Summary
Vi beskriver her en enkel og hurtig metode til isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende phagosomes fra makrofager ved belægning bakterier med biotin og streptavidin.
Abstract
Salmonella typhimurium er en fakultativ intracellulær bakterie, der forårsager gastroenteritis hos mennesker. Efter invasionen af lamina propria, S. typhimurium bakterier er hurtigt opdaget og phagocytized af makrofager, og indeholdt i vesikler kendt som phagosomes for at blive nedbrudt. Dyrkning af S. typhimurium-indeholdende phagosomes har været meget anvendt til at undersøge hvordan S. typhimurium infektion ændrer proces phagosome modningsproces at forhindre bakteriel nedbrydning. Klassisk, dyrkning af bakterier-holdige phagosomes er udført af saccharose gradient centrifugering. Men denne proces er tidskrævende, og kræver specialiseret udstyr og en vis smidighed. Beskrevet her er en enkel og hurtig metode til isolering af S. typhimurium-indeholdende phagosomes fra makrofager ved belægning bakterier med biotin-streptavidin-konjugeret magnetiske perler. Phagosomes opnået ved denne metode kan suspenderes i en buffer af valg, så udnyttelsen af isolerede phagosomes for en bred vifte af assays, såsom protein, metabolit, og lipid analyse. I Resumé, denne metode til dyrkning af S. typhimurium-indeholdende phagosomes er konkrete, effektive, hurtige, kræver minimum udstyr, og er mere alsidige end den klassiske metode til isolation af saccharose gradient-ultracentrifugering.
Introduction
Makrofager cirkulerer specialiserede fagocyterende celler, der registrerer, opsluge og nedbryde enhver udenlandsk partikel stede i perifere væv, lige fra apoptotiske celler til invaderende mikroorganismer såsom bakterier. På overfladen receptor-medieret anerkendelse af patogenet specifikke markører ofte er til stede på overfladen af mikroorganismer (kendt som patogen-associeret molekylære mønstre eller PAMPs), indlede makrofager en kompleks reorganisering af cellulære membran i ordre til surround og phagocytize patogen1.
Engulfed patogenet findes derefter af makrofager i en intracellulær vesikel, kaldet phagosome. Gennem en serie af fusion og fission arrangementer med andre vesikler som endosomes og lysosomer erhverver patogen-holdige phagosome et sæt af proteiner kræves for afskaffelse af phagosomal indhold. Derfor, den enzymatiske sammensætning af phagosome er meget varierende i løbet af denne proces, kaldet phagosome modning2.
Kort efter fagocytose, multimeriske komplekse vakuolære ATPase (v-ATPase) er indarbejdet i phagosome membran ved fusion med endosomes3. Dette kompleks udnytter ATP at pumpe protoner fra cytosol til lumen af phagosome4. Forsuring af phagosome er afgørende for hændelserne fusion med andre vesikler5 og aktivering af et stort antal pH-afhængige degradative enzymer6. En anden multimeriske enzymatisk kompleks, der er hurtigt samlet på phagosome membran er NADPH-oxidase (NOX) kompleks. NOX komplekse oxiderer NADPH for at producere reaktive ilt arter (ROS) der udskilles i phagosome lumen og at bidrage væsentligt til drabet på opslugte mikroorganismer7.
Under de indledende trin i modning præsentere phagosomes markører typisk som Rab5 og Rab7 af tidlige og sene endosomes henholdsvis sammen med V0 underenhed af v-ATPase8. Fusion af phagosomes med lysosomer og sen endosomes resulterer i phagocytized patogenet eksponering for en bred vifte af hydrolytiske enzymer såsom cathepsin proteaser, lipaser og β-galactosidase9. Forsuring af lumen er også nødvendigt for aktivering af disse enzymer. For eksempel, er spaltning af cathepsin D til at producere aktive kort form pH-afhængige10. Disse enzymer nedbrydes patogenet og mægle produktion af patogen-afledte kort peptider, der præsenteres af makrofag store histocompatibility complex (MHC) klasse II molekyler til T-celler til at udløse en adaptive immunrespons11.
