Summary
우리는 vivo에서 이미징 방법 성인 Sprague-Dawley 쥐에 contusive 척수 상해 다음 동적 척추 혈관 변화 추적 하기 위한 두 개의 서로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 소개 합니다.
Abstract
척수 상해 (SCI) 상해의 사이트에 중요 한 혈관 장애를 발생합니다. 혈관 병 리 과학 후 즉시 발생 하 고 급성 부상 단계에 걸쳐 계속 됩니다. 사실, 내 피 세포 contusive 문화 후에 먼저 표시 혈액 척수 장벽 (BSCB)의 증가 된 침투성을 포함 한 초기 혈관 이벤트 vasogenic 부 종 유발 하 고 복잡 한 부상 메커니즘에 의해 발생 하는 해로운 2 차 부상 이벤트에 기여. 혈관 장애를 대상으로 따라서, 수 과학 후 조직학 및 기능 장애에 기여 하는 보조 부상 계곡을 줄이기 위해 핵심 전략 이전 연구와 사후 샘플에 수행 주로 했다 혈관 네트워크의 동적 변화를 포착 하지 못했습니다. 이 연구는 vivo에서 듀오 컬러 2 광자 이미징 메서드를 contusive 문화에 따라 급성 혈관 동적 변경 내용을 모니터링 개발 했습니다. 이 방법은 혈액 흐름, 혈관 직경, 및 사전 및 사후 부상 같은 쥐의 다양 한 사이트에서 다른 혈관 병 리 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 혈관 역학 조사에 대 한 훌륭한 장소를 제공 합니다.
Introduction
외상 성 척수 상해 (SCI) 모터, 감각, 및 자치 기능의 손상으로 이어지는 일반적인 상해가 이다. 에 따르면는 국립 척수 부상 통계 센터 (NSCISC) 2016 년에, 약 282000 명 동안 그들의 69% 교통 사고 때문에 주로 영향을 받은 또는1폭포. 이러한 환자는 종종 인텐시브 케어; 필요 그러나, 효과적인 치료는 현재 사용할 수 있습니다. 따라서, 과학으로 새로운 효과적인 전략 시급히 필요 합니다.
과학은 주로 두 개의 단계로 분할 된다: 기본 부상과 2 차 부상. 영향2, 염증, 세포 apoptosis, 점차적으로 이어질 나머지 축 삭의 demyelination 등 보조 부상 사건의 연속에 의해 다음의 사이트에서 출혈 성 괴 사를 일으키는 물리적 모욕을 구성 하는 주요 부상 에 형태학 상과 기능적인 적자3,4,,56의 확장. 출혈 부상, SCI7,8의 급성 단계에서 즉각적인 혈관 장애를 나타내는의 첫번째 보이는 표시 이다. 초기 혈관 손상을 줄이기 위한 신경 보호 전략 환자의 회복을 향상 시킬 수 있습니다 하지만이 사건의 초기 포스트 상해는 혈관 병 태 생리 메커니즘의 더 나은 이해.
이전 연구는 척수 맥 관 구조 공부를 다양 한 방법을 사용 하 여에 불구 하 고 중요 한 한계는 남아 있다. 예를 들어 수소 클리어런스9, autoradiography10, microangiogram8, 관 부식 캐스트11및 immunohistochemistry12, 사후 샘플만을 공부 하는 가장 공유 단점 ,13. 레이저 도플러 Flowmetry 척수 혈액 흐름14의 비 침범 성 실시간 모니터링을 제공, 하지만 그것은 혈관 시스템을 구별 하 여 혈관 형태학 상 변화를 감지 수 없습니다. 동적 대비 강화 된 MRI (DCE-MRI) 또한 비 침범 성, 하지만 그것은 저해상도 이미지를 생성 하 고 비싼 인프라15요구.
Vivo에서 2 광자를 사용 하 여 이미징 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2 P-LSM) 피 질16,,1718에 vasodynamics 공부에 대 한 개발 되었습니다, 그리고 연구의 제한 된 수 있다 두 가지 이유로 더 도전 contusive 부상 후 시연된 혈관 변화 영향은 탕 외. 다음 hemisection 모델19, 그러나 영상에서 병 변 사이트의 가장자리에 혈액의 흐름에 변화를 보여왔다. 첫째, 전통적인 유리 광학 창 부상 사이트 것 하지 기계적 영향을 유지 하 고 이미징 기능 유지. 둘째, 누설으로 인해 실질에 추적의 출혈 후 부상 영상과 어려움을 만듭니다.
