Summary
يصف لنا هنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة بطلاء البكتيريا مع البيوتين وستريبتافيدين.
Abstract
Typhimurium السالمونيلا هو بكتيريا داخل الخلايا اختياري الذي يسبب التهاب المعدة والأمعاء في البشر. وبعد غزو بروبريا الصفيحة, S. البكتيريا تيفيموريوم يتم بسرعة الكشف عن فاجوسيتيزيد التي الضامة والواردة في حويصلات المعروفة فاجوسوميس من أجل أن يتحلل. عزل من س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة كيفية س. العدوى تيفيموريوم يغير عملية نضج يبلوع لمنع تدهور البكتيرية. كلاسيكي، عزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس قامت به السكروز التدرج الطرد المركزي. بيد أن هذه العملية تستغرق وقتاً طويلاً، ويتطلب معدات متخصصة ودرجة معينة من المهارة. الموصوفة هنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة بطلاء البكتيريا مع البيوتين-ستريبتافيدين-مترافق الخرز المغناطيسية. يمكن تعليق فاجوسوميس التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة في أي مخزن من الاختيار، مما يتيح الاستفادة فاجوسوميس معزولة لمجموعة واسعة نطاق من فحوصات، مثل تحليل المستقلب، البروتين والدهن. باختصار، هذا الأسلوب لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس محددة، وتتسم بالكفاءة، السريعة، يتطلب الحد الأدنى من المعدات، وهو أكثر تنوعاً من الأسلوب الكلاسيكي للعزل بواسطة السكروز التدرج-تنبيذ فائق.
Introduction
يتم تعميم الضامة الخلايا متجولة المتخصصة التي كشف وتبتلع وتحط أي الجسيمات الأجنبية موجودة في الأنسجة المحيطية، بدءاً من الخلايا أبوبتوتيك إلى غزو الكائنات الدقيقة مثل البكتيريا. عند الحصول على الاعتراف بوساطة مستقبلات سطحية الممرض علامات محددة عادة موجودة على السطح من الكائنات الحية الدقيقة (المعروفة باسم أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة أو بامبس)، الضامة الشروع في إعادة تنظيم معقدة للغشاء الخلوي في النظام المحيطي و الممرض1فاجوسيتيزي.
ثم يرد الممرض انجولفيد بلعم في حويصلة داخل الخلايا المعروفة باسم يبلوع. من خلال سلسلة من الانصهار والانشطار الأحداث مع حويصلات أخرى مثل اندوسوميس وليسوسوميس، يكتسب يبلوع التي تحتوي على الكائنات الممرضة مجموعة من البروتينات اللازمة للقضاء على المحتوى فاجوسومال. ولذلك تكوين الانزيمية يبلوع اختلافاً كبيرا أثناء هذه العملية، المعروفة باسم يبلوع نضوج2.
بعد قليل من البلعمه، مولتيميريك ATPase رغوي المعقدة (الخامس-ATPase) أدمجت في الغشاء يبلوع بالانصهار مع اندوسوميس3. يستخدم هذا المركب ATP لمضخة البروتونات من سيتوسول إلى التجويف يبلوع4. تحمض يبلوع أمر ضروري لإحداث الانصهار مع غيرها من حويصلات5 لتفعيل عدد كبير من إنزيمات بوليمرات تعتمد على درجة الحموضة6. آخر مولتيميريك الانزيمية المعقدة التي يتم تجميعها بسرعة على الغشاء يبلوع هو مجمع نادف-أوكسيديز (NOX). أكاسيد النيتروجين المعقدة يكسد نادف بغية إنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) التي هي مخفي في التجويف يبلوع، وأن تسهم إسهاما كبيرا في قتل الكائنات الحية الدقيقة التي اجتاحت7.
أثناء الخطوات الأولى من النضج، يقدم فاجوسوميس علامات عادة مثل Rab5 و Rab7 من اندوسوميس المبكرة والمتأخرة على التوالي جنبا إلى جنب مع وحدة فرعية0 V v-ATPase8. نتائج انصهار فاجوسوميس مع ليسوسوميس واندوسوميس الراحل في التعرض لمسببات المرض فاجوسيتيزيد لمجموعة متنوعة من الإنزيمات هيدروليكي مثل البروتياز كاثيبسين، ليباسيس، وبيتا-جالاكتوسيداسي9. تحمض التجويف مطلوب أيضا لتفعيل هذه الإنزيمات. على سبيل المثال، هو انقسام كاثيبسين د لإنتاج النموذج القصير نشطة تعتمد على درجة الحموضة10. هذه الإنزيمات تتحلل مسببات المرض والتوسط من أجل إنتاج الببتيدات القصيرة المستمدة من العوامل الممرضة التي ترد بها بلعم histocompatibility الرئيسية (MHC) الفئة الثاني جزيئات معقدة لخلايا تي يؤدي استجابة المناعية تكيفية11.