Dermed phagosome modning er afgørende for det medfødte immunforsvar og links innat og adaptiv armene af immunsystemet. Det er ingen overraskelse, at patogener har udviklet strategier til at overvinde eliminering af makrofager gennem de ovenfor beskrevne proces af phagosome modning. For eksempel, forhindre de intracellulære bakterier Mycobacterium tuberculosis og Legionella pneumophila phagosome modning af hæmmende v-ATPase forsamling og deraf følgende lumen forsuring12,13 . Andre bakterier såsom Listeria monocytogenes eller Shigella flexneri fremkalde pore dannelse i phagosome membranen at flygte ind i cytosol14,15. På anden side, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) er i stand til at ændre egenskaberne af phagosome i vacuole at omdanne det til et egnet sted for replikering16. Denne evne gør S. typhimurium en meget interessant model til at studere patogen-medieret indblanding af phagosome modning.
S. typhimurium er en fakultativ intracellulær bakterie, der forårsager gastroenteritis hos mennesker. Efter invasionen af lamina propria, S. Typhimurium bakterier er hurtigt opdaget og phagocytized af makrofager, og indeholdt i phagosomes17. Nogle rapporter har tidligere beskrevet S. typhimurium-indeholdende phagosomes præsentere beslutningstagere for både endosomes og lysosomer18, og andre undersøgelser har fundet phagosome-lysosomet fusion forhindret ved S. Typhimurium infektion19.
I første omgang phagosome modning på S. typhimurium infektion har været undersøgt ved immunfluorescens mikroskopi. Udviklingen af teknikker til dyrkning af bakterier-holdige phagosomes aktiveret en mere nøjagtig undersøgelse af phagosome indhold i form af endosome og lysosomet markører. Til dato, den vigtigste metode anvendes til isolering af bakterier-holdige phagosomes er subcellulært fraktionering saccharose trin forløb18,20. Denne metode kræver imidlertid flere centrifugering trin, der kan forårsage mekaniske skader på phagosomes, kan påvirke stabiliteten af phagosomal komponenter (proteiner og lipider) og er tidskrævende. Desuden, det kræver brug af en ultracentrifuge: et stykke af specialiseret udstyr, der ikke er tilgængeligt for hvert laboratorium.
For nylig, en ny tilgang er blevet anvendt til isolering af bakteriel-holdige phagosomes, hvori bakterielle patogener er mærket med biotinylated lipopetide (Lipobiotin) og senere udvundet ved hjælp af streptavidin-konjugeret magnetiske perler21 . Vi foreslår en alternativ supplerende metode af mærkning bakteriel overflade Amin-holdige makromolekyler med NHS-Biotin efterfulgt af streptavidin-konjugeret magnetiske perler. Phagosomes opnået ved denne metode er stærkt beriget i endosome og lysosomet markører og kan bruges til en bred vifte af assays, fra proteinanalyse omik analyse. Derudover, kræver det ikke specialiseret udstyr såsom Ultracentrifuger. Desuden ved at fjerne centrifugering skridt, er både den mekaniske skader på phagosomes og den tid ansat betydeligt reduceret. Denne metode kan tilpasses nemt til isolering af phagosomes indeholdende andre bakterier, såsom Gram-positive Staphylococcus aureus, også medtaget i dette håndskrift. I Resumé, denne metode til dyrkning af S. typhimurium-indeholdende phagosomes er en enkel, omkostningseffektivt og mindre tidskrævende end den klassiske isolation af saccharose gradient-ultracentrifugering, rendering højt beriget bakterier-holdige phagosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle de trin, der involverer brugen af patogene S. typhimurium foretages i en BSL-2 eller højere biologisk sikkerhed plan anlæg. Kultur og belægning af S. Typhimurium samt infektion af knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs), som skal udføres under en laminar flow hætte til at forhindre forurening. Dyrkning af S. typhimurium-indeholdende phagosomes kan udføres på ethvert BSL-2 laboratoriebænk.
udvinding af knoglemarv fra mus til dens differentiering af makrofager blev udført efter institutionelle retningslinjer om dyrevelfærd og godkendt af det Nordrhein-westfalske statslige agentur for naturen, Miljø og Forbrugerbeskyttelse [Landesamt für Natur, Umwelt og Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; File no: 84-02.05.40.14.082 og 84-02.04.2015.A443] og universitetet i Köln.
1. Culturing S. typhimurium
- Inoculate S. typhimurium (SL1344 stamme) fra en enkelt bakteriel koloni i 5 mL af hjernen hjerte infusion (BHI) bouillon ved hjælp af en bakteriel løkke.
