Summary
En ny protokoll for utarbeidelsen av chromatin fra voksen mus Skjelettmuskel tilpasset å studere genet regulering i muskelfibre av chromatin immunoprecipitation presenteres.
Abstract
Vi beskriver en effektiv og reproduserbar protokoll forberedelse til chromatin fra voksen mus skjelettmuskulatur, en fysisk motstandsdyktig vev med høyt innhold av strukturelle proteiner. Dissekert lem muskler fra voksen mus avbrutt fysisk av mekanisk homogenisering eller en kombinasjon av hakking og douncing, i en hypotonisk buffer før formaldehyd fiksering av cellen lysate. Fast kjerner blir renset ved ytterligere sykluser av mekanisk homogenisering eller douncing og sekvensiell filtrations fjerne celle rusk. Renset kjerner kan være sonicated umiddelbart eller senere etter frysing. Chromatin kan være effektivt sonicated og er egnet for chromatin immunoprecipitation eksperimenter, som illustrert ved profilene oppnådd for transkripsjonsfaktorer, RNA polymerase II og kovalente histone modifikasjoner. Bindende hendelsene oppdaget bruker chromatin utarbeidet av denne protokollen er hovedsakelig de skjer i muskel fiber kjerner til tross for tilstedeværelsen av chromatin fra andre fiber-assosiert satellitt og endotelceller. Denne protokollen er derfor tilpasset å studere genet regulering i voksen mus skjelettmuskelen.
Introduction
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) koblet til kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) og høy gjennomstrømning sekvensering (ChIP-seq) har blitt metodene ønsker å studere transkripsjon og epigenetic regulering av genuttrykk i ulike vev og celletyper1. Denne teknikken tillater genomet hele profilering av kovalente chromatin modifikasjoner, histone variant innkvartering og transkripsjon faktor bindende2,3.
Mens utføre ChIP fra kulturperler celler er godt etablert, fortsatt ChIP fra pattedyr vev mer utfordrende. Forbereder chromatin ChIP innebærer flere kritiske trinn som må optimaliseres for alle vev og celle type. Chromatin kan tilberedes fra mobilnettet lysates kulturperler celler eller følgende rensing av sine atomkjerner. I pattedyr vev er effektiv lysis formaldehyd fiksering og rensing av kjerner avgjørende for å sikre optimal utvinning av chromatin. Videre har et valg om å fastsette kjerner før eller etter rensing bestemmes eksperimentelt. Til tross for disse hindrene, har ChIP blitt vellykket utført fra vev som leveren, testikkel eller hjernen4,5,6. Skjelettmuskel er avbrudd i slike en fysisk motstandsdyktig vev, som har et høyt innhold av strukturelle proteiner og isolasjon av sin kjerner spesielt utfordrende. Gitt denne spesifisitet, gir protokoller optimalisert for andre vev ikke tilfredsstillende resultater for skjelettmuskulatur.
Her beskriver vi en protokoll for å isolere ChIP-klasse chromatin fra musen skjelettlidelser muskelvev som innebærer fysisk forstyrre vevet, formaldehyd fiksering og isolasjon av kjerner og sonication. Effektiviteten av denne metoden å forberede chromatin egnet for ChIP fra dette vevet ble demonstrert av utføre ChIP-qPCR og ChIP-seq for ulike transkripsjonsfaktorer, RNA polymerase II og kovalente histone modifikasjoner7.
Denne nye teknikken er mye raskere enn tidligere rapportert protokoll8 består av lange collagenase fordøyelsen trinn der tiden, endringer i genomisk lokalisering av transkripsjonsfaktorer endringer i genuttrykk kan skje. Hurtighet som kjerner er isolert og fast gjør metoden beskrevet her spesielt attraktivt å forberede chromatin som fanger mer trofast innfødt genomisk bruk staten. Videre, selv om andre metoder for chromatin isolasjon eller protein utvinning fra muskelvev har blitt beskrevet8,9,10 og brukes for ChIP-qPCR eksperimenter på valgte gener, ingen ChIP-seq dataene har blitt rapportert med dem. Metoden rapporterte her er egnet for transkripsjon faktor og histone endring ChIP-seq, og dermed bør være også egnet for 3 / 4C eller HiC chromatin konformasjon fange programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
mus ble holdt i henhold til institusjonelle veiledning om omsorg og bruk av forsøksdyr og nasjonale dyr omsorg retningslinjer (Europakommisjonen direktiv 86/609/CEE; Fransk dekret no.87-848). Alle prosedyrer ble godkjent av den franske nasjonale etikk.
