Summary
Biz bir protokol yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu kullanılarak analiz tarafından takip HeLa hücreleri Çift Kişilik timidin eşitlenmesi için mevcut. Bu yöntem de interfaz işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri üzerinde çalışmalar etkinleştirme mitoz, zaman uyumlu olarak S faz geçin hücreleri çok sayıda elde anahtarıdır.
Abstract
Çalışma bir aşama bağlı şekilde hücre döngüsünün çeşitli düzenleyici olayların hücre büyümesi ve bölünme hakkında net bir anlayış sağlar. Hücre popülasyonlarının eşitleme hücre döngüsünün belirli aşamalarında bu tür deneysel gayretlerinde çok yararlı olduğu tespit edilmiştir. Hücreleri tarafından nispeten daha az toksik kimyasallar ile tedavi eşitlenmesi farmakolojik inhibitör uyuşturucu kullanımı sonucu hücre döngüsü olaylar ve seçili Mitotik aşamaları belirli zenginlik elde etmek için çalışma için yararlı olabilir. Burada, eşitleme insan hücreleri hücrenin farklı aşamalarında döngüsü, ikimiz de dahil olmak üzere S faz ve bir çift timidin blok-M faz ve yordam kromozom uyum içinde Mitotik proteinler işlevselliğini çalışmak için serbest bırakmak için protokol tarif ve segregasyon. Bu iletişim kuralı kurulan Interphase işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri çalışmak için son derece yararlı olmuştur. Sadece G2/M özel Cdt1 boşaldığında bizim durumumuzda, Cdt1, bir protein için lisans çoğaltma kaynağı G1 evresinde, kritik Mitotik rolü etkin bir şekilde ele. Biz Çift Kişilik timidin eşitlemeyi kullanarak tükenmesi G2/M özel Cdt1 için detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Biz de hücre fiksasyon Protokolü açıklamak ve yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu timidin yayımlanmasından sonra kullanarak hücre görüntüleme yaşamak. Yöntem de bir büyük örneklerin boyutu sabit ve canlı hücre için Mitotik hücre elde etmek kullanmasına olanak tanır Hec1, karmaşık, Ndc80 bir bileşeni için gibi fizyolojik ve perişan koşullarda Mitotik proteinlerin işlevi çözümlemek için yararlıdır analiz biz burada gösterdiği gibi.
Introduction
Hücre döngüsünde hücreleri son derece düzenli ve geçici kontrollü olayları kendi genom ve nükleer silahların yayılmasına karşı doğru çoğaltılması için bir dizi tabi. Memelilerde, hücre döngüsü interfaz ve M-faz oluşur. Interphase içinde ki üç aşamaları - G1, S, oluşur ve G2, hücre genomunu çoğaltır ve normal hücre döngüsü ilerleme1,2için gerekli olan büyüme uğrar. M-mitoz (profaz, prometafaz, metafaz, anafaz ve telofaz) ve sitokinez oluşan aşamasında, bir ebeveyn hücre iki genetik olarak aynı kızı hücreleri üretir. Mitoz, chromatids yinelenen genom kopyası sıkıştırılmış (profaz) vardır ve onların kinetochores monte Mitotik spindle (prometafaz), mikrotübüller tarafından yakalanır kız kardeşi bu sürücüler onların hizalama metafaz ardından plaka (metafaz) onların Ne zaman chromatids doğru bölmek ve ters dönüş için yer değiştiren kız kardeşi (anafaz) Polonyalılar segregasyon eşit. İki kızı hücreleri fiziksel olarak bir aktin esaslı contractile yüzüğü (telofaz ve sitokinez) faaliyet tarafından ayrılır. Kinetochore ve chromatids centromeric bölge çeviren özel bir proteinaceous yapı iğ mikrotübüller için ek siteler olarak hizmet. Temel işlevi kromozom yakalama, hizalama, sürücü ve uygunsuz iğ Mikrotubul eki, Milli Meclis denetim noktası kromozom segregasyon3,4kalitesini korumak için arabuluculuk yaparken düzeltme yardım etmektir.