여기 우리가 영상 사전 및 사후 부상 시간 지점에서 동일한 개별 선박 수 소설 듀오 컬러 이미징 방법 제시. 또한, 그것은 contusive 문화에 따라 혈관 동적 변화의 시간적 공간 프로 파일 제공 또한 여러 후 시간 점에서 이미징에 대 한 가능성이 있다. 이 프로토콜은 혈관의 상호 작용을 공부 하는 유전자 변형 동물에 직접 적용할 수 있습니다.
Protocol
모든 수술 및 동물 취급 절차 관리 및 실험 동물 사용 (국가 연구 위원회)의 인디애나 대학 학교의 약 기관 동물 관리 및 사용 지침에 대 한 가이드 아래 승인으로 수행한 위원회입니다.
1. 수술 준비
- 척추 안정제를 포함 하 여 모든 수술 도구를 소독. 수술 테이블 및 70% 에탄올과 모든 주변 지역 청소. 비 생존 수술의 준비, 37 ° C가 열 패드 상단 깨끗 한 수술 패드 장소.
- 6 주 오래 된 Sprague Dawley (SD) 쥐를 사용 하 여이 연구에 대 한. 무게와 케 타 민 (87.7 mg/kg) 및 xylazine (12.3 mg/kg) 혼합물의 복 주사와 쥐를 anesthetize. 동물 발가락 꼬집어 자극에 응답을 중단 하는 경우 마 취의 적절 한 단계를 확인 합니다. 피하 주사 0.01-0.05 mg/kg Buprenorphine 및 5 mg/kg Carprofen 수술 전에.
- 2 지역에 쥐 면: 뒷면 및 목 지역을 가슴 쪽에 자 궁 경관 등뼈 지역. 70% 알코올 잎사귀 betadine 외과 스크럽과 피부 영역 면봉. 수술 중 안구 건조를 방지 하기 위해 눈 연 고를 적용 합니다. 깨끗 한 수술 패드에서 부정사 위치에 동물을 놓습니다.
2. 외부 경 정 맥 도관 법
- 외부 경 정 맥, 쇄 골 근처 펄스 포인트를 찾는 하 여 찾아서 3 해 부 포인트 크로스 포인트는 자리에 수직 절 개를 만들기 위해 작은 봄이 위 컷: 오른쪽 mandible의 큰 결 절의 꼬리 ramus 상 완 골 및 위 (그림 1A). 봄이 위 및 미세 집게를 사용 하 여 선박을 격리 합니다. 1 메 마른 외과 봉합 사 선 (그림 1C)20선단부를 묶어.
- 1 1 mL 주사기 가득 염 분 및 21-게이지 바늘 (그림 1B)에서 만든 특수 카 테 터와 연결을 준비 합니다. 그릇에 마이크로 위를 사용 하 여 작은 절 개를 하 고 선박에는 카 테 터를 슬라이드.
- 두 인접 하 고 원심 끝 (그림 1C)을 매 서 바늘을 보안 합니다. 특수 카 테 터는 21-게이지 바늘에서 이루어집니다. 갈기 플랫 팁 및 용접 팁의 2 밀리미터 조각으로 또 다른 21-게이지 바늘에서 잘라. 이 밖에 미 끄 러에서 테를 방지할 수 있습니다.
참고: 바늘에 흐르는 혈액의 작은 양의 바늘 혈관을 성공적으로 입력 했습니다 나타냅니다.
- 두 인접 하 고 원심 끝 (그림 1C)을 매 서 바늘을 보안 합니다. 특수 카 테 터는 21-게이지 바늘에서 이루어집니다. 갈기 플랫 팁 및 용접 팁의 2 밀리미터 조각으로 또 다른 21-게이지 바늘에서 잘라. 이 밖에 미 끄 러에서 테를 방지할 수 있습니다.
3. 척추 안정화 및 C5-C7 Laminectomy
- 경향이 위치에 동물을 놓습니다. 원하는 척추 레벨에서 15 번 메스 블레이드와 중간 선 따라 피부를 잘라. 근육 레이어 5회 에서 7번째 경관 척추 (C5-C7) 양측 측면 측면 (그림 2A)21폭로 해 부.