ومن ثم، نضوج يبلوع حاسمة بالنسبة للاستجابة المناعية الفطرية ووصلات بالأسلحة الفطرية والتكيف في الجهاز المناعي. لا عجب أن مسببات الأمراض تطورت استراتيجيات للتغلب على القضاء بالضامة خلال عملية النضج يبلوع الموصوفة أعلاه. على سبيل المثال، منع البكتيريا داخل الخلايا متفطره و المستروحة فيلقيه يبلوع نضوج المثبطة الخامس-ATPase الجمعية وما يترتب عليها من التجويف التحمض12،13 . حمل البكتيريا الأخرى، مثل الليستريه المستوحدة أو فليكسنيري دوسنتاريا تشكيل المسام في غشاء يبلوع الهروب إلى14،سيتوسول15. من ناحية أخرى، انتيريكا السالمونيلا سرفار تيفيموريوم (S. تيفيموريوم) غير قادرة على تعديل خصائص يبلوع داخل المنقبضة لتحويله إلى موقع مناسب ل النسخ المتماثل16. هذه القدرة يجعل س. تيفيموريوم نموذجا مثيرا للاهتمام لدراسة التدخل الممرض بوساطة من النضج يبلوع.
س. تيفيموريوم هو بكتيريا داخل الخلايا اختياري الذي يسبب التهاب المعدة والأمعاء في البشر. وبعد غزو بروبريا الصفيحة، س. البكتيريا تيفيموريوم يتم بسرعة الكشف عن فاجوسيتيزيد التي الضامة والواردة ضمن فاجوسوميس17. ووصفت بعض تقارير سبق أن س. تيفيموريوم-فاجوسوميس التي تحتوي على صناع ل اندوسوميس وليسوسوميس18، وقد وجدت دراسات أخرى الانصهار يبلوع-يحلول حالت دون بناء س. تيفيموريوم العدوى19.
وفي البداية، يبلوع النضج عند س. كانت قد أجرت التحقيق الإصابة تيفيموريوم المجهري الفلورة. تطوير تقنيات لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس تمكين إجراء دراسة أكثر دقة لمحتوى يبلوع من حيث علامات دخلول ويحلول. وحتى الآن، والطريقة الرئيسية المستخدمة لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس هو تجزئة سوبسيلولار على السكروز خطوة التدرجات18،20. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب عدة خطوات الطرد المركزي التي يمكن أن تتسبب في الأضرار الميكانيكية إلى فاجوسوميس ويمكن أن يؤثر على استقرار مكونات فاجوسومال (البروتينات والدهون) ومضيعة للوقت. وعلاوة على ذلك، فإنه يتطلب استخدام أولتراسينتريفوجي: قطعة من المعدات المتخصصة التي لا يمكن الوصول إليها لكل مختبر.
مؤخرا، تم تطبيق نهج جديد لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس، التي وصفت مسببات الأمراض البكتيرية مع بيوتينيلاتيد ليبوبيتيدي (ليبوبيوتين) وفي وقت لاحق المستخرجة باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق ستريبتافيدين21 . ونحن نقترح طريقة تكميلية بديلة بوسم البكتيرية الجزيئات السطحية التي تحتوي على أمين مع دائرة الصحة الوطنية--البيوتين تليها مترافق streptavidin الخرز المغناطيسية. فاجوسوميس التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة يتم التخصيب في علامات دخلول ويحلول ويمكن استخدامه لمجموعة واسعة نطاق من فحوصات، من تحليل البروتين بتحليل اوميكس. بالإضافة إلى ذلك، فإنه لا يتطلب معدات متخصصة مثل أولتراسينتريفوجيس. وعلاوة على ذلك، عن طريق القضاء على الخطوات الطرد المركزي، الأضرار الميكانيكية إلى فاجوسوميس ومقدار الوقت المستخدمة هي خفض كبير. هذا الأسلوب يمكن تكييفها بسهولة لعزل فاجوسوميس التي تحتوي على البكتيريا الأخرى، مثل إيجابية المكوّرات العنقودية الذهبية، وشملت أيضا في هذه المخطوطة. باختصار، هذا الأسلوب لعزل س. تيفيموريوم-تحتوي على فاجوسوميس وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة، وأقل استهلاكاً للوقت من عزلة الكلاسيكية من السكروز أثري تنبيذ فائق التدرج، مما يجعل درجة عالية فاجوسوميس المحتوية على البكتيريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الخطوات التي تنطوي على استخدام الممرضة س. يجب أن يتم تيفيموريوم في BSL-2 أو مرفق أعلى من المستوى الأمن البيولوجي. الثقافة وطلاء من س. تيفيموريوم، فضلا عن انتقال العدوى إلى المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس) يجب أن يتم تحت غطاء الاندفاق الصفحي لمنع التلوث. عزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس يمكن أن يؤديها على أي مقعد مختبر BSL-2-
استخراج النخاع من الفئران لأن التفريق في الضامة كان يؤديها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية على الرفق بالحيوان ووافقت عليها "وكالة الدولة" شمال الراين-ويستفاليا للطبيعة، البيئة، وحماية المستهلك [لانديسامت für Natur، أومويلت وفيربراوتشيرشوتز (لانوف) نوردراين-فيستفالن؛ ملف لا: 84-02.05.40.14.082 و 84-02.04.2015.A443] وجامعة كولونيا-
1-كولتورينج تيفيموريوم س.
- إينوكولاتي س. تيفيموريوم (سلالة SL1344) من مستعمرة بكتيرية واحدة إلى 5 مل من الدماغ القلب ضخ (بهي) مرق استخدام حلقة بكتيرية.
- احتضان تعليق البكتيرية في حاضنة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الهز.