Hücre eşitleme tekniği moleküler ve yapısal olaylar hücre döngüsü ilerlemesinde dahil anlamak için ideal bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yaklaşım belirli aşamaları için çeşitli analizler, gen ifadesi, profil oluşturma dahil olmak üzere hücresel biyokimyasal süreçlerin analizleri ve proteinlerin hücre altı yerelleştirme tespiti, hücre popülasyonlarının zenginleştirmek için kullanılmıştır. Eşitlenmiş memeli hücreleri-ebilmek var olmak kullanılmış sadece bireysel gen ürünlerinin incelenmesi için aynı zamanda Analizi Mikroarray analiz gen ifade5, miRNA ifade desenleri6dahil olmak üzere bütün genleri içeren yaklaşımlar için translasyonel yönetmelik7ve protein değişiklikler8proteomik analizi. Eşitleme gen ekspresyonu veya protein knock-down veya knock-out veya kimyasal maddelerin etkileri, hücre döngüsü gelişimi çalışma için kullanılabilir.
Hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında eşitlenebilir. Hem fiziksel hem de kimyasal yöntemler hücre senkronizasyonu için yaygın olarak kullanılır. Hücre eşitlemesi için en önemli kriterleri eşitleme noncytotoxic ve geri dönüşümlü olması gerekir vardır. Hücreleri farmakolojik ajanlar tarafından eşitleme potansiyel olumsuz hücresel sonuçları nedeniyle, kimyasal bağımlı yöntemleri anahtar hücre döngüsü olaylar eğitim için avantajlı olabilir. Örneğin, hidroksiüreye, amphidicolin, mimosine ve lovastatin, G1/S faz hücre eşitleme için kullanılabilir ancak, onlar inhibe biyokimyasal yolları üzerindeki etkileri nedeniyle onlar hücre döngüsü kontrol noktası mekanizmaları etkinleştirmek ve önemli bir öldürmek kesir hücreleri9,10. Öte yandan, DNA ikileşmesi "timidin taşı" olarak bilinen büyüme basına timidin ekleyerek geribildirim inhibisyonu hücre döngüsünün belirli Puan11,12,13tutuklayabilirsin. Hücreleri de G2/M aşamasında nocodazole ve RO-33069,14ile tedavisi ile senkronize edilebilir. Nocodazole Mikrotubul derleme önleyen bir nispeten yüksek sitotoksisite vardır. Ayrıca, hücreleri nocodazole tutuklandı tanımışlar tarafından Mitotik kayma Interphase geri dönebilirim. Çift timidin blok tutuklama hücreleri G1/S faz ve blok sürümden sonra zaman uyumlu olarak G2 ve mitoz içine devam etmek için hücreleri bulunur. Timidin bloğundan çıkış hücrelerin hücre döngüsünün normal ilerleme yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu altında hücre fiksasyon veya canlı görüntüleme tarafından görülebilir. Özellikle hücre girin ve mitoz Kişilik timidin blok sürümden sonra devam pertürbasyon Mitotik proteinlerin etkisi okudu. Cdt1, çok fonksiyonlu bir protein DNA çoğaltma kaynağı G1 aşamasında lisansı içinde yer alan ve aynı zamanda mitoz15sırasında kinetochore Mikrotubul ekleri için gereklidir. Cdt1 fonksiyonu mitoz sırasında çalışmaya bir lisans çoğaltmayı G1 aşamasında, aynı zamanda onun tükenmesi özellikle aşamasında G2/M sadece etkileyen üzerinde onun tükenmesi etkisini önler bir yöntem evlat edinmek gerekiyor. Burada, sabit ve canlı hücre görüntüleme tarafından birden fazla işlevi hücre döngüsünün farklı aşamalarında gerçekleştirme proteinlerin Mitotik rol çalışmaya Çift Kişilik timidin blok dayalı ayrıntılı iletişim kuralları mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. çift timidin blok ve yayın: reaktif hazırlıkları
- 500 mL Dulbecco'nın kartal orta (DMEM) orta %10 FBS, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş değişiklik yapmak.