참고: 고 견 사이 스파이크를 찾는 하 여 두 번째 흉부 척추를 (T2)을 찾습니다. C7 척추21,22,,2324찾을 T2 척추에서 위쪽으로 계산 합니다. - 수정 된 안정화 장치를 사용 하 여 쥐의 척추를 안정화 합니다. 측면 척추 뼈의 양쪽에 슬릿을 만듭니다. 스테인리스 스틸 팔 노출된 가로 프로세스 측면 아래 슬라이드와 안정성 (그림 2B)를 확보 하 고 나사를 조입니다.
- 조심 스럽게 제거 C5-C7 하기 (laminectomy, 그림 2C).
- 계속 moisturized (그림 2D) 노출된 dura mater 위에 식 염 수에 젖은 gelfoam의 작은 조각을 넣으십시오.
4. 2 광자 (2 P) 이미징 창 설치
- 물건 작은 조각의 gelfoam 근육과 척추 뼈 사이의 간격으로 또한 척수와 척추 뼈 사이 gelfoam의 얇은 라인을 물건 다음 조직 접착제 접착제를 사용 하 여 근육-뼈 주변을 밀봉 하기 위하여. 완전 한 건조 (그림 2E)에 대 일 분 기다립니다.
참고: 이 단계는 효과적으로 창 시키는 침수 솔루션으로 미래의 출혈을 방지 합니다. - DdH2O 전자 레인지에 4 %agar 준비 합니다. 고 한 천이 녹는 완전히 후 만질 수 있는 온도에 반환 될 때까지 기다립니다. 한 솔루션으로 1 mL의 멸 균 주사기를 (그림 2E) 벽을 만들려고 윈도우의 가장자리에 파이프. 솔루션 신속 하 게 굳은 렌즈 또는 목표 자유롭게 이동할 수 있도록 유연 하 고.
- 이미징에 대 한 준비를 하는 경우 2 P (그림 2F) 이미징에 대 한 창 gelfoam 및 장소 침수 액체를 제거 합니다. 2 광자 현미경 어두운 챔버 내부 안정화 동물 전송 및 2 P 이미징 창 렌즈 아래에 직접 배치. 이미지 창으로 렌즈를 신중 하 게 낮은.
5. 첫 번째 형광 염료 및 초기 이미징의 주입
- 0.5 mL Rhodamine B isothiocyanate-Dextran의 준비 (4 mg/mL 평균 분자량 ~ 70kDa) 염 분에. 솔루션 1 mL의 멸 균 주사기를 이전에 설치한 카 테 터에 주사기를 연결.
참고: 형광 염료 솔루션을 준비 하 고 전에 사용 하는 것이 좋습니다. - 주사기를 매우 느리게 우울 하 여 첫 번째 염료를 주사 (그림 3B). 먼저, 관심의 영역을 식별 하는 접 안 렌즈를 사용 합니다. 충전 결합된 장치 (CCD) 카메라를 사용 하 여 랜드마크 이미지와 낮은 확대율에서 표면 혈관 패턴의 밝은 필드 이미지를 얻으려고. 전환 하 레이저 스캐닝 모드와 다음 두 이미지를 수집 하기 위한 소프트웨어 이미징 2p를 열고 고 라인 스캔 데이터.
- Fluorophores 군데 조직에 있는 사용에 맞게 적절 한 2 P 레이저 여기 파장, 전력 및 형광 채널 (첫 번째 염료 빨강 채널)을 선택 하 고 vivo에서 화상 진 찰 (그림 3E)를 수행. 전체 과정에서 열 패드에 동물 유지.
6. C7 Contusive 부상 리사 장치를 사용 하 여
- C7 중간 타 박상 부상 이전 설립된 프로토콜25,26에 따르면 루이빌 부상 시스템 장치 (리사) 장치를 사용 하 여 수행 합니다.
- 간단히, 다음 보정 리사 무대에 동물을 배치 합니다.
7. 두 번째 형광 염료 주입 후 부상 영상
- 염 분에 Fluorescein isothiocyanate-dextran (4 mg/mL, 평균 분자량 ~ 70 kDa) 0.5 mL를 준비 5.1에서 동일한. 1 mL의 멸 균 주사기에서 솔루션을 작성 하 고 이전에 설치 된 카 테 터와 연결.
- 2 P 현미경 어두운 챔버 내부 안정화 동물 다시 전송 하 고 다시 첫 번째 염료에 대 한 빨강 채널와 두 번째 염료에 대 한 녹색 채널 같은 지역 이미지 (3D 인물 & G).