- اليوم التالي، نقل 1 مل تعليق البكتيرية إلى 19 مل مرق بهي في قارورة مخروطية واحتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة بالهز. رصد
- س. تيفيموريوم النمو عن طريق قياس الكثافة البصرية (OD) 600 نانومتر (OD 600) مع جهاز المطياف الضوئي. ينبغي أن تؤخذ قياسات تقريبا كل 30 دقيقة
- OD عند 600 تصل إلى 1.0، وإزالة تعليق البكتيرية من الحاضنة ونقل في أنبوب 50 مل. الطرد المركزي البكتيريا في 5,400 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 ° C.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند في 10 مل من المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS).
- أجهزة الطرد المركزي في 5,400 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة المادة طافية والبكتيريا في مل 4.9 من PBS العقيمة ريسوسبيند.
2. طلاء من S. typhimurium مع دائرة الصحة الوطنية--البيوتين/ستريبتافيدين-مترافق "المغناطيسي الخرز"
- إضافة 100 ميليلتر من 10 ملغ/مل البيوتين ربط الحل (دائرة الصحة الوطنية--البيوتين حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد، [دمس]) طازج، إلى تعليق البكتيرية إعدادها في الخطوة السابقة. على سبيل المثال، يؤدي إلى تمييع 5 ملغ من دائرة الصحة الوطنية--البيوتين إلى 0.5 مل من العقيمة [دمس]. مزيج صحيح من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات.
- تقسيم المزيج إلى خمسة أنابيب 1.5 مل.
- إينكوباتي ح 2 في درجة حرارة الغرفة (RT) على ثيرموبلوك مع الهز المستمر في 350 دورة في الدقيقة-
- الطرد المركزي أنابيب في 15,000 س ز لمدة 10 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، أجهزة الطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 10 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية.
- كرر الخطوة 2.5 أكثر مرتين لإزالة البيوتين الزائدة التي تربط الحل.
- بعد الغسيل الأخير، ريسوسبيند بيليه في 1 مل PBS العقيمة.
- نقل 100 ميليلتر من 10 ملغ/مل مترافق streptavidin المغناطيسي الخرز الحل في أنبوب 1.5 مل وترك الأمر على الرف المغناطيسي للحد الأدنى 5
- إزالة المذيب مع ماصة، واتخاذ الحل الخرز المغناطيسي streptavidin-مترافق من الرف المغناطيسية، وريسوسبيند أنه مع 1 مل تعليق البكتيريا المغلفة البيوتين إعدادها في الخطوة 2.7.
- إينكوباتي ح 1 في RT على ثيرموبلوك مع الهز المستمر في 350 دورة في الدقيقة-
- وضع الحل على الرف المغناطيسي؛ والانتظار لمدة 5 دقائق ثم قم بإزالة البكتيريا التي لم تتقيد على الجدار مع ماصة (يبقيه في أنبوب وصفت " البكتيريا المغلفة بغير "). هو الكسر التمسك بجدار الأنبوبة على اتصال بالمغناطيس البكتيريا البيوتين/ستريبتافيدين-المغلفة.
- إزالة الأنبوب الذي يحتوي على البكتيريا المسماة من الرف المغناطيسية وريسوسبيند في 1 مل PBS العقيمة.
- وضعه مرة أخرى على الرف المغناطيسية، والانتظار لمدة 5 دقائق، واستخدام ماصة لإزالة برنامج تلفزيوني-
- كرر الخطوتين 2.13 و 2.14 مرتين أخريين لإزالة جميع البكتيريا التي هي غير مطلي بالخرز المغناطيسي مترافق streptavidin.
- بعد الغسيل الأخير، ريسوسبيند هذه البكتيريا المغلفة في 500 ميليلتر من PBS العقيمة وتسمية الأنبوب ك " مغلفة بالبكتيريا ".
- عد مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) على حد سواء " البكتيريا المغلفة بغير " و " مغلفة بالبكتيريا " الحلول بطلاء تخفيف المسلسل على لوحات أجار بهي. يتم الحصول على حوالي 2 × 10 8 زيمبابوي/مل من البكتيريا المغلفة من 20 مل تعليق البكتيرية الأولية مع OD 600 من 1.0. تبقى وقف البكتريا المغلفة عند 4 درجة مئوية لاستخدامها في اليوم التالي لتصيب الضامة.
3. عدوى بدمدس
- في نفس اليوم عندما المغلفة البكتيريا مع البيوتين والخرز المغناطيسي مترافق streptavidin، لوحة كاملة بمدمس المتباينة 22 في الأطباق 6 سم في كثافة 5 × 10 6 خلايا كل صحن.
- في اليوم التالي، الطرد المركزي بتعليق البكتيريا المغلفة في 15,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند في معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) بتركيز 10 × 10 6 زيمبابوي/مل. إزالة المتوسطة من بمدمس
- لتصيب الضامة في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10، وإضافة 5 مل تعليق البكتيريا المغلفة أعدت. يمكن تقييم موي الأمثل لكل نوع من الخلايا أو التجريبية والغرض من فاجوسوميس معزولة.
- إينكوباتي على RT لمدة 10 دقائق لمزامنة البلعمه.
- إينكوباتي في 37 درجة مئوية في 5% CO 2 حاضنة لمدة 30 دقيقة الشروع في البلعمه. أنواع خلايا أخرى قد تتطلب أوقات الاحتضان مختلفة لضمان استيعاب البكتيريا.
- إزالة المتوسطة المحتوية على البكتيريا من الصحون وتغسل الخلايا مع ربمي ثلاث مرات لإزالة البكتيريا غير مستوعبة.