- Steril su ve aliquots-80 ° C'de deposunda timidin stokunun 100 mM olun
2. sabit hücre görüntüleme Mitotik ilerleme (şekil 1A) için iletişim kuralı
- Günde 1, tohum ~ 2 x 105 HeLa hücreleri ile bir kapak (% 70 etanol ve UV radyasyon vermeliyiz ile sterilize) kayma ve DMEM orta 2 mL 6-şey plaka kuyu içine. 37 ° C ve % 5 CO224 h için oksijen bir kuluçka hücrelerin büyümesine.
- 1st timidin blok: 2 günde timidin taze DMEM medya (100 mM hisse senedi, 2 mM son konsantrasyonu) gerekli hacmi iyice karıştırın.
- Timidin içeren 2 mL ekleyin her şey 6-iyi hücrelerde medya plaka ve 18 h için kuluçkaya.
- Gün 3, orta Aspire edin ve hücreleri 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın; hücre Block serbest bırakmak 9 h için taze prewarmed DMEM ortamda hücrelerin büyümesine.
- 2nd timidin bloğu: tekrar timidin içeren 2 mL ekleyin medya (2 mM son konsantrasyonu) her şey 6-şey plaka hücrelerde.
- Başka bir 18 h için kuluçkaya.
- Günde 4, orta Aspire edin ve hücreleri 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın.
- Seyreltik çift (Denetim ve Cdt1) ve transfection reaktif serum ücretsiz büyüme orta 10 dk. için ayrı ayrı bunları karıştırın ve RT., 20 dk için kuluçkaya Her transfection içinde kullanılan siRNA son konsantrasyonu 100 oldu nM. Timidin dışarı yıkanmış hücrelere tepki karışımı ekleyin.
- 9-10 h bloke edilen serbest bırakmak ve hücreleri üzerinde kapak makbuzları ile % 4 saptamak için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya PFA RT., 20 dk
Dikkat: PFA toksik, uygun koruma giymek. -
Immunostain hücreleri, RT, 10 min için % 0,5 (v/v) deterjan ile permeabilizing ve 5 min için 1 x PBS iki kez hücrelerle yıkama sonra.
- 1 x PBS için 1 h %1 (w/v) birincil antikor (1:1, 000, tavşan anti-Zwint1 antikor 1: 400 ve fare anti-fosfo-ɣ H2AX 1:300 seyreltilmiş seyreltilmiş seyreltilmiş fare anti-α-tübülin antikor) 50 µL hücrelerle tedavi tarafından takip RT olarak % 1 BSA (w/v) içeren hücreleri engellemek 1 x PBS 37 oC. 1 h için BSA
- 1 x PBS hücrelerle dışarı üç kez yıkadıktan sonra RT, 1 h için her kapak cam (Alexa 488 ve rodamine kırmızı 1:250 dilutions %1 (w/v) BSA 1 x PBS,) için ikincil antikorların 50 µL hücrelerle tedavi
- 1 x PBS iki kez 5 min için hücrelerle yıkadıktan sonra DAPI hücrelerle tedavi (0.1µg / mL 1 x PBS) RT., 5 min için
- 1 x PBS iki kez 5 min için hücrelerle yıkadıktan sonra kapak notu hücrelere uygun montaj medya net mikroskobik bir slayt üzerinde karşı karşıya koyun.
- Hücreler immunostained proteinler ile 60 X veya 100 X 1.4 NA planı Apochromatic DIC yağı daldırma amaç için gerekli görüntülerin kalitesi için gerektiği şekilde uygun bir kamera ile donatılmış bir ters yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu monte görüntü.
- Z-0.2 µm kalınlık yazılımını kullanarak yığını için mikroskop gerektiği oda sıcaklığında görüntüleri elde etmek.
3. canlı hücre görüntüleme Mitotik ilerleme (şekil 3A) için iletişim kuralı
- Gün 1, yaklaşık 0,5-1 x 105 HeLa hücreleri stabil mCherry-H2B GFP-α-tübülin (biraz hücre tipi ve onlar hızlı proteinler göre değişken) içine 35 mm cam alt yemekler 1.5 mL DMEM orta ile ifade etmek tohum ve onları bir oksijen büyümek kuluçka makinesi 24 h 37 oC ve %5 CO2.
- 1st timidin blok: 2 günde 1,5 mL timidin içeren ekleyin (100 mM timidin, 2 mM son konsantrasyonu,) çanak hücrelerde medya.