- Ruger den bakterielle suspension i en inkubator ved 37 ° C natten over med rysten.
- Den følgende dag, overføres 1 mL af den bakterielle suspension til 19 mL BHI bouillon i en konisk kolbe og inkuberes ved 37 ° C i en inkubator under omrystning.
- Overvåge S. typhimurium vækst ved at måle det optisk densitet (OD) på 600 nm (OD 600) med et spektrofotometer. Målinger bør tages ca hver 30 min.
- Når OD 600 når 1.0, fjernes bakteriel suspension fra rugemaskinen, og overførslen til 50 mL tube. Centrifugeres bakterier på 5.400 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspend i 10 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Der centrifugeres ved 5.400 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspend bakterier i 4.9 mL steril PBS.
2. Belægning af S. typhimurium med NHS-Biotin/Streptavidin-konjugeret magnetiske perler
- tilsættes 100 µL af 10 mg/mL biotin forbinder løsning (NHS-Biotin opløst i dimethylsulfoxid, DMSO) frisklavet til bakteriel suspension rede i det forrige trin. For eksempel, fortyndes 5 mg af NHS-Biotin i 0,5 mL sterilt DMSO. Mix ordentligt af pipettering op og ned flere gange.
- Split mix i fem 1,5 mL rør.
- Incubate i 2 timer ved stuetemperatur (RT) på en thermoblock med konstant ryster på 350 rpm.
- Centrifugeres rør ved 15.000 x g i 10 min. ved RT og supernatanten.
- Resuspend i 1 mL steril PBS, centrifugeres ved 15.000 x g i 10 min. ved RT og supernatanten.
- Gentag trin 2.5 to gange mere til helt for at fjerne den overskydende biotin forbinder løsning.
- Efter den sidste vask, resuspenderes i 1 mL steril PBS.
- Overføre 100 µL af 10 mg/mL streptavidin-konjugeret magnetiske perler løsning til en 1,5 mL tube og forlade det på den magnetiske rack i 5 min.
- Fjerne opløsningsmiddel med en pipette, tage streptavidin-konjugeret magnetiske perler løsning fra magnetiske rack og resuspend det med 1 mL af biotin belagt bakteriel suspension forberedt i trin 2.7.
- Incubate 1 h i RT på en thermoblock med konstant ryster på 350 rpm.
- Placerer løsningen på den magnetiske rack; vente i 5 min og derefter fjernes med en pipette bakterier, der ikke kunne placeres på væggen (holde det i en tube mærket som " ikke-belagt bakterier "). Den brøkdel fastholdelsen af mur af røret i kontakt med magneten er biotin/streptavidin-belagt bakterier.
- Fjerne røret indeholder mærket bakterier fra magnetiske rack og resuspend i 1 mL steril PBS.
- Sted det igen på den magnetiske rack, vente i 5 min, og bruge en pipette til at fjerne PBS.
- Gentag trin 2.13 og 2.14 to gange mere til at fjerne alle bakterier, der ikke er belagt med de streptavidin-konjugeret magnetiske perler.
- Efter den sidste vask, resuspend belagt-bakterier i 500 µL sterilt PBS og mærke tube som " belagt bakterier ".
- Tæller kolonidannende enheder (cfu) af begge " ikke-belagt bakterier " og " belagt bakterier " løsninger ved plettering serielle fortyndinger på BHI agar plader. Ca 2 x 10 8 cfu/mL af belagt bakterier er fremstillet af 20 mL af indledende bakteriel suspension med OD 600 1.0. Holde belagt bakteriel suspension ved 4 ° C skal anvendes på den følgende dag for at inficere makrofager.
3. Infektion af BDMDs
- samme dag når bakterierne er belagt med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler, plade fuldt differentierede BMDMs 22 i 6 cm retter med en tæthed på 5 x 10 6 celler pr. fad.
- Den næste dag, centrifugeres belagt bakteriel suspension på 15.000 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspend i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) i en koncentration på 10 x 10 6 cfu/mL.
- Til at inficere makrofager på en mangfoldighed af infektion (MOI) 10, fjerne medium fra BMDMs og tilsættes 5 mL af belagt bakteriel suspension forberedt. Optimal MOI kan vurderes for hver celletype eller eksperimentelle formål af de isolerede phagosomes.