- وأخيراً إضافة 10 مل ربمي الذي يحتوي على 10% FBS ومع الجنتامايسين 50 ميكروغرام/مل لقتل أي بكتيريا غير فاجوسيتيزيد-
- احتضان بمدمس المصابة في 37 درجة مئوية مع 5% CO 2 حتى نقطة الوقت المطلوب. يجب أن تحدد نقطة الوقت المطلوب تجريبيا وفقا للبكتيريا ونوع الخلية المستخدمة والغرض من التحليل. لدراسة الأحداث الانصهار يبلوع-دخلول المبكر في س. بمدمس تيفيموريوم المصابة، ينصح حضانة و 30 دقيقة. لتحليل أحداث لاحقة، يمكن استخراج فاجوسوميس بعد ح 2 أو 4 ح للحضانة. حضانة طويلة من الضامة مع س. نتائج تيفيموريوم بعد 24 ساعة في وفاة الضامة. تمديد العدوى داخل الخلايا قبل استخراج يبلوع ربما يؤدي إلى تدهور الجزيئات البيوتين. ومع ذلك، أن نحن لم يلاحظ فقدان البيوتين على البكتيريا المغلفة حتى حاء 24
4. عزل من س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس
- إعداد حجم يبلوع المطلوب عزلة المخزن المؤقت (50 ملم أنابيب، pH.7، 50 مم مجكل 2، 5 ملم عطا) بإضافة ديثيوثريتول (DTT) بتركيز نهائي من 1 مم، ب سيتوتشالاسين إلى نهائي تركيز مثبطات ميكرومتر، ومبطلات والفوسفاتيز 10 حسبما أوصت به الشركة المصنعة.
ملاحظة: DTT وب سيتوتشالاسين يجب إضافة إلى عزل يبلوع المخزن المؤقت باستخدام دائماً فورا من قبل. يعطل ب سيتوتشالاسين سيتوسكيليتون، تيسير تمزق غشاء الخلية. - وفي الوقت المطلوب أشر، وإزالة المتوسطة من الخلايا المصابة ويغسل مع PBS العقيمة استعد الرايت
- 750 إضافة ميليلتر من فاجوسومالمخزن المؤقت بكل طبق ه العزلة واحتضان 20 دقيقة على الجليد. عند استخدام أرقام الخلية مختلفة، ينبغي تعديل حجم المخزن المؤقت لعزله بالتناسب.
- إضافة 250 ميليلتر يبلوع عزلة المخزن المؤقت ب (الأنابيب 50 مم، pH.7، 50 مم مجكل 2، 5 ملم اجتا، 220 مم المانيتول والسكروز 68 ملم). روك اللوحة ضمان وصول المخزن المؤقت إلى السطح الكامل للطبق. عند استخدام أرقام الخلية مختلفة، ينبغي تعديل حجم المخزن المؤقت للعزلة ب تناسبياً.
- إزالة الخلايا من الطبق بلطف إلغاء استخدام شرطي مطاط وتحويلها إلى أنبوب مبردة مسبقاً 1.5 مل.
- يمر بتعليق خلية إبرة ز 26 استخدام المحاقن 1 مل على الأقل 15 مرة (تطلع واحد بالإضافة إلى طرد واحدة من التهم تعليق خلية كمرة واحدة). وهذا يكفي لإطلاق سراح سيتوسوليك محتوى بمدمس. عدد يمر عبر الإبرة يجب أن يكون الأمثل لكل نوع من أنواع الخلايا. وضع تعليق خلية على الرف المغناطيسية
- والانتظار مدة 5 دقائق. جسيمات تعلق على المغناطيس هي فاجوسوميس التي تتضمن المغلفة-س. تيفيموريوم. التعليق يحتوي على بقية المكونات الخلوية.
- نقل التعليق في أنبوب 1.5 مل وصفت " سيتوسول "-
- إزالة الأنبوب مع فاجوسوميس المعزولة من الرف المغناطيسية وريسوسبيند لهم في 1 مل PBS العقيمة.
- وضع تعليق يبلوع على الرف المغناطيسية، والانتظار لمدة 5 دقائق، وإزالة برنامج تلفزيوني-
- كرر الخطوات 4.9 و 4.10 لغسل معزولة س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس-
- وأخيراً إزالة برنامج تلفزيوني وريسوسبيند فاجوسوميس في المخزن المؤقت المطلوب؛ فعلى سبيل المثال، في مخزن فحص (RIPA) راديويمونوبريسيبيتيشن لتحليل البروتين. يتم الحصول على ما يقرب من 50-200 ميكروغرام من البروتين كل عينة عقب هذا البروتوكول، تبعاً لكمية الخلايا الأولية ووزارة الداخلية من العدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العزلة التي تحتوي على البكتيريا فاجوسوميس بهذا البروتوكول يتطلب بيوتينيليشن البكتيريا كخطوة أولى. ولذلك قمنا بتقييم فعالية س. بيوتينيليشن تيفيموريوم بالتحليل المجهري [كنفوكل] للمصابين بيوتينيلاتيد بمدمس متشيري-S. تيفيموريوم المسمى مع Cy5-ستريبتافيدين. باختصار، كانت مصابة بمدمس كما هو موضح في هذا البروتوكول مع مشري-S. تيفيموريوم بيوتينيلاتيد سابقا ولكن لا المحتضنة مع الخرز المغناطيسي مترافق streptavidin. بعد 30 دقيقة في الحضانة عند 37 درجة مئوية، كانت الخلايا غسلها مع برنامج تلفزيوني الحارة والثابتة مع 4% فورمالدهايد لتوقف 20 دقيقة في "التثبيت الرايت" بالغسيل واسعة النطاق مع برنامج تلفزيوني. ثم تم بيرميبيليزيد الخلايا مع 3% تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في "الرايت بمدمس المصابة" كانت ثم المحتضنة مع Cy5-ستريبتافيدين لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعد الغسيل واسعة النطاق، أعدها [كنفوكل] مجهرية (الشكل 1) العينات للتحليل. لا بيوتينيلاتيد متشيري-S. تيفيموريوم كمراقبة سلبية. إشارة الفلورسنت من Cy5-ستريبتافيدين وقد لوحظ حصرا في بيوتينيلاتيد متشيري-S. تيفيموريوم، مما يؤكد أن بيوتينيليشن من البكتيريا كانت ناجحة. أجرى تحليل تقنيين في مجهر [كنفوكل] استخدام "60 X O2 نا: 1.40" الهدف. موجات الإثارة فلوروتشروميس كانت 405 نانومتر (DAPI)، 559 نانومتر (مشري)، وشمال البحر الأبيض المتوسط (Cy5)، و PMT 635 تم تعيين الجهد في 574v و 565v و 443v، على التوالي.
