть > 1 х 106 и вариант общего ионного Хроматограмма (TIC) должно быть < 10% в обоих режимах обнаружения положительных и отрицательных ионов. В область диапазона массы m/z 50-750 получены массовые спектр и ТИЦ. - Применение чистого газа к источнику. Это необязательный шаг, направленный на уменьшение влияния выбросов ЛОС из воздуха в помещениях. Азот высокой чистоты (N2, 99,99%) или чистый воздух может быть использован. С наличием чистого газа, NL, наблюдается в массовых спектр должно быть > 1 х 105 и вариации TIC должно быть < 10% в обоих режимах обнаружения положительных и отрицательных ионов. Высокая чистота N2 используется здесь и доставлены в 0,8 Л/мин.
Примечание: Общий расход дыхание и чистого газа должна быть выше, чем скорость потока через отверстие масс-спектрометр.
3. Измерение выдыхаемого воздуха
- Вдохните воздух в помещениях и выполнить нормальный выдох выдохнуть воздух в легких при постоянной скорости потока. Контролировать скорость потока выдоха манометр или видимым предметом расходомер. Для доставки газа дыхание23используйте трубы тефлоновые (ПТФЭ).
- Для предотвращения конденсации паров воды внутри трубы, тепло труб при температуре 80-100 oC7,,2327 или использовать Nafion сушилка28,29. В этом эксперименте предметом выдохнул в контролируемом расходомер 0.4 Л/мин.
- Подключите входе расходомер для Nafion труб (длина 60 см) для удаления водяного пара в выдыхаемого воздуха и подключите выход расходомера к PTFE Шланги (длина 13 см, и.д. 4 мм). Он принимает < 30 s для одного выдоха измерения.
- Выполните 4-6 реплицированных измерения28,29.
- Чтобы свести к минимуму смешанные эффекты, у участников от еды, питья и чистить их зубы по крайней мере 30 минут до измерения23.
Примечание: Чтобы свести к минимуму влияние Лос из воздуха в помещениях, сообщалось вдыхать чистый газ вместо воздуха26. Когда используется Nafion труб, некоторые полярных соединений могут быть потеряны. - Во время измерения следите если Ион интенсивности превышает предел линейной обнаружения документа или нет. Насыщение сигнала может привести к пик артефакт, который практически не результатом соединения в образце. При вдыхании через нос, частью окружающего Лос и частиц будут удалены; Однако стоит отметить, что соединений в носовые ходы, также могут быть обнаружены.
4. получите дыхание отпечатков пальцев и трассировку время соединения
- Получение хроматограммы и массовых спектров. Используйте программное обеспечение (например, Xcalibur) для записи хроматограммы и массовых спектров. Потому что это прямой анализ MS и хроматографического разделения не выполняется, Общая Ион Хроматограмма (TIC) фактически указывает время след всех сигналов, обнаружены в массовых спектры и извлечения ионов Хроматограмма (EIC) показывает время след указанное соединение.
Примечание: Для других коммерческих масс-спектрометры, хроматограммы и массовых спектров можно получить путем соответствующего программного обеспечения сбора данных. - Получения отпечатков пальцев выдыхаемого воздуха, выбрав количество сканов в ТИЦ, когда выдыхаемого воздуха измеряется. Получения массового спектра, представляющих в среднем эти сканы программного обеспечения.
- Чтобы исключить фон пики от отпечатков пальцев дыхание, используйте средство вычитание фона в программном обеспечении. Пожалуйста, обратитесь к руководству пользователя, предоставляемых производителем. Вкратце выберите такое же количество сканов, когда вводится не образца дыхание и вычитание фона массовых спектр от отпечатков пальцев дыхание.
Примечание: В этом методе, порог для выявления особенностей в отпечатков пальцев дыхание определяется как три раза стандартное отклонение фонового сигнала. Для других коммерческих масс-спектрометры вычитание фона может осуществляться соответствующее программное обеспечение получения данных.
- Чтобы исключить фон пики от отпечатков пальцев дыхание, используйте средство вычитание фона в программном обеспечении. Пожалуйста, обратитесь к руководству пользователя, предоставляемых производителем. Вкратце выберите такое же количество сканов, когда вводится не образца дыхание и вычитание фона массовых спектр от отпечатков пальцев дыхание.
- Получите время трассировки указанного соединения. Выберите пик целенаправленного комплекса в дыхание отпечатков пальцев, и след время соединения впоследствии приобретена программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 3 показывает отпечатки пальцев дыхание в область диапазона массы m/z 50-750, записанная в обоих режимах обнаружения положительных и отрицательных ионов. 291 пиков (пика интенсивности > 5.0x104) и 173 пиков (пика интенсивности > 3.0x104) наблюдались в фон вычитается дыхание отпечатки пальцев в режимах обнаружения положительных и отрицательных ионов, соответственно. Для определения пиков в массовых спектры, обратитесь к предварительной публикации для деталей12,18,24,29. Короче говоря были обнаружены летучих метаболиты и Лос из воздуха в помещениях. Например пик на m/z 74.0606 (рис. 3a) приводит к от выдыхаемого N, N-Диметилформамид или aminoactone по словам человека метаболом базы данных (HMDB); вершины на m/z 462.1447 и m/z 536.1638 (рис. 3a) – от аддукты выдыхаемого аммиака и полисилоксанов (Лаборатория загрязнений)12. Типичный массового точность значения в режимах обнаружения положительных и отрицательных ионов, -4.0-13,5 промилле и-20.3-1.3 млн., соответственно. Рисунок 4 представляет время след индола, типичный эндогенным соединением, который распознаётся шесть реплицированных измерения выдыхаемого из одного предмета. Для всех шести измерениям меньше чем 7 минут.