- 18 h için kuluçkaya.
- Gün 3, timidin içeren orta Aspire edin ve hücreleri üç kez, 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın.
- Seyreltik çift (Denetim ve Hec1) ve transfection reaktif serum ücretsiz büyüme orta 10 dk. için ayrı ayrı ile onları karıştırın ve RT., 20 dk için kuluçkaya Her transfection içinde kullanılan siRNA son konsantrasyonu 100 oldu nM. Timidin dışarı yıkanmış hücrelere tepki karışımı ekleyin.
- Taze prewarmed DMEM Orta hücre Block serbest bırakmak 8 h için 1,5 mL hücrelerinde büyür.
- 2nd timidin bloğu: 1,5 mL timidin içeren ekleyin medya (2 mM son konsantrasyonu) çanak hücrelerde.
- Başka bir 18 h için kuluçkaya.
- Günde 4, orta Aspire edin ve hücreleri üç kez, 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın. Hücrelerin büyümesine taze prewarmed iyi (L-15) orta %10 FBS ve 20 mM ile HEPES pH 7,0 hücre Block serbest bırakmak 8 h için takıma'nın.
- Zaten en az 30 dakika sahnede ve deneysel sıcaklıklar dengelemek için görüntüleme başlamadan önce açık yüksek çözünürlüklü confocal mikroskop set sıcaklık kontrol odasında çanak yerleştirin.
- Sonra hücreleri görünür hale gelene kadar parlak alanı ile 60 x objektif odak el ile sahne alanı üzerinde seçim bölgesine elemek.
- Işık ve lazer güç/pozlama, görüntü edinme parametreleri ve mikroskop görüntü alma yazılım kullanarak deneme süresi ayarlayın. Filtreleri GFP (488 uyarma; 385 nm emisyon) ve mCherry (561 nm uyarma ve 385 nm emisyon) görüntüleri elde etmek için kullanın.
- Ayrı ayrı pulsed iletilen ışık ve floresan görüntüleri her 10 min 16 s kadar bir süre için elde etme tarafından hızlandırılmış deneme gerçekleştirin.
- On iki 1.0 µm ayrılmış z-uçak yazılım kullanarak Çift Kişilik timidin blok sürümden sonra 9 h için mikroskop gerektiği görüntüleri elde etmek.
- Tek tek hücreler için Mitotik ilerleme izleme görüntüleri analiz ve nihayet bir araya kaynak yazılım Fiji/ImageJ ile ilgili film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitotik ilerleme ve Mikrotubul istikrar hücrelerde çalışma çift timidin blok sürümden sonra sabit
Cdt1 DNA çoğaltma kökenleri G1 aşamasında lisansı içinde yer almaktadır. S aşamasında bozulmuş ama G2/M aşamasında yeniden birikir. Mitoz rolü çalışmaya, endojen Cdt1 en uygun hücre eşitleme tekniği Çift Kişilik timidin blok15kullanarak özellikle G/M aşamasında tükenmiş gerekiyor. Hücreleri faz ve hangi zaman çoğaltma kökeni G1, ayrıca Cdt1 işlevi gerektiren lisans uzun tamamlanmış olan S olduğunda hücreleri hemen sonra serbest bırakmak--dan 2nd timidin blok, çift ile transfected. Cdt1 tükenmesi sonra siCdt1 transfection ve çift timidin blok sürüm 9 h (şekil 1B) Western Blot tarafından doğrulandı. Hücreleri 9 kişilik timidin blok sürümden en hücreleri kontrol ve Cdt1 siRNA metafaz safhasında olduğunu gösterdikten sonra h fiksasyonu hücreleri transfected. Ama süre kontrol hücreleri anafaz girin ve normalde kromozomlarını beklenen (şekil 1 c ayırmak en Cdt1 hücreler siRNA tedavi hala geç prometafaz aşamasında tutuklanıyor Çift Kişilik timidin blok sürümden sonra hücre 10 h fiksasyon gösterir ). Cdt1 tükenmesi kinetochore-Mikrotubul (kMT) istikrar üzerindeki etkisini anlamak için hücreleri 9 h serbest bırakmak--dan sonra çift sadece korur istikrarlı kinetochore-mikrotübüller (kMTs) soğuk tedavi tarafından takip timidin blok tespit edildi. KMTs hücre Cdt1 tükenmiş sonra soğuk tedavi kontrol hücreleri (şekil 1 d) kıyasla nispeten daha az sağlam. Böylece, bu yaklaşımı kullanarak, normal Mitotik hücrelerinin ilerlemesi pertürbasyon ilgi Mitotik protein(s) fonksiyonu sonra etkili, hatta canlı hücre görüntüleme kullanmadan okudu.