- Incubate på RT for 10 min at synkronisere fagocytose.
- Incubate ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator for 30 min at indlede fagocytose. Andre celletyper kan kræve forskellige inkuberingstider at sikre internalisering af bakterierne.
- Fjerne de bakterier, der indeholder medium fra opvasken og cellerne vaskes med RPMI tre gange for at fjerne ikke-internaliseret bakterier.
- Endelig tilsættes 10 mL af RPMI indeholdende 10% FBS og 50 µg/mL phosphatbufferet at dræbe enhver ikke-phagocytized bakterier.
- Ruger de inficerede BMDMs ved 37 ° C med 5% CO 2, indtil den ønskede tid punkt. Den ønskede tidspunkt skal bestemmes eksperimentelt bakterier og celletype bruges og formålet med analysen. For studiet af tidlige phagosome-endosome fusion begivenheder i S. Typhimurium-inficeret BMDMs, en 30 min inkubation anbefales. For analyse af senere begivenheder, kan phagosomes udvindes efter 2 h eller 4 h inkubation. Længere tids inkubation af makrofager med S. Typhimurium over 24 h resulterer i døden af makrofager. Udvidet intracellulære infektion, før phagosome udvinding kan formentlig føre til nedbrydning af biotin molekyler. Men vi ikke har overholdt tab af biotin på belagt bakterier indtil 24 h.
4. Dyrkning af S. typhimurium-indeholdende Phagosomes
- Forbered mængden af krævede phagosome isolation buffer en (50 mM rør, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) ved at tilføje dithiothreitol (DTT) til en endelig koncentration på 1 mM, Cytochalasin B til en finale koncentrationen af 10 µM, og protease og fosfatase hæmmere som anbefalet af fabrikanten.
Bemærk: DTT og Cytochalasin B skal føjes til phagosome isolation buffer A altid umiddelbart før brug. Cytochalasin B forstyrrer cytoskeleton, lette ruptur af cellemembranen. - På det ønskede tidspunkt punkt, fjerne medium fra de inficerede celler og vask med steril PBS varmet til RT.
- Tilføje 750 µL af phagosome isoleret buffer A pr parabol og inkuberes 20 min på is. Når du bruger forskellige celle numre, mængden af isolation buffer A bør justeres proportionalt.
- Tilføje 250 µL af phagosome isolation buffer B (50 mM rør, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol og 68 mM saccharose). Rock plade til at sikre, at bufferen når den komplette overflade af fadet. Når du bruger forskellige celle numre, mængden af isolation buffer B bør justeres proportionalt.
- Fjerne celler fra skålen ved at skrabe forsigtigt ved hjælp af en gummi politimand og overføre dem til en pre kølet 1,5 mL tube.
- Passere cellesuspension gennem en 26G kanyle ved hjælp af en 1 mL sprøjte mindst 15 gange (ene ambition plus en udslyngning af celle suspension tæller som én gang). Dette er nok til at frigive det cytosole indhold af BMDMs. Antallet af passerer gennem nålen skal være optimeret til enhver celletype.
- Placer cellesuspension på den magnetiske rack og vente 5 min. Partiklerne knyttet til magneten er de phagosomes, der indeholder belagt - S. Typhimurium. Suspensionen indeholder resten af cellulære komponenter.
- Overføre suspension i en 1,5 mL rør mærket som " cytosol ".
- Fjerne røret med de isolerede phagosomes fra den magnetiske rack og resuspend dem i 1 mL steril PBS.
- Placer phagosome suspension på den magnetiske rack, vente i 5 min, og fjern PBS.
- Gentag trin 4.9 og 4.10 at vaske den isolerede S. typhimurium-indeholdende phagosomes.