- 영상의 마지막에 척추 안정화 장치에서 쥐 놓고 천 벽 청소.
8. 동물 희생
- 이미징, 후 transcardial 관류 프로토콜27다음 쥐를 희생. 척수 샘플을 수집 하 고 4%에 그들을 수정 PFA.
9. 오프 라인 데이터 분석: 혈관 직경의 정량화
- 오프 라인 분석에 대 한 워크스테이션에 이미지 파일을 전송.
- ImageJ 고 "파일"을 선택 하 고 이전 저장 된 원시 데이터 선택 열고 연관 된 단일 이미지 파일 (그림 4B).
- "분석" "비율 설정" (그림 4C) 다음을 선택 하 여 이미지를 보정. "픽셀에서 거리"에 배치 하는 값은 그림 4A에 표시 하는 수식을 사용 하 여 계산 됩니다. 2 광자 광 렌즈의 교정 방정식에 기본 값을 결정합니다. "OpticalZoom"의 값은 Excel 확장 태그 Languagefile (XML 파일) 단일 이미지 파일 (그림 4B)와 관련 된에서 발견 된다.
- 혈관의 긴 축에 수직인 선 그리기 (그림 4D1 & E1)와 "분석" 뒤에 "측정"을 선택 하십시오. 혈관 직경의 측정 결과 창에 표시 됩니다 (그림 4D2 & E2). 평균 값을 얻으려고 선박에서 3 회를 반복 한다.
10. 오프 라인 데이터 분석: 빨간 혈액의 정량화 셀 (RBC) 속도
- 분석을 위한 워크스테이션을 라인 스캔 파일을 전송.
- ImageJ 소프트웨어 시작 고 "파일"을 선택 하 고 이전 저장 된 원시 데이터 선택한 확장 이름 ".ome"와 모든 연결 된 라인-스캔 파일을 열.
- "이미지"를 열고 "스택" 뒤에 "스택 이미지"를 선택 합니다. 단일 이미지 스택 TIFF 파일로 모든 오메 파일을 변환 합니다.
- Matlab 소프트웨어를 시작 하 고 "열기"를 클릭 합니다, 그리고 "LSPIV_parallel.m" 코드 파일을 선택 합니다. 참고: LS-PIV를 위한 Matlab 코드 https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18 에서 다운로드 될 수 있다
- 다음 주문을 선택: "실행" > "폴더 변경" > "동맥". 10.3에서 생성 된 이미지 스택 TIFF 파일을 선택 합니다.
- "Y"를 입력 하 고 Enter 키를 누릅니다.
- 커서를 왼쪽 및 오른쪽 이미지의 각각, 그리고 프로그램 데이터 처리 하기 시작.
- 프로그램의 끝에, 최종 읽기 계산을 2 값을 입력: "pixel_meter 변환 값", 그리고 "스캔 시간 변환 값". 둘 다 라인 스캔 데이터와 관련 된 XML 파일에서 찾을 수 있습니다. 최종 값으로 평균 및 표준 편차 (mm/s) 당 밀리미터의 단위로 속도의 표시 됩니다.
Representative Results
방법은 변화를 모니터링 vivo에서 동적 척추 혈관 개별 선박 수 사전 및 포스트 외상 성 문화 첫째, 카 테 터는 후속 형광 염료 주사 (그림 1A-C, 그림 3)에 대 한 액세스 권한을 제공 하려면 외부 경 정 맥을 통해 설치 됩니다. 두 번째 단계에서 전문된 기구는 노출된 C5-C7 (그림 1D-F, 그림 2A-B)를 안정화 하는 데 사용 됩니다. 이 안정화 단계 호흡 아티팩트를 제거 하 고 꾸준한 이미지를 제공할 수 있습니다. (그림 2C) laminectomy, 다음 다음 단계 2 P C5-C7 (그림 2D-F)을 통해 창 이미징의 설치입니다. 주변 조직 척추 영상 창의 주위 출혈을 최소화 하는 것이 성공적인 혈관 이미징에 대 한 중요 합니다. 다음 단계 (그림 3A-B, E) 기준으로 rhodamine dextran 형광 염료 (빨간색) 랜드마크 지도 혈관 네트워크를 언급 한 카 테 터를 통해 주입 하는. C7 중간 중간 심각도 contusive 부상, 후 원하는 후 시간 포인트에서 도입 FITC-dextran (녹색) (그림 3A & D). 듀오-색 방법의 아름다움은 한 여전히 첫 번째 염료는 이미 부상 (그림 3G)으로 인해 실질으로 밖으로 유출 하는 경우 두 번째 염료를 사용 하 여 혈관 구조를 검색할 수 있습니다.