Şekil 2 hücreleri Cdt1 Ayrıca kontrol hücreleri gözlendi bizim iletişim kuralını kullanarak G2/M aşamasında tükendi zaman DNA çoğaltma kökeni lisans tedirgin değil olduğunu gösterir. G2/M aşamasında Cdt1 tükenmiş hücreleri fosforile ɣH2AX, DNA hasarı, avans birikimi sonraki G2 evresinde neden değil; Oysa siRNA transfection Cdt1 tüketmek için zaman uyumsuz kültürlerin fosfo-ɣH2AX pozitif foci, büyük olasılıkla hatalı DNA lisans çoğaltma tarafından indüklenen DNA hasar nedeniyle birikimi indüklenen.
Çalışma yayın yanında canlı hücre düşsel Çift Kişilik timidin bloğundan sonra hücrelerdeki Mitotik progresyon
Nükleer zarf arıza (NF'leri) sonra (pertürbasyon fonksiyonel Mitotik protein tarafından yokluğunda) normal hücreler mitoz girin ve mitoz içinde yaklaşık 30-60 dk (şekil 3B) dan çıkmak için anafaz başlangıçlı tabi. Ama Hec1, sağlam kMT eki oluşumu için gerekli olan bir anahtar kinetochore protein, RNAi aracılı nakavt normal Mitotik ilerleme geciktirmek için bulunur. Bu senaryoda, en hücreler mitoz NF'leri sonra girin ama değil anafaz başlangıçlı geçmesi veya mitoz mitoz (şekil 3 c) gecikme birkaç saat sonra bile çıkmak. Benzer şekilde, RNAi aracılı nakavt kinetochores veya mitoz sırasında bir işleve sahip yerelleştirir diğer protein etkisi böylece etkili bir şekilde canlı hücre görüntüleme Çift Kişilik timidin blok sürümden sonra kullanarak görülebilmektedir. Mitotik ilerleme, gecikme ve tutuklama doğa eğitim ek olarak, bu yöntem kullanılarak denenecektir diğer anahtar Mitotik olayları kromozom hizalama, Mitotik iğ oluşumu ve belgili tanımlık harekete geçirmek konumlandırma ve, susturmak bazıları Milli Meclis denetim noktası.
Şekil 1: Mitotik ilerleme ve kinetochore mikrotübüller çift timidin eşitlemeden sonra sabit hücrelerdeki kararlılığını analizi. Hücre eşitleme, fiksasyon ve ayirt (A) A şematik gösterimi. (B) Western blot Cdt1 nakavt 9 h sürüm 2 timidin bloğundan sonra için. (C) Mitotik hücreleri göstermek için ayirt Filmler Çift Kişilik timidin blok ve denetimi (üst) veya Cdt1 siRNA (alt) ile tedavi yayımlanmasından sonra 9 ve 10 s sabit. Α-tübülin boyama kırmızıyla, hücreleri GFP Histon H2B ifade gibi DNA yeşil. Ölçek çubuğu = 10 µm. hücreleri Prometaphase ve metafaz sarı kullanarak belirtilir ve ok uçları sırasıyla beyaz. (D) HeLa hücreleri kontrol siRNA (üst panel) ile tedavi ve sonrasında serbest bırakmak--dan sonra Cdt1 tükenmesi (alt paneli) 9 h için çift timidin blok buz gibi iyi'nın (L-15) ile tedavi ardından orta ve fiksasyon. Hücreleri bağışıklık lekeli iğ MT (yeşil) ve Zwint1 (kırmızı) ve DAPI DNA'ın siyah beyaz bir kinetochore işaret edildi. Ölçek çubuğu 5 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Cdt1-tükenmesi G2/M aşamasında değil huzursuz lisans çoğaltmayı. Zaman uyumsuz HeLa hücreleri kontrol luciferase (üst panel) ile tedavi veya cdt1 çift (orta Masası) veya çift timidin 2nd timidin wash-out 10 h fiksasyon ardından sırasında cdt1 siRNA ile tedavi HeLa hücreleri senkronize serbest kaldıktan sonra (alt paneli) DAPI (sözde renkli yeşil) ve anti-fosfo-ɣH2AX antikor (kırmızı) ile lekeli. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Analysis canlı hücre içinde görüntüleme Mitotik ilerleme senkronize hücreleri. Hücre eşitleme ve canlı hücre görüntüleme (A) A şematik gösterimi. Stabil mCherry-Histon H2B ifade HeLa hücreleri ve GFP-α-tübülin Çift Kişilik timidin blok 8 h S faz krizinden G2/M evresi ile devam izin için serbest bırakıldı. Canlı görüntüleme 8 h timidin bloğu hücrelerinden serbest ve için en fazla 16 saat bu noktadan devam sonra başlayan yüksek çözünürlüklü confocal mikroskop kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Burada gösterilen her 10 min pertürbasyon Mitotik herhangi bir protein (B) olmadan kontrol hücreleri veya hücre Hec1 alt birimi, karmaşık Ndc80 (C) aküsü tükenmek üzereyken yakalanan videodan hareketsiz görüntüler vardır. Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu hücreler mitoz böylece aynı zamanda kromozom hizalama, bipolar analizlerini etkinleştirme uyum içinde girerek birçoğunu içeren bir kısa sürede pencerede Mitotik hücre bir artan örnek boyutu sağlar Çift Kişilik timidin eşitleme en önemli avantajı olduğunu oluşumu ve kromozom ayrımı çok daha yüksek verimlilik ile iğ.
Birçok düzenleyici protein kompleksleri ve sinyal yollar mitoz yoluyla normal ilerleme sağlamaya adadık ve deregülasyon bu sürecin tumorigenesis için neden. Stabil mCherry-H2B ve GFP tübülin ifade etmek ve çoğu kontrol hücreleri kromozomlarını anafaz yaklaşık 60 dakika içinde NF'leri (şekil 3B) sonra ayırmak Çift Kişilik timidin blok gösterir serbest HeLa hücreleri hücre görüntüleme yaşıyor. Öte yandan, hücre görüntüleme HeLa hücre işlevi en hücreleri yanlış hizalanmış kromozomlar ardından anafaz başlangıçlı veya apoptosis (şekil 3 c) ile uzun bir süre için Mitotik faz kal gösterir Hec1 ile perişan yaşıyorum.
Aşırı timidin S aşamasında G1/S faz11hücreleri böylece engelleme DNA sentezini engeller. En sık kullanılan yöntem hücre döngüsü ve Mitotik ilerleme çalışmada Çift Kişilik timidin blok eşitleme olmasına rağmen bir bu yöntemi sınırlamaları bazı kritik olması gerekir. Önemlisi, bu kimyasal iyice (7-8 h) böylece etkisi alınamaz ve hücreleri normalde hücre döngüsünün geri kalanı ile devam edebilirsiniz yıkanmış ki sağlanması gerekir. Hücreleri aksi takdirde yanlış ilerleme olsa mitoz neden döngüsünün ikinci girmek değildir. Eşitlenmiş hücre oranı bir tek timidin blok ile yeterince yüksek olmayabilir ve özellikle bir mitoz belirli bir aşamasında okuyan ilgilenen bir çift timidin blok eşitlenmiş hücre sayısını artırmak gerekli olabilir. Timidin tedavi süresi arasında hücre tipleri oluşturma süresi bağlı olarak farklı duyarlılık nedeniyle optimize edilmiş olması gerekir. Örneğin, hamster hücreler oluşturma süresi 16 h ve timidin için en iyi eşitleme1711 h ile tedavi edilir. Bu çalışmada, HeLa hücreleri timidin ile 16-18 h için tedavi ettik. Ayrıca, aşırı timidin sadece DNA sentezini engeller ama aynı zamanda hücreleri11,12,18 önemli kesirler öldürmek ve dikkat bu kayıp izlemek için ödenmesi gereken kapatın. Bu çalışmada kullanılan timidin hisse senedi çözüm steril distile suda hazırlanmalı ve iyice hücre kültür medya siRNA medyaya ekleme hücreleri transfected sonra onun yağış önlemek için ve aynı zamanda onun homojen sağlamak için karışık olabilir Dağıtım kültürlü hücrelerin etrafındaki.