- Endelig fjerne PBS og resuspend phagosomes i den krævede buffer, f.eks. i en radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer til proteinanalyse. Ca 50-200 µg protein er opnået pr. prøve efter denne protokol, afhængigt af den oprindelige mængde af celler og MOI infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyrkning af bakterier-holdige phagosomes ved denne protokol kræver biotinylation af bakterier som et første skridt. Vi derfor vurderes effektiviteten af S. typhimurium biotinylation konfokalmikroskopi analyse af BMDMs inficeret med biotinylated mCherry -S. typhimurium mærket med Cy5-Streptavidin. Kort, BMDMs var smittet som beskrevet i denne protokol med mCherry -S. typhimurium tidligere biotinylated men ikke inkuberes med streptavidin-konjugeret magnetiske perler. Efter 30 min inkubation ved 37 ° C, blev cellerne vaskes med varmt PBS og fast med 4% formaldehyd for 20 min på RT. fiksering blev stoppet af omfattende vask med PBS. Cellerne blev derefter permeabilized med 3% Triton i PBS for 5 min på RT. inficeret BMDMs blev derefter inkuberes med Cy5-Streptavidin i 20 min. ved 4 ° C. Efter omfattende vask, blev prøverne udarbejdet for analyse af Konfokal mikroskopi (figur 1). Ikke biotinylated mCherry -S. Typhimurium blev brugt som negativ kontrol. Fluorescerende signal fra Cy5-Streptavidin blev observeret udelukkende i biotinylated mCherry -S. typhimurium, bekræfter, at biotinylation af bakterierne var vellykket. Mikroskopiske analyse blev udført på en Konfokal mikroskop ved hjælp af "60 X O2 NA: 1,40" mål. Excitation bølgelængder for fluorokromer var 405 nm (DAPI), 559 nm (mCherry), og 635 nm (Cy5), og ydelse spænding blev sat på 574v, 565v og 443v, henholdsvis.
Siden immun reaktion udløst i makrofager af S. typhimurium er stort set afhængig af makrofag overflade receptor aktivering af bakterielle ligander, testede vi næste hvis overfladebehandling af S. typhimurium med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler kan ændre den medfødte immunrespons i inficeret BMDMs. Vi vurderede først om belægning af S. typhimurium kunne ændre BMDMs fagocyterende kapacitet af Konfokal mikroskopi. BMDMs var smittet som beskrevet i denne protokol med mCherry -S. Typhimurium belagt med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler eller Ubestrøget mCherry -S. typhimurium. Efter 30 min inkubation ved 37 ° C, blev cellerne vaskes med varmt PBS og fast med 4% formaldehyd i 20 min. på RT. Efter omfattende vask med PBS, blev prøverne udarbejdet for analyse af Konfokal mikroskopi. Som vist i figur 2, makrofager phagocytized bestrøget og ubestrøget papir mCherry -S. typhimurium ligeligt.
Næste, vi analyseret den inflammatoriske reaktion udløst af S. typhimurium belagt med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler (figur 3). Supernatanter fra de BMDMs, der er inficeret med bestrøget og ubestrøget S. typhimurium blev indsamlet efter 24 h smittekilde for enzymmaerket assay (ELISA) udskilles interleukin-6 (IL-6). Belægning af S. typhimurium med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler ikke væsentligt ændrer det inflammatoriske respons af makrofager.
For at vurdere renhedsgraden af bakterier-holdige phagosomes opnået ved at ansætte denne protokol analyserede vi isolerede mCherry -S. typhimurium-indeholdende phagosomes af immunoblotting. Brug af specifikke antistoffer mod mCherry tag, fundet vi betydelige berigelse af mCherry at udtrykke S. typhimurium i isolerede phagosomes i forhold til det cytosole brøkdel fremstillet af den samme prøve (figur 4). Isolerede phagosomes indeholdende mCherry - S. typhimurium der ikke var tidligere belagt med biotin blev brugt som en negativ kontrol. Disse resultater viser, at denne protokol giver mulighed for rensning af phagosomes, der er stærkt beriget med bakterier.
Vi næste udført immunblot analyse af endosome og lysosomet markører i isolerede phagosomes indeholdende S. typhimurium (Figur 5). De fleste af endosome og lysosomet markørerne blev tydeligt observeret i phagosomes isoleret på 4 h efter infektionen i forhold til 30 min. Berigelse af endosomal markører Rab5 og Rab7, samt lysosomet markører v-ATPase (både V0 og V1 underenheder) og cathepsin D, blev observeret. Interessant, blev kun kløvet form af cathepsin D i isolerede phagosomes på 4 h efter infektionen observeret. Kløvningen af Pro cathepsin D (48 kDa) til at producere den korte aktive form (33 kDa) kun forekommer i phagosomes, men ikke i cytosol, demonstrerer specificiteten af denne protokol for phagosome isolation.