منذ فجرها في الضامة Sالاستجابة المناعية. تيفيموريوم يعتمد إلى حد كبير على تفعيل مستقبلات سطحية بلعم من يغاندس البكتيرية، واختبرنا التالية إذا كان الطلاء من S. يمكن أن يغير تيفيموريوم البيوتين والخرز المغناطيسي مترافق streptavidin الاستجابة المناعية الفطرية في بمدمس المصابة. أولاً قمنا بتقييم ما إذا كان الطلاء من S. يمكن أن يغير تيفيموريوم متجولة قدرة بمدمس بالفحص المجهري [كنفوكل]. ولم يصب بمدمس كما هو موضح في هذا البروتوكول مع مشري-S. تيفيموريوم المغلفة مع البيوتين والخرز المغناطيسي streptavidin مترافق أو غير المصقول مشري-S. تيفيموريوم. بعد 30 دقيقة في الحضانة عند 37 درجة مئوية، الخلايا تم غسلها مع برنامج تلفزيوني الحارة والثابتة مع 4% فورمالدهايد لمدة 20 دقيقة في الرايت بعد الغسيل واسعة النطاق مع برنامج تلفزيوني، أعدها مجهرية [كنفوكل] العينات للتحليل. كما هو مبين في الشكل 2، فاجوسيتيزيد الضامة مشري المغلفة وغير المصقول-S. تيفيموريوم على قدم المساواة.
وبعد ذلك، قمنا بتحليل الاستجابة الالتهابية الناجمة عن S. تيفيموريوم المغلفة مع البيوتين ومترافق streptavidin المغناطيسي الخرز (الشكل 3). سوبيرناتانتس من بمدمس المصابين مصقول وغير مصقول س. وقد جمعت تيفيموريوم بعد 24 ساعة إصابة مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) يفرز انترلوكين-6 (إيل-6). طلاء S. تيفيموريوم البيوتين والخرز المغناطيسي مترافق streptavidin لم تغير إلى حد كبير استجابة التهابات الضامة.
قمنا بتحليل معزولة مشري-Sلتقييم نقاء فاجوسوميس المحتوية على البكتيريا التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من إيمونوبلوتينج. استخدام أجسام مضادة محددة ضد العلامة مشري، وجدنا إثراء كبير ل التعبير عن مشري S. تيفيموريوم في فاجوسوميس معزولة بالمقارنة بالكسر سيتوسوليك التي تم الحصول عليها من نفس العينة (الشكل 4). فاجوسوميس المعزولة التي تحتوي على مشري- S. واستخدمت تيفيموريوم التي كانت غير مطلي سابقا مع البيوتين كعنصر سلبي. وتبين هذه النتائج أن هذا البروتوكول يسمح لتنقية فاجوسوميس أن يتم التخصيب في البكتيريا.
أننا بعد إجراء تحليل immunoblot علامات دخلول ويحلول في فاجوسوميس المعزولة التي تحتوي على S. تيفيموريوم (الشكل 5). ولوحظت معظم علامات دخلول ويحلول وضوح في فاجوسوميس معزولة في عدوى ما بعد 4 ح بالمقارنة مع 30 دقيقة. لوحظت في إثراء علامات اندوسومال Rab5 و Rab7، فضلا عن يحلول علامات الخامس-ATPase (الخامس0 ومفارز1 V) وكاثيبسين د،. من المثير للاهتمام، وقد لوحظ فقط شكل ملصوق كاثيبسين د في فاجوسوميس معزولة في ح 4 بعد الإصابة. انشقاق د كاثيبسين المؤيدة (كاتشين 48) لإنتاج النموذج النشط القصير (كاتشين 33) يحدث فقط في فاجوسوميس ولكن ليس في سيتوسول، مما يدل على خصوصية هذا البروتوكول لعزل يبلوع.