Mitotik ilerleme sırasında bir hedef Mitotik proteinin işlev eğitim için hücreleri ideal olacaktır nakavt için faiz protein düzeyleri 1st timidin blok sırasında veya 1St yayın sırasında siRNA ile tedavi timidin blok, verimli protein devirme19,20,21almak için gereken süreyi bağlı olarak. Öte yandan, Cdt1 gibi çok fonksiyonlu proteinlerin rolü mitoz sırasında çalışmak için G2/M belirli tükenmesi elde etmek için 2nd timidin blok sürümden sırasında siCdt1 hücrelerle tedavi için gerekli olan. Cdt1 DNA çoğaltma kökenleri15lisans içinde önemli bir oyuncusu. Lisanslama rolüne engel olmadan mitoz sırasında özel rolünü anlamak için Cdt1 verimli çift timidin eşitleme tarafından elde edilebilir, özellikle G2/M aşamasında, tükenmiş böylece diğerine başvurmak gerek kaçınmak gerekir yürütmek zordur mitoz özgü pertürbasyon yaklaşımlar. Cdt1 tükenmesi zaman uyumsuz kültürlerde neden sırayla bu protein için olası bir fonksiyonun analiz sırasında mitoz bulanık DNA çoğaltma kökenleri lisans kesinti dolayı DNA hasarı yanıt. Böylece, Çift Kişilik timidin eşitleme tekniği normal bir G1 ve S faz uygulandı ama Cdt1 işlevi G2 ve M aşamasında yoktu hücreleri oluşturmak için benzersiz bir deneysel yaklaşım sunuyor. Çok fonksiyonlu proteinler onun inhibisyonu belirli faz (G2/M) sırasında mitoz roman işlevleri çalışmaya bizim eşitleme protokolünün özel bir önem yatıyor. Böylece, bu yöntem sadece rol farklı hücre döngüsü aşamaları sırasında birden fazla işlevi olan proteinler ama aynı zamanda bu kromozom hizalama, kMT ekleri ve kromozom ayrımı sürecinde Mitotik herhangi bir proteinin çalışma için yararlı olacaktır.
Çift Kişilik timidin blok sürümden sonra canlı hücre görüntüleme için Önceden ısıtılmış iyi içinde'nın (L-15) hücreleri inkübe orta görüntüleme başlangıcına kadar % 10-20 FBS ile desteklenmiştir. Hücreleri mitoz değişken zaman noktalarda timidin blok hücre türüne bağlı olarak açıklamasından sonra girin. Görüntü yakalama veya fiksasyonu başlangıç saati hücre türüne bağlı olarak optimize edilmiş olması gerekir. Canlı hücre görüntüleme için geleneksel confocal mikroskobu kullanımı sırasında uzun vadeli görüntüleme photobleaching neden olabilir. Öte yandan, yüksek çözünürlüklü confocal microcopy photobleaching etkileri en az ölçüde ile net ve yüksek çözünürlüklü görüntü verir.
Bu iletişim kuralı kritik adımlarda timidin tedavi süresi, timidin, siRNA transfection zamanlaması ve görüntüleme başlangıç zamanlaması uygun Silinerek geçiş vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip mali niyetimiz yok bildirin.
Acknowledgments
Stabil mCherry-Histon H2B ve GFP-α-tübülin ifade HeLa hücreleri paylaşımı için Tohoku Üniversitesi, Japonya'nın Dr Kozo Tanaka için minnettarız. Bu eser DV (R00CA178188) için bir ncı hibe ve Northwestern Üniversitesi'nden başlamak-yukarıya fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C |
| DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 °C |
| Leibovitz’s (1x) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 °C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 °C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1,000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 °C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35 mm Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A.
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