Da markører fra organeller som mitokondrier eller endoplasmatiske reticulum (ER) er ofte fundet i forberedelserne af bakterier-holdige isoleret phagosomes, S. typhimurium-indeholdende isolerede phagosomes var probed med specifikke antistoffer mod den mitokondrielle transporter Tomm20 og ER protein calnexin (figur 6). Vi har også testet dem med et antistof mod glykolyse enzym GAPDH at vurdere cytosole forurening i de isolerede phagosomes. Vi fandt både mitokondrier og ER markører i S. typhimurium-isoleret phagosomes men ingen cytosole forurening.
For at studere alsidigheden af protokollen til isolering af bakterier-holdige phagosomes, biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler blev belægning procedure anvendt til Gram-positive bakterien S. aureus. Ved at ansætte de samme fiksering og farvning protokol, som beskrevet for mCherry -S. typhimurium (Figur 1) vi bekræftet succes biotinylation af grøn fluorescerende proteiner (NGL) udtrykker -S. aureus (figur 7). Desuden, vi opdaget berigelse af endosome markøren Rab7 og lysosomet markører v-ATPase (V0 subunit) og cathepsin D immunblot analyse af isoleret normal god landbrugspraksis -S. aureus-indeholdende phagosomes (figur 8). Spaltning af cathepsin D i sin modne form var kun påvises efter 4 h af infektion i isolerede phagosome prøver, men ikke i de cytosole fraktioner. Isoleret S. aureus-indeholdende phagosomes var fri for cytosole kontamination, som det fremgår af immunodetection af GAPDH.
I sammendrag, har vi vist, at vores phagosome isolation protokollen gør det muligt for isolering af højt beriget bakterier-holdige phagosomes, fri for cytosole kontamination. Isolerede phagosome præparater kan bruges til analyse af endosome og lysosomet markører til at studere phagosome modning. Desuden blev det vist at denne protokol kan bruges til både Gram-negative og Gram-positive bakterier, og at proceduren mærkning ikke ændrer immunresponset af makrofager.
Figur 1: Fluorescens mikroskopi analyse af biotinylated S. typhimurium ved hjælp af Cy5-Streptavidin. BMDMs var smittet i 30 min med mCherry -S. typhimurium der var biotinylated ("Biotinylated Sørensen. T."), som beskrevet i denne protokol. Ikke biotinylated mCherry -S. typhimurium ("Ikke biotinylated S. T.") blev brugt som en negativ kontrol. Efter fiksering og permeabilization af cellerne, blev prøverne inkuberet med Cy5-Streptavidin i 20 min. ved 4 ° C. Fluorescens signal fra kernen (DAPI), mCherry -S. typhimuriumog Cy5-Streptavidin blev analyseret ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Signal fra Cy5-Streptavidin kunne kun påvises i bakterier tidligere mærket med biotin, hvilket bekræfter effektiv biotinylation. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mikroskopiske analyse af BMDMs inficeret med mCherry -S. typhimurium belagt med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler. BMDMs var inficeret med mCherry -S.typhimurium mærket med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler som beskrevet i denne protokol. Efter at tillade makrofager at phagocytize bakterier i 30 min, blev celler fastsat med 4% formaldehyd i 20 min. på RT. De coatede bakterier phagocytized af makrofager blev derefter analyseret af Konfokal mikroskopi. Analysen viste, at indtagelse af belagt bakterier ("Coated S. T.") kan sammenlignes med indtagelse af umærkede mCherry bakterier ("ikke belagt S. T."), viser, at mærkning med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler ændrer ikke ved fagocytose af S. typhimurium af makrofager. Kerner blev farvet med DAPI for mikroskopi visualisering. Tallene vises som betyder ± S.E.M., og den statistiske signifikans beregnes ved hjælp af student t-test er repræsenteret som * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001. Skalalinjen = 40 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: IL-6 sekretion af BMDMs inficeret med biotin-og-streptavidin-konjugeret magnetiske perler, mærket S. typhimurium sammenlignet med umærkede S. typhimurium . BMDMs var smittet med S. typhimurium belagt