1. isolering av muskelvev
- offer en voksen 6 til 8-uke-gamle musen av cervical forvridning. Sterlise lem av skylle den med 70% etanol og dissekere hind lem muskler (Gastrocnemius, Tibialis Anterior, Quadriceps) med fin spiss saks og tang.
Merk: En mus skal gi rundt 500 mg av vev. - Hakke musklene i en 2 mL reagensglasset som inneholder 1 mL av iskalde hypotonisk buffer til en homogen forberedelse av små (< 2-3 mm 3) ved hjelp av fine saksen og la røret rister på en benk toppen agitator ved 4 ° C i 5-10 min.
2. Vev Lysis
Merk: se Tabell 1 for alle buffer komposisjoner.
- Overføring av homogenate slik 14 mL runde bunn og resuspend i 5 mL kaldt hypotonisk buffer (EDTA-fri protease hemmer cocktail og PMSF).
- Homogenise hakket muskelvev bruker en løs dounce (20-30 slag i løpet av 3 minutter) eller en mekanisk vev homogenizer for 15-30 s i runde bunn 14 mL rør.
Merk: Effektiviteten av lysis kan vurderes på dette stadiet av * lys og eventuelt flere avbrudd kan utføres.
- Homogenise hakket muskelvev bruker en løs dounce (20-30 slag i løpet av 3 minutter) eller en mekanisk vev homogenizer for 15-30 s i runde bunn 14 mL rør.
- Overføring av homogenate til 15 mL rør og fylle volum til 10 mL bruker kaldt hypotonisk buffer. Fastsette homogenate som beskrevet nedenfor, før du fortsetter med neste musen.
3. Fiksering
- legge formaldehyd til 1% siste konsentrasjon og riste på 10 min ved romtemperatur.
- Legge til glysin en siste konsentrasjon av 0.125 M i hver tube å stoppe fiksering og riste for 5-10 min ved romtemperatur.
4. Kjerner forberedelse
Merk: se Tabell 1 for alle buffer komposisjoner.
- Homogenise det faste lysate benytter en løs dounce (5-10 slag).
- Overføring til en 15 mL rør og sentrifuge 1000 x g for 5 min på 4 ° C kjerner og mobilnettet rusk.
- Fjerne nedbryting og resuspend pellet frisk 5 mL hypotonisk buffer. Filtrere den lysate gjennom en 70 µm celle sil i en 50 mL tube. Å filtrere filtratet gjennom en 40 µm celle sil.
- Overføre filtratet 15 mL tube og sentrifuger 1000 x g i 5 minutter ved 4 ° C å få den kjernefysiske pellet.
Merk: På dette stadiet, kjerner kan være umiddelbart sonicated eller fest frosset som en tørr pellet i flytende nitrogen og lagret på-80 ° C.
5. Sonication
- vurdere volumet av den kjernefysiske pellet (rundt 50 µL for både mekanisk og dounce homogenisering) og resuspend det i sonication buffer til 3 til 4 ganger pakket kjernefysiske volum og sonicate for 10-15 minutter til 4 ° C ved hjelp av en sonicator .
Merk: Chromatin kan analyseres umiddelbart som beskrives nedenfor (6) eller frosset og lagret på-80 ° C.
6. Vurdere Chromatin Fragment størrelsen etter Sonication
Merk: se Tabell 1 for alle buffer komposisjoner.
- å de-krysskobling, ta 30 µL av chromatin i et reagensrør 1,5 mL og legge 20 µL 5 M NaCl. Fullføre volumet til 500 µL og ruge på 65 ° C over natten.
- Neste dag, utføre en behandling med 1 µL proteinasen K (20 mg/mL lager), 10 µL 2 M Tris pH 6.8 og 10 µL av 0,5 M EDTA 1t på 42 ° C. utføre en fenol-kloroform/kloroform utvinning og utløse DNA med 1 volum av natrium acetat e (3 M) og 2 volum av 100% etanol en h ved-80 ° C eller over natten på -20 ° C.
- Pellets DNA med sentrifugering 13.500 x g i 15 min. Decant nedbryting og vaske pellet grundig med kaldt 70% etanol og sentrifuger igjen for 5 min. Decant nedbryting og air-dry pellet.