إذ غالباً ما يتم الكشف عن علامات من العضيات مثل الميتوكوندريا أو هيولى (ER) في الأعمال التحضيرية التي تحتوي على البكتيريا المعزولة فاجوسوميس, S. تيفيموريوم-تم سبر المحتوية على فاجوسوميس معزولة بأجسام مضادة محددة ضد الناقل الميتوكوندريا Tomm20 وكالنيكسين البروتين ER (الشكل 6). ونحن أيضا بتجربتها مع جسم مضاد ضد إنزيم تحلل جابده لتقييم التلوث سيتوسوليك في فاجوسوميس معزولة. نحن وجدنا الميتوكوندريا وعلامات ER S. تيفيموريوم-عزل فاجوسوميس لكن لا تلوث سيتوسوليك.
دراسة براعة البروتوكول لعزل فاجوسوميس المحتوية على البكتيريا، البيوتين والخرز المغناطيسي مترافق streptavidin طبق الطلاء الداخلي على بكتيريا المكوّرات سإيجابية. باستخدام تثبيت نفسه وتلطيخ البروتوكول كما هو موضح مشري-S. تيفيموريوم (الشكل 1) أكدنا بيوتينيليشن الناجحة للبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) وإذ تعرب عن-المذهبة س. (الشكل 7). وعلاوة على ذلك، اكتشفنا الإثراء من علامة دخلول Rab7 ويحلول علامات الخامس-ATPase (الخامس0 وحدة فرعية) ومعزولة كاثيبسين د بتحليل إيمونوبلوت للتجارة والنقل-المذهبة س.--التي تحتوي على فاجوسوميس (الشكل 8). فقط كان انقسام كاثيبسين د إلى شكله ناضجة يمكن اكتشافها بعد ح 4 من العدوى في عينات يبلوع معزولة ولكن ليس في الكسور سيتوسوليك. معزولة في المذهبة س-فاجوسوميس التي تحتوي على كانت خالية من التلوث سيتوسوليك كما هو موضح إيمونوديتيكتيون جابده.
وباختصار، لقد أظهرنا أن لدينا بروتوكول العزلة يبلوع يمكن عزل فاجوسوميس المحتوية على البكتيريا التخصيب، خالية من التلوث سيتوسوليك. يمكن استخدام الأعمال التحضيرية يبلوع معزولة لتحليل علامات دخلول ويحلول للدراسة فاجوسومي النضج. وعلاوة على ذلك، وقد تبين أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول للبكتيريا سلبية الغرام وإيجابية على حد سواء، وأن هذا الإجراء وضع العلامات لا يغير من الاستجابة المناعية الضامة.
الشكل 1: تحليل مجهرية Fluorescence بيوتينيلاتيد س. تيفيموريوم باستخدام Cy5-ستريبتافيدين- ولم يصب بمدمس لمدة 30 دقيقة مع مشري-S. تيفيموريوم أن بيوتينيلاتيد ("بيوتينيلاتيد S. ت.")، كما هو موضح في هذا البروتوكول. لا بيوتينيلاتيد مشري-S. تيفيموريوم ("لا بيوتينيلاتيد S. ت.") واستخدمت كعنصر سلبي. بعد التثبيت، وبيرميبيليزيشن من الخلايا، المحتضنة عينات مع Cy5-ستريبتافيدين لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. إشارة الأسفار من النواة (DAPI)، مشري-س. تيفيموريوم، Cy5-ستريبتافيدين، وحللت باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. فقط يمكن أن يتم الكشف عن إشارة من Cy5-ستريبتافيدين في البكتيريا المسمى سابقا مع البيوتين، مما يؤكد كفاءة بيوتينيليشن. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: تحليل تقنيين من بمدمس المصابين متشيري-S. تيفيموريوم المغلفة مع البيوتين والخرز المغناطيسي مترافق ستريبتافيدين. بمدمس كانوا مصابين متشيري-S.typhimurium المسمى البيوتين ومترافق streptavidin المغناطيسي الخرز كما هو موضح في هذا البروتوكول. بعد السماح الضامة فاجوسيتيزي البكتيريا لمدة 30 دقيقة، تم إصلاح الخلايا مع 4% فورمالدهايد لمدة 20 دقيقة في الرايت كانت البكتيريا المغلفة فاجوسيتيزيد التي الضامة ثم تحليلها بواسطة الفحص المجهري [كنفوكل]. أظهر التحليل أن كمية البكتيريا المغلفة ("مطلي S- ت.") يماثل مدخول البكتيريا متشيري غير مسمى ("غير مطلي S- ت.")، مما يدل على أن وسم البيوتين والخرز المغناطيسي مترافق streptavidin لا يغير من البلعمه من S. تيفيموريوم التي الضامة. كانت ملطخة نوى DAPI للتصور مجهرية. وترد البيانات يعني ± S.E.M.، وحساب الدلالة الإحصائية باستخدام الطالب t-الاختبار يتم تمثيلها ك * ف = < 0.05؛ * * ف = < 0.01؛ ف = < 0.001. شريط المقياس = 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: إفراز إيل-6 من بمدمس المصابين بالخرز المغناطيسي مترافق البيوتين streptavidin، المسمى S. تيفيموريوم مقارنة ب غير مسمى S- تيفيموريوم . بمدمس كانوا مصابين س. تيفيموريوم المغلفة مع البيوتين ومترافق streptavidin المغناطيسي الخرز كما هو موضح في هذا البروتوكول. بعد 24 ساعة إصابة، تجمعها أليسا supernatants لمزيد من التحليل لإفراز إيل-6. وتشكل سوبيرناتانتس بمدمس المصابين غير المصقول S. واستخدمت كعنصر تحكم تيفيموريوم . تحريض إفراز إيل-6 بواسطة المغلفة S. تيفيموريوم لم يكن مختلفاً إلى حد كبير مقارنة بغير المصقول S. تيفيموريوم. يتم إظهار البيانات يعني ± S.E.M.