med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler som beskrevet i denne protokol. Efter 24 timer af infektion, blev analysere indsamlet til videre analyse af IL-6 sekretion af ELISA. Analysere danne BMDMs inficeret med ubestrøget S. typhimurium blev brugt som et kontrolelement. Induktion af IL-6 sekretion af belagt S. typhimurium var ikke signifikant forskellig i forhold til ubestrøget S. typhimurium. Tallene vises som betyder ± S.E.M., og den statistiske signifikans beregnes ved hjælp af student t-test er repræsenteret som * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: bakteriel berigelse i isolerede phagosomes. Tilsætning af mCherry-mærkede S. typhimurium i isolerede phagosomes indsamlet efter 30 min og 4 h af infektion sammenlignet med det cytosole brøkdel. Β-actin blev brugt som en loading kontrol. Den negative kontrol refererer til phagosomes isoleret ved hjælp af ubestrøget S. typhimurium på 30 min efter infektionen. Som forventet, det endelige output af phagosome isolation ved hjælp af umærket S. typhimurium frembyder ikke betydelige mængder af mCherry eller β-actin, demonstrerer specificiteten af protokollen. 20 µg protein blev indlæst pr. prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Analyse af endosome og lysosomet markører i isolerede S. typhimurium-indeholdende phagosomes. Berigelse af endosome markører Rab5 og Rab7, og lysosomet markører v-ATPase (V0 og V1 underenheder) og cathepsin D blev analyseret i isolerede S. typhimurium-indeholdende phagosomes udtrukket efter 30 min og 4 h af infektion. Β-actin blev brugt som en loading kontrol. 20 µg protein blev indlæst pr. prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Analyse af mitokondrier, ER og cytosole markører i isolerede S. typhimurium-indeholdende phagosomes. Det cytosole markør GAPDH, ER markør calnexin og mitokondriel markør Tomm20 i S. typhimurium phagosomes isoleret på 30 min og 4 h efter infektionen blev analyseret af immunoblotting og i forhold til de tilsvarende cytosole fraktioner. 20 µg protein blev indlæst pr. prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Mikroskopiske analyse af normal god landbrugspraksis -S. aureus inficerede makrofager. BMDMs var smittet med S. aureus udtrykker grøn fluorescerende proteiner (NGL) mærket trådløsth biotin som beskrevet i metode for mærkning S. typhimurium. Efter at tillade makrofager at phagocytize bakterier i 30 min, blev cellerne fastsat. Ubestrøget S. aureus ("ikke biotinylated S. A.") blev brugt som negativ kontrol. Efter fiksering og permeabilization af cellerne, blev prøverne inkuberet med Cy5-Streptavidin i 20 min. ved 4 ° C. Den fluorescerende signal fra kernen (DAPI), normal god landbrugspraksis -S. aureus, og Cy5-Streptavidin blev analyseret af Konfokal mikroskopi. Signalet fra Cy5-Streptavidin kunne kun ses i bakterier tidligere mærket med biotin, bekræfter effektiv biotinylation. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Analyse af endosome og lysosomet markører i isolerede S. aureus-indeholdende phagosomes. S. aureus-indeholdende phagosomes isoleret på 30 min, 2 h og 4 h efter infektionen, blev analyseret af immunoblotting for phagosomal markører Rab5, Rab7 og v-ATPase i forhold til de tilsvarende cytosole fraktioner. 20 µg protein blev indlæst pr. prøve. Prøverne blev også testet med et specifikt antistof mod GAPDH, demonstrerer, at isoleret S. aureus-indeholdende phagosomes er fri for cytosole kontamination. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En ny metode til dyrkning af S. typhimurium-indeholdende phagosomes af belægning bakterier med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler er beskrevet her. Efter blid afbrydelse af cellemembranen, kan bakterier-holdige phagosomes nemt udtrækkes ved hjælp af en magnetisk rack. Vi viser, at mærkning af bakterier bevarer patogenet evne til at fremkalde betændelse og ændrer ikke egenskaben fagocyterende af cellen vært. Vigtigere, phagosomes opnået ved denne metode er beriget med bakterier og endosome/lysosomet markører og blottet for cytosole forurening.