- Resuspend pellet i opprinnelige volumet (30 µL) av TE buffer. Måle DNA konsentrasjonen i et spektrofotometer ved absorbans ved 260 nm/280 nm. Pipetter 500-1000 ng DNA sammen med en DNA størrelse stige på separate felt av en 1,5% agarose gel og utføre geleelektroforese å vurdere fragment størrelsen på chromatin.
Merk: Fragment vµre mellom 200-500 base parene, og det skal ingen synlig molekylvekt fragmenter svarer til ikke - eller dårlig-fragmentert DNA. Eventuelt chromatin løsningen (trinn 5) kan re sonicated i lengre tid og deretter nytt analysert slik til optimal størrelsen oppnås.
7. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
Merk: se Tabell 1 for alle buffer komposisjoner.
- Blokk Protein-G sepharose perler av aliquoting 1 mL av 50% gjødsel i etanol. Pellet perler med sentrifugering 400 x g i 1 min i en Borstemmaskin sentrifuge og vask med 1 mL av TE buffer sentrifuge 400 x g og gjenta Wash
- Etter den andre sentrifugering, å suspendere i 1 mL av ChIP fortynning buffer med 25 µL av BSA (lager 20 mg/mL) og 20 µL gjær tRNA (lager 10 mg/mL). Blokkere perler for minst 2 h før bruk av rotasjon (40-60 rpm) på 4 ° C.
- Fortynne 50 µg av chromatin (trinn 5) 8 til 10 ganger bruker ChIP fortynning buffer. Legge til 50 µL av blokkerte perle slurry og ruge for 2t roterende (40-60 rpm) på 4 ° C. sentrifuge 400 x g på 4 ° C få pre-ryddet chromatin og overføre den til en frisk tube.
- Immunoprecipitation, legge til riktig mengde primære antistoff (f.eks, 1-2 µg per 10 µg av chromatin) og ruge over natten med rotasjon på 4 ° C.
Merk: Den optimale mengden av antistoff være anbefalt av leverandøren eller empirisk kan bestemmes ved å utføre ChIP-qPCR med ulike mengder av antistoffer til optimal berikelse er observert. Også Protein-G sepharose kan erstattes av Protein A sepharose avhengig av undertypen antistoff brukes. - Legge til blokkerte perlene neste dag og ruge 1t med rotasjon (40-60 rpm) på 4 ° C. sentrifuge 400 x g for 20-30 s pellets perler, fjerne nedbryting og starte ChIP vasker.
- ChIP vasker: utføre de følgende vasker med bufferne: gang med lav Salt Buffer, og deretter to ganger med høyt Salt Buffer, to ganger med LiCl Buffer, og til slutt to ganger med TE Buffer.
- Utføre hver vask for 10 min med rotasjon (40-60 rpm) på 4 ° C og pellets perlene mellom hver vask med sentrifugering 400 x g for 20-30 s i en benk toppen sentrifuge.
- For eluering vil fjerne siste vask og resuspend perlene i 250 µL elueringsbufferen (nylagde) i 15 min ved romtemperatur mens risting.
- Sentrifuge på 400 x g og samle eluate i en fersk rør. Utføre dette trinnet to ganger og deretter de-krysskobling eluate over natten med 20 µL NaCl 5 M og 1 µL RNase A (10 mg/mL), behandle med proteinasen K, og fenol-kloroform/kloroform ehandle i trinn 6.
- Resuspend i 50 µL TE bufferen og bruk dele for ChIP-qPCR som standard protokoller 15 for å sjekke kvaliteten på ChIP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å isolere kjerner, utført vi mekanisk homogenisering dissekert og hakket muskelvev for 15 eller 45 s, 18 000 og 22 000 RPM (se Tabell for materiale). I alle forhold, kjerner kan skilles fra vev rusk, men avkastningen var optimal med lavere hastighet (figur 1A-B). Kjerner kan også være utarbeidet av douncing for 3-5 minutter (figur 1Aog data ikke vist), men mekanisk homogenisering er metoden for valg, som optimal avkastning av kjerner kan oppnås i så lite som 15 s, slik at en viktig gevinst tid spesielt hvis flere eksempler må være behandlet (figur 1B). Bruke denne protokollen, opp til 2.7 x 10 kan7 kjerner fra 500 mg av vev (tilsvarer 1 mouse vev) være isolert å generere 100 µg av chromatin.