Рис. 1. Схема для анализа СЕСИ-MS Лос выдыхаемого воздуха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. (схема и (b) Фото сек nanoESI источник, используемый в этом эксперименте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рис. 3. Фон вычитается дыхание отпечатки полученные в положительные () и (b) режимы обнаружения отрицательных ионов в область диапазона массы m/z 50-750. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Время след индола, обнаружены шесть реплицированных измерения выдыхаемого из одного предмета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Строительство Sec-nanoESI источник, основанный на источнике коммерческой nanoESI, эффективность ионизации выше, чем с помощью еси источник30. Кроме того, эффективность ионизации дальнейшего повышения в закрытой камере, как это изолирует процесс от окружающего фона воздуха и в то же время облегчает смешивания между пробы газа и спрей шлейфа. С помощью сек nanoESI, меньше параметров должны быть оптимизированы по сравнению с источником ESI, что делает его легче для монтажа, применения и обслуживания.
Если сигнал не наблюдается или чувствительность значительно уменьшается при выполнении анализа дыхание от сек nanoESI-MS, один должен проверить положение кончика капиллярной спрей, а также образование капель на кончике капилляра. Совместите наконечник с отверстием масс-спектрометр. Измените капиллярные спрей на новый, если спрей капиллярные заблокирован или загрязненных кончика. В противном случае проверьте, блокирован ли загрязненных ITT инструмента. Замените или очистите ITT при необходимости. Отключение напряжения ESI перед проверкой спрей капилляров. Установите температуру ITT при комнатной температуре и подождать до тех пор, пока температура падает.
СЕСИ-HRMS была продемонстрирована в чувствительных и выборочного метода для реального времени дыхание анализа4,6,12. В последние несколько лет этот метод успешно применен к замер суточного вариация3,6, мониторинга фармакокинетики7,8, выявления метаболических5, и т.д. . В последнее время аминокислоты в человека дыхание успешно определены путем СЕСИ-MS для в первый раз, что это замечательный прогресс в количественный анализ5. С дальнейшего расследования СЕСИ-HRMS может утвердиться в качестве полезной и эффективной неинвазивный метод клинических.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была финансово поддержана Национальный фонд естественных наук Китая (№ 91543117).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultrapure water | Merck Millipore, USA | MPGP04001 | Resistance >18.2 MΩ·cm |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, USA | F0507 | Corrosive to the respiratory tract. |
| Nitrogen gas | Guangzhou Shiyuan Gas Co. Ltd., China | N.A.a | Purity >99.99% |
| Q Exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific, USA | 02634L(S/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| NanoESI source | Thermo Scientific, USA | ES002373(S/N); ES071(P/N) | Beware of high voltage and high temperature |
| Nano LC pump | Thermo Scientific, USA | 5041.0010A(P/N) | / |
| Xcalibur software (Version 3.0) | Thermo Scientific, USA | BRE0008596 | / |
| Dino-Lite Digital Microscope | Tech Video System (SuZhou) Co.Ltd., China | CQ401833R(S/N) | / |
| Nafion tubing | Perma Pure LLC, USA | ME60 | / |
| PTFE tubing (I.D. 4 mm) | Dongguan Hongfu Insulating Material Co. Ltd., China | N.A. | Beware of the possible loss of polar compounds |
| Mass flow controller | Line-Tech, Korea | M15122007 (S/N) | / |
| Flow meter | Yuyao Industrial Automation Meter Factory, China | 40784 | / |
| aN.A.: not available. |
References
- De Lacy Costello, B., et al. A review of the volatiles from the healthy human body. J. Breath Res. 8 (1), 014001-014030 (2014).
- Phillips, M., Greenberg, J. Ion-trap detection of volatile organic compounds in alveolar breath. Clin. Chem. 38 (1), 60-65 (1992).
- Martínez-Lozano Sinues, P., et al. Circadian variation of the human metabolome captured by real-time breath analysis. PLoS One. 9 (12), 0114422-0114438 (2014).
- Garcia-Gomez, D., et al. Secondary electrospray ionization coupled to high-resolution mass spectrometry reveals tryptophan pathway metabolites in exhaled human breath. Chem. Common. 52 (55), 8526-8528 (2016).