Denne metode indebærer flere fordele i forhold til den traditionelle phagosome isolation metode, der beskæftiger saccharose gradient adskillelse. Det fjerner den tidskrævende flere centrifugering trin, så forskeren til at håndtere flere prøver på mindre tid og få renere phagosome prøver af let stigende antal vaske trin. Anvendelse af denne protokol eliminerer behovet for specialiseret og følsomt udstyr, såsom ultracentrifugering. Hurtig centrifugering kunne ændre Karakteristik af vesikler og reducere det endelige udbytte22, der er undgået i denne protokol. Vi har også vist, at overfladebehandling af S. typhimurium med biotin og streptavidin-konjugeret magnetiske perler ændrer ikke den fagocyterende kapacitet af makrofager. Derudover mærket induktion af IL-6 af makrofager inficeret med S. typhimurium var uændret i forhold til makrofager inficeret med umærkede bakterier. Derfor belægning af S. Typhimurium medfører ikke væsentlige ændringer i deres sygdomsfremkaldende evne. Til vores viden, belægning af S. typhimurium repræsenterer ikke en hindring for brugen af de isolerede phagosomes for nogen af de fælles laboratorium analyseteknikker.
S. typhimurium-indeholdende phagosomes isoleret ved denne metode er beriget med bakterier og nuværende typiske endosomal og lysosomale markører, som v-ATPase underenheder V0 og V1 og den kløvet modne protease cathepsin D, som kan registreres kun i de isolerede phagosome fraktioner. Derudover fandt vi mitokondrier og ER markører i isolerede S. typhimurium-indeholdende phagosomes. Samspillet mellem phagosomes og Skadestuen er blevet bredt undersøgt, selv om mængden af proteiner fra Skadestuen i patogen-holdige phagosomes kan variere med patogenet studerede og celletype. For eksempel, er phagosomes der indeholder Brucella abortus isoleret fra nonprofessional fagocytter rige på ER markører23 , men ikke dem isoleret fra makrofager24. Calnexin er fundet tidligere i S. Typhimurium-holdige phagosomes isoleret af saccharose gradient18. Tæt samspil af inert perle-holdige phagosomes og mitokondrier har også været tidligere rapporteret25, forklarer tilstedeværelsen af Tomm20 i isolerede phagosomes. Mitokondrielle proteiner er blevet fundet i isolerede phagosomes indeholdende L. pneumophila26 eller Mycobacterium27. Dog påvisning af mitokondrier komponenter i forberedelserne af isolerede patogen-holdige phagosomes ved hjælp af metoden saccharose gradient centrifugering ofte menes at være som følge af denne organelle lignende befolkningstæthed og de patogenet-holdige phagosome og derfor uspecifik28. Vores metode undgår forurening spørgsmål og giver mere pålidelige oplysninger tyder på, at mitokondrie membraner kan blande sig med de phagosomal membraner. Sammenfattende, vil det være vanskeligt at undgå ER og mitokondriel markører i patogen-holdige isoleret phagosomes præparater, afhængigt af værten celletype og patogenet. Den anbefalede metode til verifikation af renhed af de isolerede phagosomes er at bruge mærket bakterier og specifikke tag antistoffer til påvisning af bakterier af Western Blot. Vi viser også, at denne isolation metode kan tilpasses til andre mikroorganismer med tilgængelige overflade amine grupper, der kan være biotinylated. Som et eksempel, har vi med succes anvendt vores protokol for at isolere S. aureus-indeholdende phagosomes. Phagosomes indeholdende S. aureus isoleret ved hjælp af denne protokol er beriget i lysosomet og endosome markører som v-ATPase (V0 subunit) og Rab7, henholdsvis, men præsentere ikke cytosole markører som GAPDH.
Endosomal/phagosomal vesikler giver unikke miljøer for nedbrydningen af patogener, men bevare antigener for at signalere den adaptive immunsystem. Selv om phagosomes og modning processen er blevet grundigt undersøgt, mikromiljø i phagosome ved hosting forskellige patogener er fortsat undvigende. Det er også uklart hvordan metaboliske ændringer i celler, ændre phagosome modning og dens indhold. Derfor, protokollen detaljeret her giver flere muligheder for at studere phagosome Biogenese og dets funktion i forbindelse med forskellige patologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forskning i Robinson's lab er støttet af midler fra Köln Excellence klynge på cellulært Stress respons i Aging-Associated sygdomme, universitetet i Köln, Tyskland (CECAD, finansieret af DFG inden for Excellence initiativ af det tyske føderale og staten regeringer) og tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln formue og Maria-Pesch fundament af universitetet i Köln, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