، ويتم تمثيل الدلالة الإحصائية المحسوبة باستخدام الاختبار t الطالب ك * ف = < 0.05؛ * * ف = < 0.01؛ ف = < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التخصيب الجرثومي في عزلة فاجوسوميس. تخصيب اليورانيوم ل معلم مشري س. تمت مقارنة تيفيموريوم في فاجوسوميس المعزولة التي جمعت بعد 30 دقيقة و 4 ح من العدوى للكسر سيتوسوليك. Β-أكتين استخدمت كعنصر تحكم تحميل. مراقبة سلبية تشير إلى فاجوسوميس معزولة باستخدام غير المصقول S. تيفيموريوم في 30 دقيقة بعد الإصابة. كما هو متوقع، الإخراج النهائي لعزل يبلوع استخدام غير مسمى س. لا يقدم تيفيموريوم كميات كبيرة من مشري أو β-أكتين، مما يدل على الطابع الخاص للبروتوكول. تم تحميل 20 ميكروغرام من البروتين من كل عينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: تحليل علامات دخلول ويحلول في عزلة S. تيفيموريوم--التي تحتوي على فاجوسوميس- وقد تم تحليل في إثراء علامات دخلول Rab5 و Rab7، ويحلول علامات الخامس-ATPase (الخامس0 ومفارز1 V) كاثيبسين د في عزلة S. تيفيموريوم-تحتوي على فاجوسوميس انتزعت بعد 30 دقيقة و 4 ح من الإصابة. Β-أكتين استخدمت كعنصر تحكم تحميل. تم تحميل 20 ميكروغرام من البروتين من كل عينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: تحليل الميتوكوندريا و ER وعﻻمات سيتوسوليك في عزلة S. تيفيموريوم--التي تحتوي على فاجوسوميس- علامة سيتوسوليك جابده، كالنيكسين ماركر ER وعلامة الميتوكوندريا Tomm20 في س. تحليلها من قبل إيمونوبلوتينج فاجوسوميس تيفيموريوم معزولة في 30 دقيقة وعدوى ما بعد 4 ح ومقارنة الكسور سيتوسوليك المقابلة. تم تحميل 20 ميكروغرام من البروتين من كل عينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7: تحليل تقنيين للتجارة والنقل-المذهبة س. الضامة المصابة. بمدمس كانوا مصابين S. المسمى المذهبة معربا عن البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) أيال البيوتين كما هو موضح في منهجية لتصنيف س. تيفيموريوم. بعد السماح بالضامة فاجوسيتيزي البكتيريا لمدة 30 دقيقة، كانت ثابتة في الخلايا. غير المصقول المذهبة س. ("لا بيوتينيلاتيد S. ألف") واستخدمت كمراقبة سلبية. بعد التثبيت، وبيرميبيليزيشن من الخلايا، المحتضنة عينات مع Cy5-ستريبتافيدين لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. إشارة الفلورسنت من النواة (DAPI)، التجارة والنقل-S. وجرى تحليل المذهبة، و Cy5-ستريبتافيدين بالفحص المجهري [كنفوكل]. يمكن فقط أن ينظر الإشارة من Cy5-ستريبتافيدين في البكتيريا المسمى سابقا مع البيوتين، مما يؤكد كفاءة بيوتينيليشن. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: تحليل علامات دخلول ويحلول في عزلة S. المذهبة-التي تحتوي على فاجوسوميس- S- المذهبة-تحتوي على فاجوسوميس معزولة في 30 دقيقة و 2 ح ح 4 ما بعد الإصابة، تم تحليلها بواسطة immunoblotting لعلامات فاجوسومال Rab5، Rab7، والخامس-ATPase مقارنة الكسور سيتوسوليك المقابلة. تم تحميل 20 ميكروغرام من البروتين من كل عينة. تم اختبار عينات أيضا مع جسم معين ضد جابده، مما يدل على أن تعزل S. المذهبة-التي تحتوي على فاجوسوميس خالية من التلوث سيتوسوليك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أسلوب جديد لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس بطلاء البكتيريا مع البيوتين ومترافق streptavidin المغناطيسي الخرز ويرد هنا. بعد تعطل رقيقة من غشاء الخلية، فاجوسوميس المحتوية على البكتيريا ويمكن بسهولة استخراج استخدام رف مغناطيسي. نظهر أن وسم البكتيريا يحافظ على قدرة مسببات المرض للحث على التهاب ولا يغير الخاصية متجولة للخلية المضيفة. الأهم من ذلك، فاجوسوميس التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة يتم إثراء في البكتيريا ودخلول/يحلول علامات وخالية من التلوث سيتوسوليك.