이미징 세션 동안 그것은 마 취 유도 후 몸 핵심 온도 유지 하는 생리대에 동물을 유지 하는 것이 좋습니다.
우리의 듀오 컬러 메서드를 사용 하 여 개별 혈관의 직경 및 적혈구 속도 (RBC 속도) 측정 되 고 계산. 직경, 하나 ImageJ 교정 (그림 4) 후 3 반복에 그것의 최대 직경에 선박을 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 속도, 라인 스캔 이미지 RBC 속도 (그림 5)18계산 Matlab 프로그램 (MATLAB R2013a)를 사용 하 여 측정 됩니다. 형태학, 혈액 흐름 속도, 및 혈관 직경에 따라, 혈관으로 분류할 수 있습니다 2 카테고리: 동맥과 정 맥 (표 1 참조).
그림 1 . 경 정 맥 도관 법 및 척추 안정화
(A) 외부 경 정 맥을 찾기 위한 그리기 회로도. (B) 21-게이지 바늘에서 만든 특수 카 테 터. 팁 지상 평평 하 고 다른 21-게이지 바늘에서 잘라 2 밀리미터 팁의 조각으로 용접 했다. (C)는 회로도 도관 법의. 선단부는 근 위 카 테 터 안정화, 혈관 (혈관 결 찰, 파란색 화살표) 함께 바늘을 고정으로 끝나는 다음 먼저, 출혈입니다. (D) 수정된 척추 안정제의 이미지. C5-C7 창 laminectomy (E) 이전 및 laminectomy contusive 문화 (F) 후 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 광 창 설치 단계별 회로도입니다.
( A) 1 단계: 절단 피부와 중간 선 따라 근육에 의해 척추를 노출. (B) 2 단계: 척추 안정화. (C) 3 단계: laminectomy. (D) 4 단계: 식 염 수에 젖은 gelfoam의 조각을 배치 하 여 척수의 수 분을 유지. 5 단계 (E) : 살 균 gelfoam와 vetbond 간격 물개. 건조 후, 한 천 벽의 레이어 창의 가장자리에 만들어집니다. (F) 6 단계: 이미지에 대 한 준비, 이미징 창 2 P 내부 gelfoam 및 장소 침수 액체 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . vivo에서 듀오 컬러 방법 절차 단계별.
5 단계 (A)모든 절차에 의하여 이루어져 있다. 다음 1 단계와 2 단계, 대략 70의 크기와 한 쌍 dextran 추적기의 KDa는 (전에 척수 맥 관 구조를 시퀀스에 주입 하는B 와 C) contusive 문화 (D)후. (E)-(G) 대표 2 P 이미지-단계 5 단계 3에서 척수 맥 관 구조를 표시. 흰색 화살표 영역 (F 및 G)를 새 첫 번째 파 붉은 염료를 가리킨, 청록색 화살촉 표시 두 번째-파도 녹색 염료 누설 (G). 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 수집 및 척추 혈관 직경의 정량화
준비, 다음 단일 이미지 파일 보정된 값 (B)의 XML 파일과 함께 2 P 현미경 아래 획득 됩니다. (A) 방정식 표시 "픽셀의 미크론 당" 광학 확대/축소 값에 따라 계산이 됩니다. ImageJ (C)에서 교정, 후 선박 직경 전에 경도 축을 3 지점에서 측정 된다 (D1) 후 (E1) 부상. (D2) 및 (E2) 측정된 값을 표시. (F) 기준선과 30 분 후 상해에서 혈관 직경의 정량화. 눈금 막대 = 50 µ m. 데이터 표시 됩니다 ± SD, 의미 * * * p < 0.0001, 양측 쌍체 t 검정.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 수집 및 척추 배 속도의 정량화
라인 스캔 이미지 파일은 단일 선박 속도 계산 하기 위해 2 P 현미경 아래 획득 됩니다. (A)는 선택한 용기와 혈관 RBC 속도 평가 하는 방법의 예입니다. (B) 라인 스캔 이미지와 속도의 계산에 대 한 해당 플롯 파일의 동맥 예 뿐 아니라 정 맥 (C)의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 동맥 | 정 맥 | |