For å optimalisere chromatin fragmentering fra fast kjerner, sonicated vi i 5 til 20 min. Under innstillinger (se Tabell for materiale), en 10 min sonication var optimal generere chromatin med en gjennomsnittlig fragment størrelse 250 bp (figur 2). Dette trinnet skal optimaliseres eksperimentelt tar hensyn til typen sonicator brukes.
For å vurdere kvaliteten på muskel chromatin utarbeidet av protokollen beskrevet ovenfor, ble ChIP-qPCR og ChIP-seq eksperimenter utført mot transkripsjonsfaktorer, histone modifisering eller RNA polymerase II (Pol II). ChIP-qPCR mot glukokortikoid reseptoren (GR) i tilstedeværelse eller fravær av dexamethasone (Dex) behandling avslørt sterk Dex-avhengige GR berikelse på regulatoriske elementer av Redd1 og Murf1 gener som er kjent for å være Dex og GR regulert i muskelfibre11, mens noe signal ble sett på testikkel bestemte Prm1 selskapet som en negativ kontroll (figur 3A).
ChIP-qPCR mot acetylated lysin 27 av histone H3 (H3K27ac), en kovalente modifikasjon på aktive enhancers og arrangører, viste sterke berikelse på Desmin (Des) selskapet som er aktiv i muskel fiber, sammenlignet med en negativ intergenisk kontrollen region (figur 3B). H3K27ac ChIP-seq avslørte høy dette merket hele Des locus, typisk for en 'super-enhancer' regulert vev identitet genet12 (figur 4A). Tilsvarende viste Pol II ChIP-seq høye nivåer av transkribere Pol II på denne locus.
ChIP-qPCR for transkripsjon faktor Tead4, som spiller en viktig rolle i myogenic differensiering13,7, avslørte en berikelse på beskrevet tidligere bindende områder på Ccnd1 og Ifrd1 gener ( Figur 3 c). Viktigere, berikelse ble redusert med chromatin forberedt fra mus hvor Tead4 var selektivt deaktivert i muskel fiber (Tead4skm-/-)7 (Figur 3 c). Analyser av ChIP-seq data for både Tead1 og Tead4 viste sin binding til et område i arrangøren av Kdm5a genet bruker chromatin fra vill-type muskel, mens Tead4 signalet, men ikke som Tead1, H3K27ac eller Pol II, ble brutt ved hjelp av chromatin fra musklene i Tead4skm-/- mus (figur 4B). Tilsvarende Tead1 og Tead4 binding til et regulatorisk element nedstrøms av Adssl1 genet er sett med chromatin fra vill-type muskel, mens Tead4 innbindingen var selektivt tapt ved hjelp av chromatin fra Tead4skm-/- muskel () Figur 4C). Disse observasjonene viser at Tead4 signalet ChIP-seq dataene kom fra binding i muskel fiber.
For å finne ut bidrag av andre celletyper forbundet med muskel fiber til ChIP-seq resultatene, vurdert vi H3K27ac og Pol II signaler på Vcam1 genet som er aktiv i muskelceller satellitt og Pecam1, en markør av endotelceller blod fartøy som vanne musklene. Sammenlignet med det høye nivået på Des eller Adssl1 gener, nivået av H3K27ac og Pol II sett på både Vcam1 og Pecam1 gener var mye lavere (figur 4A og figur 4C). Disse store forskjellene i signalet for muskel fiber uttrykt gener sammenlignet med de uttrykt i tilknyttete vev indikerte at signalet sett chip fra chromatin tilberedt med protokollen beskrevet ovenfor kommer hovedsakelig fra bindende hendelser i den muskel fiber.