- Garcia-Gomez, D., et al. Real-time quantification of amino acids in the exhalome by secondary electrospray ionization-mass spectrometry: A proof-of-principle Study. Clin. Chem. 62 (9), 1230-1237 (2016).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Kohler, M., Brown, S. A., Zenobia, R., Dallmann, R. Gauging circadian variation in ketamine metabolism by real-time breath analysis. Chem. Common. 53 (14), 2264-2267 (2017).
- Gamez, G., et al. Real-time, in vivo monitoring and pharmacokinetics of valproic acid via a novel biomarker in exhaled breath. Chem. Common. 47 (17), 4884-4886 (2011).
- Li, X., et al. Drug pharmacokinetics determined by real-time analysis of mouse breath. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (27), 7815-7818 (2015).
- Amorim, L. L. A., Cardeal, Z. L. Breath air analysis and its use as a biomarker in biological monitoring of occupational and environmental exposure to chemical agents. J. Chromatogr. B. 853 (1-2), 1-9 (2007).
- Bajtarevic, A., et al. Noninvasive detection of lung cancer by analysis of exhaled breath. BMC Cancer. 9, 348 (2009).
- Smith, D., Wang, T. S., Pysanenko, A., Španěl, P. A selected ion flow tube mass spectrometry study of ammonia in mouth- and nose-exhaled breath and in the oral cavity. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22 (6), 783-789 (2008).
- Li, X., Huang, L., Zhu, H., Zhou, Z. Direct human breath analysis by secondary nano-electrospray ionization ultrahigh resolution mass spectrometry: Importance of high mass resolution and mass accuracy. Rapid Commun. Mass Spectrom. 31 (3), 301-308 (2017).
- Martínez-Lozano, P., Fernandez de la Mora, J. Electrospray ionization of volatiles in breath. Int. J. Mass Spectrom. 265 (1), 68-72 (2007).
- Zeng, Q., et al. Detection of creatinine in exhaled breath of humans with chronic kidney disease by extractive electrospray ionization mass spectrometry. J. Breath Res. 10 (1), 016008-016015 (2016).
- Chen, H. W., Wortmann, A., Zhang, W. H., Zenobi, R. Rapid in vivo fingerprinting of nonvolatile compounds in breath by extractive electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 46 (4), 580-583 (2007).
- Benoi, F. M., Davldson, W. R., Lovett, A. M., Nacson, S., Ngo, A. Breath analysis by atmospheric pressure ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 55 (4), 805-807 (1983).
- Bregy, L., Martínez-Lozano Sinues, P., Nudnova, M. M., Zenobi, R. Real-time breath analysis with active capillary plasma ionization-ambient mass spectrometry. J. Breath Res. 8 (2), 027102-027110 (2014).
- Gaugg, M. T., et al. Expanding metabolite coverage of real-time breath analysis by coupling a universal secondary electrospray ionization source and high resolution mass spectrometry-a pilot study on tobacco smokers. J. Breath Res. 10 (1), 016010-016020 (2016).
- Martínez-Lozano, P., Zingaro, L., Finiguerra, A., Cristoni, S. Secondary electrospray ionization-mass spectrometry: breath study on a control group. J. Breath Res. 5 (1), 016002-016012 (2011).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Zenobi, R., Kohler, M. Analysis of the exhalome a diagnostic tool of the future. Chest. 144 (3), 746-749 (2013).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Fernandez de la Mora, J. Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure Ionization-Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (21), 8210-8215 (2008).
- Martínez-Lozano Sinues, P., et al. Breath analysis in real time by mass spectrometry in chronic obstructive pulmonary disease. Respiration. 87 (4), 301-310 (2014).
- Martínez-Lozano Sinues, P., Kohler, M., Zenobi, R. Monitoring diurnal changes in exhaled human breath. Anal. Chem. 85 (1), 369-373 (2013).
- Chen, H. W., Zenobi, R. Neutral desorption sampling of biological surfaces for rapid chemical characterization by extractive electropray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 3 (9), 1467-1475 (2008).
- Li, X., Hu, B., Ding, J., Chen, H. W. Rapid characterization of complex viscous samples at molecular levels by neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 7 (6), 1010-1025 (2011).
- Gordon, S. M., Szidon, J. P., Krotoszynski, B. K., Gibbons, R. D., O'Neill, H. J. Volatile organic compounds in exhaled air from patients with lung cancer. Clin. Chem. 31 (8), 1278-1282 (1985).
- Ding, J. H., et al. Development of extractive electrospray ionization ion trap mass spectrometry in vivo breath analysis. Analyst. 134 (10), 2040-2050 (2009).
- Basum, G., Dahnke, H., Halmer, D., Hering, P., Mürtz, M. Online recording of ethane trances in human breath via infrared laser spectroscopy. J. Appl. Physiol. 95 (6), 2583-2590 (2003).
- Tøien, Ø Automated open flow respirometry in continuous and long-term measurements: design and principles. J. Appl. Physiol. 114 (8), 1094-1107 (2013).
- Huang, L., Li, X., Xu, M., Huang, Z. X., Zhou, Z. Identification of relatively high molecular weight compounds in human breath using secondary nano electrospray ionization ultrahigh resolution mass spectrometry. Chem. J. Chinese U. 38 (5), 752-757 (2017).