ويعرض هذا الأسلوب العديد من المزايا بالمقارنة مع أسلوب العزل يبلوع التقليدية التي توظف السكروز فصل التدرج. أنه يقضي وقتاً طويلاً خطوات الطرد المركزي متعددة، السماح للباحث التعامل مع عينات أكثر في وقت أقل والحصول على أنقى يبلوع عينات عن طريق زيادة عدد خطوات الغسيل بسهولة. استخدام هذا البروتوكول يلغي الحاجة للمعدات المتخصصة وحساسة، مثل تنبيذ فائق. يمكن تغيير خصائص حويصلات الطرد المركزي عالية السرعة وتقليل22الغلة النهائية التي يتم تجنبها في هذا البروتوكول. وقد أثبتنا أيضا أن الطلاء من س. تيفيموريوم البيوتين والخرز المغناطيسي مترافق streptavidin لا يغير من قدرة الضامة متجولة. وعلاوة على ذلك، تقلد إيل-6 التي الضامة المصابة مع المسمى S. تيفيموريوم كان دون تغيير بالمقارنة مع الضامة المصابة بالبكتيريا غير مسمى. ولذلك، طلاء س. حمل تيفيموريوم لا تغييرات كبيرة في القدرة الإمراضية بهم. على حد علمنا، طلاء س. تيفيموريوم لا تمثل عائقا لاستخدام فاجوسوميس معزولة عن أي من تقنيات التحليل المختبري المشترك.
س. تيفيموريوم-فاجوسوميس التي تحتوي على عزلة بواسطة هذا الأسلوب هي أثري في البكتيريا وهذا اندوسومال نموذجية وعلامات الليزوزومية، مثل مفارز الخامس الخامس-ATPase0 والخامس1 وفي حوزتي ناضجة ملصوق كاثيبسين د، التي يمكن الكشف عنها فقط في كسور يبلوع معزولة. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا الميتوكوندريا وعلامات ER في عزلة س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس. تفاعل فاجوسوميس لائحة درست على نطاق واسع على الرغم من أن كمية البروتينات لائحة موجودة في فاجوسوميس التي تحتوي على مسببات المرض قد تختلف مع الممرض درس ونوع الخلية. على سبيل المثال، غنية فاجوسوميس التي تحتوي على الإجهاض البروسيلا المعزولة من البالعات نونبروفيسيونال في أية علامات23 ولكن ليست تلك المعزولة من الضامة24. وقد اكتشفت كالنيكسين سابقا في س. فاجوسوميس المحتوية على تيفيموريوم معزول بواسطة التدرج السكروز18. وكان التفاعل الوثيق بين فاجوسوميس الخاملة المحتوية على حبة والميتوكوندريا أيضا ذكر سابقا25، موضحاً أن وجود Tomm20 في فاجوسوميس معزولة. وجدت البروتينات المتقدرية في فاجوسوميس المعزولة التي تحتوي على المستروحة ل26 أو27من بكتريا. ومع ذلك، غالباً ما يعتقد الكشف عن مكونات الميتوكوندريا في الأعمال التحضيرية فاجوسوميس التي تحتوي على الكائنات الممرضة المعزولة باستخدام أسلوب الطرد المركزي التدرج السكروز بسبب كثافة مماثلة لهذا عضية يبلوع التي تحتوي على مسببات الأمراض، ومن ثم غير محدد28. لدينا طريقة يتفادى مشكلة تلوث ويوفر معلومات موثوقة أكثر مما يوحي بأن أغشية الميتوكوندريا قد تختلط مع الأغشية فاجوسومال. وخلاصة القول، فإنه سيكون من الصعب تجنب ER وعلامات المتقدرية في احتواء الممرض معزولة الاستعدادات فاجوسوميس، تبعاً لنوع الخلية المضيفة ومسببات المرض. الأسلوب المستحسن لتحقق نقاء فاجوسوميس معزولة ﻻستخدام المعلمة-البكتيريا والأجسام المضادة للعلامة المحددة للكشف عن البكتيريا "الغربية لطخة". نعرض أيضا أن هذا الأسلوب العزلة يمكن تكييفها للكائنات المجهرية الأخرى مع مجموعات أمين السطحية المتاحة التي يمكن أن تكون بيوتينيلاتيد. على سبيل مثال، نحن قد طبقت بنجاح لدينا بروتوكول لعزل المذهبة س.--التي تحتوي على فاجوسوميس. فاجوسوميس التي تحتوي على س المذهبة معزولة باستخدام هذا البروتوكول هي أثري في علامات يحلول ودخلول مثل الخامس-ATPase (الخامس0 وحدة فرعية) و Rab7، على التوالي، ولكن لا تطرح علامات سيتوسوليك مثل جابده.
حويصلات اندوسومال/فاجوسومال توفر بيئات فريدة من نوعها لتدهور المواد المسببة للأمراض، ولكن الحفاظ على المستضدات ليشير إلى الجهاز المناعي التكيفي. على الرغم من ذلك، قد تم على نطاق واسع على التحقيق فاجوسوميس وعملية النضج، المكروية في يبلوع عند استضافة مسببات الأمراض المختلفة لا يزال بعيد المنال. من غير الواضح أيضا كيف يغير التغييرات الأيضية في الخلايا يبلوع النضج ومحتواه. ولذلك، البروتوكول بالتفصيل هنا يعطي المزيد من الفرص لدراسة نشوء حيوي يبلوع ووظيفتها في سياق مختلف الأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
البحوث في مختبر لروبنسون هي مدعومة بتمويل من "كولونيا التميز الكتلة" على "استجابات الإجهاد الخلوية" في "الأمراض أجينجاسوسياتيد"، جامعة كولونيا، ألمانيا (سكاد؛ تمولها DFG ضمن "مبادرة الامتياز" للحكومة الاتحادية الألمانية و الدولة الحكومات) والمنح المقدمة من دويتشه الأوقيانوغرافية (SFB 670) وثروة كولون ومؤسسة ماريا Pesch من جامعة كولونيا، ألمانيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