Figur 1: rensing av kjerner fra voksen musen muskler. (A) vev lysates innhentet av mekanisk homogenisering (18 000 rpm, 45 s) og dounce homogenisering (30 slag/3 min) var farget med trypan blå og observert under en digital mikroskop bilder ble tatt på 20 X forstørrelse. Skala bar = 100 µm. (B) antall kjerner innhentet fra 500 mg av vev (tilsvarer 1 mus) etter forberedelse under de angitte betingelsene, 18 000 og 22 000 rpm for 15 og 45 s eller 3 min av douncing. Feilfelt representerer gjennomsnittlig ± S.E.M. n = 3 mus for mekanisk homogenisering og n = 3 mus for douncing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: bekreftelse av chromatin fragment størrelse. Isolert kjerner ble sonicated etter 5, 10, 15 eller 20 min som angitt. Etter de-crosslinking og rensing, ble DNA fragment størrelsen vurdert av agarose gel geleelektroforese i nærvær av ethidium bromide. M er DNA størrelse markør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bruk av chromatin for ChIP-qPCR. (A) mus ble utsatt for intra peritoneal injeksjoner av kjøretøy eller deksametason (10 mg/kg) og etter 1,5 t, chromatin var forberedt fra hind lem muskler. Berikelse chip på GR målet gener Redd1 og Murf1, sammenlignet med negativ kontroll protamine selskapet (Prm1), angis som en % av input igangsatte. (B) ChIP ble utført for H3K27ac og IgG kontroll-antistoffer og analysert ved Desmin arrangøren og sammenlignet en intergenisk negativ kontroll-regionen. (C) Tead4 ChIP ble utført på muskel chromatin vill type og muskel-spesifikke Tead4 knockout mus (Tead4skm-/-) og analysert på Tead4 binding steder i de Ccnd1 og Ifrd1 arrangørene, sammenlignet med den kontroll intergenisk regionen. Alle eksperimenter, chromatin fra 3 mus var samlet og feilfelt representerer gjennomsnittlig ± S.E.M i en Student T-test for tre tekniske gjentak. P verdien < 0.001* *, < 0,0001 ***; NS, ikke betydning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: genomisk profiler av muskel fiber chromatin. (A) skjermbilder fra University av California i Santa Cruz genomet nettleser for de angitte loci illustrerer mye høyere H3K27ac og Pol II nivåer på Desmin genet, svært uttrykt i muskel fiber, sammenlignet med Vcam1 og Pecam1 gener uttrykt i satellitt celler og endothelial celler, henholdsvis. (B) UCSC skjermbilder av de angitte loci illustrerer binding av Tead1 og Tead4, samt H3K27ac og Pol II, i chromatin fra vill-type (WT) muskel forhold fra Tead4skm-/- (MT) muskler, der selektiv tap av Tead4 binding er observert. ChIP-seq dataene illustrert er tilgjengelig som GSE82193 i GEO-databasen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Buffer navn | Komposisjon | ||
| Hypotonisk buffer | 10 mM HEPES-KOH (pH 7.3) | ||
| 10 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 0,1% NP-40 | |||
| 0,1 mM PMSF (nylig lagt) | |||
| Protease Inhibitor cocktail (PIC) 1 x (nylig lagt) | |||
| Sonication buffer | 1% SDS | ||
| 10 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris-HCl pH 8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 0,1% natrium Deoxycholate | |||
| 1% Triton X-100 | |||
| Nylig lagt 0,1 mM PMSF | |||
| BILDE 1 x | |||
| ChIP fortynning buffer | 0,01% SDS | ||
| 1,1% Triton X-100 | |||
| 1.2 mM EDTA | |||
| 16,7 mM Tris HCl pH8 | |||
| 167 mM NaCl | |||
| Nylig lagt 0,1 mM PMSF | |||
| BILDE 1 x | |||
| Lav Salt buffer | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 150 mM NaCl | |||
| Høy Salt buffer | 0,1% SDS | ||
| 1% Triton X-100 | |||
| 500 mM EDTA | |||
| 20 mM Tris HCl pH8 | |||
| 500 mM NaCl | |||
| LiCl Buffer | 250 mM LiCl | ||
| 1% NP-40 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 10 mM Tris HCl pH 8 | |||
| Elueringsbufferen | 1% SDS | ||
| 100 mM NaHCO3 | |||
| Tris-EDTA (TE) buffer | 50 mM Tris HCl pH 8 | ||
| 1 mM EDTA | |||
Tabell 1: Buffer komposisjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en ny protokoll for å forberede chromatin fra voksen musen muskler og vise at denne chromatin er egnet for ChIP eksperimenter som oppdager transkripsjon faktor bindende og kovalente histone modifikasjoner i muskel fiber kjerner. Denne protokollen innebærer flere kritiske trinn. Først er vev avbrudd som kan utføres enten ved dounce eller mekanisk klipping. Mekanisk shearing er raskere og mer reproduserbare, og er derfor metoden for valg. Hvis ingen passende apparater er tilgjengelig, kan likevel avbrudd, også bli fremført av douncing, der vurdering av effektiviteten av lyse under mikroskopet er anbefalt før du fortsetter til fiksering trinn. Fiksering av hele-vev lysates, i stedet for fiksering av isolerte kjerner, tillot mer reproduserbar sonication i mindre volumer og kort tid av gangen. Vi valgte også å fastsette lysates etter avbrudd i stedet for å fikse vevet før avbrudd, som beskrevet av Thomas et al. 10 pre fikse vevet resultert i redusert effektiviteten av homogenisering. Denne protokollen basert på mekanisk shearing er også raskere enn andre foreslåtte løsninger som collagenase fordøyelsen, som involverer langvarig inkubering av dissekert vev på 37 ° C8. I denne perioden, kan endringer i genet uttrykk og transkripsjon faktor binding forekomme. Fikse kjerner mulig er derfor viktig å fange mer trofast normal fysiologisk tilstand.
Andre kritiske trinnet er rensing av kjerner fra fast lysate. For dette, sekvensielle filtrering av fast lysate løsningen, først gjennom en 70 µm celle sil å eliminere større rusk og deretter gjennom en 40 µm celle sil for å fjerne fine rusk, forhindrer tilstopping av siler og maksimerer avkastningen av kjerner innhentet. Når renset ved filtrering, kjerner er sonicated og DNA fragment størrelsen bestemmes etter de-crosslinking. En typisk forberedelse fra to bakbeina av én mus gir 100 µg av chromatin. Samle lysates fra opptil 3 mus kan forbedre avkastningen ved å redusere tapene under forberedelse. Denne prosedyren er effektiv som gjør det mulig utvinning av opptil 75% av genomisk DNA som chromatin (data ikke vist).
ChIP eksperimenter for å vurdere transkripsjon faktor bindende og epigenetic endringer demonstrert egnetheten av denne protokollen for å studere genet regulering i muskel fiber kjerner. Sterk og robust ChIP-seq signaler Pol II og H3K27ac ble generert fra chromatin, slik at identifikasjon av muskel fiber identitet gener av sine særegne H3K27ac og Pol II profiler7. Mye høyere nivåer av H3K27ac og Pol II på gener sterkt uttrykt i fiber kjerner, sammenlignet med gener i satellitt eller endotelceller, viste at signalet kom hovedsakelig fra fiber kjerner. Dette ble også bekreftet av tapet av Tead4 ChIP signal med chromatin fra mus der det var spesielt deaktiveres i muskelfibre. Likevel er svakere, men tydelig over bakgrunnen signaler, for satellitt celle markører som Vcam1, Pax7 (data ikke vist) kan oppdages viser at chromatin fra disse cellene er også til stede. Vi forventer at våre protokollen bør være egnet for andre teknikker som bruker formaldehyd-fast chromatin som 3 C/4 C og HiC chromatin konformasjon capture teknikker. Bruk av våre protokollen for opprettelse av ChIP-seq transkripsjonsfaktorer og chromatin endringer med chromatin konformasjon fange skal i fremtiden en detaljert forståelse av genet regulatoriske mekanismer i muskel fiber og hvordan disse kan reguleres eller opprørt av fysiologiske stimuli, som trening, faste, en høy fett diett, denervation, eller i sykdom, ved hjelp av chromatin utarbeidet av genetisk endret mus gjengivelse sykdommer som X-koblede centronuclear muskeldystrofi14.
I sammendraget lar denne rimelige og tidseffektive protokollen isolering av muskel fiber kjerner som kan sonicated umiddelbart eller fryses på-80 ° C for ulterior bruk. Bruk av chromatin utarbeidet av denne protokollen har gitt første genomet bredt ChIP-seq data fra muskel fiber7 og vil lette fremtidige studier på genet regulering i dette vevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker alle ansatte IGBMC høy gjennomstrømning sekvensering anlegget, medlem av "Frankrike Génomique" consortium (ANR10-INBS-09-08) og alle IGBMC generelle tjenester spesielt hos IGBMC dyr anlegget. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra CNRS, INSERM, AFM, Ligue Nationale contre le kreft, franskmenn stat fond gjennom ANR programmet Investissements d'Avenir merket ANR-10-IDEX-0002-02, den Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 og ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. S.J ble støttet av Ligue Nationale contre le kreft og ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 og V.U av Ministère de l'Enseignement et de la Recherche. ID er en 'équipe labellisée' Ligue Nationale contre le kreft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).