| 형태학 | 직선, 부드러운, 두꺼운 혈관 벽 | 분기, 거친 가장자리 |
| 혈액 흐름 속도 | 빠른 | 천천히 하지만이 다릅니다. |
| 직경 | 30-80 µ m | 100-250 µ m |
표 1: 기준 선박 유형 식별
Discussion
과학 다음 혈관 연구에 대 한 하나의 도전 전통적인 기법 혈관 구조 변화 사후 샘플에 크게 제한 하기 때문에 기술적 제한입니다. 이 소설 에서 vivo imaging 위에서 설명한 방법을 혈액 흐름과 관련된 매개 변수 (속도 및 선박 직경) 살아있는 쥐에서 2 P-LSM을 사용 하 여 동적 측정을 수 있습니다. 그것은 또한 contusive 영향은 다음 다른 시간 지점에서 혈관의 동일한 세트에 반복된 검사 수 있습니다. 이전 2 광자 현미경 이미징 기술을 단일 추적 프로그램의 누설 때문 후 외상 혈관 구조를 포착 하지 못했습니다. 우리의 듀오 컬러 디자인 충격적인 모델에 대 한 동적 혈관 이미징이 있습니다. 또한,이 방법의 유연성 급성 혈관 변화 영향은 다음의 임시 공간 프로 파일을 생성 하는 기회를 제공 한다
우리의 에 비보 듀오 컬러 이미징 방법에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 시간 경과 영상, 특히 호흡 모션 아티팩트를 줄일 전에 척수의 물리적 안정성을 보장 하기 위해 기본적 이다. 우리 설계 안정화 동안 척추 척추의 높이 약간 인상 척추 클램프의 모양. 따라서 호흡 동물을 연관 척수의 운동 수 크게 감소 (그림 1D-F, 2B). 이미징 각 세션의 시작 전에 척수의 안정성을 확인 하는 것이 좋습니다. 척수 안정성을 달성 하지 못하면 조정 정렬 및 척수 클램프의 견고 하 여야 한다. 둘째, 주변 조직 (뼈, 근육 층 및 피부) 이미징 창으로 출혈 보기의 오염 위험 수 있습니다. 부드러운 이미지 세션에 대 한 효과적인 예방에 대 한 주변 조직에 gelfoam 조직 접착제 접착제를 적용 합니다. 셋째, 우리가 선택 하는 형광 염료로 알 부 민 (66 kDa), 주요 높은 분자량의 혈장 단백질은 비슷한 크기를 있다. 조건 하에서 항상성, 염료 민28유사한 선박 내부 크게 유지 했다. 부상 후 염료 방해 내 피 구조를 통해 전달 하 고 맥 관 구조 (그림 3 층-G)의 주변 지역에서 형광 강도 중요 한 증가 일으키는 실질에 유출. 또한, 우리가 외부 경 정 맥 도관 법을 선택 하는 이유는 두 가지 이유가 있다. 첫째, 그것은 언제 든 지 실험의 배달의 일관 되 게 액세스할 수 있는 경로 제공할 수 있습니다. 둘째, 그것은 미래의 치료 주사에 대 한 경로로 사용할 수 있습니다.
비록 우리의 vivo에서 듀오 컬러 방법 외상 성 혈관 이미징 연구에 대 한 새로운 장소를 제공할 수 있게,이 기술에 대해 약간의 경고를 해결 합니다. 현재,이 기술은 2 시간 포인트 (기준선 및 1 시간 후 포인트)에서 혈관 변화를 평가 하기 위해 설계 되었습니다 하지만 추가 형광 염료와 채널 사용할 수 있는 경우 여러 시간 포인트 전환 가능. 비록 만성 intravital 이미징 이식된 유리 창을 사용 하 여 여러 연구, 외상 성 부상19,,2930, 후 동일한 선박에 초기 계획 정보 제공할 수 있습니다 그들 중 누구도 31,32. 이러한 연구와 달리 우리의 창 없는 유리 창이입니다. 이것은 사전 및 사후 부상 이미징, 편리 하지만 장기 관찰에 대 한 창 재건에 대 한 도전 수 있습니다. 우리의 미래 연구는 만성 이미징 기술 향상에 노력 하고있다. 혈관 시스템은 여러 선박 종류 (동맥, 정 맥 및 모 세관)로 구성 되며 각 형태와 기능의 측면에서 다른. 영상 중 선박 종류 중에서 차별화는 애타게 혈관 변화의 명확한 패턴을 도울 수 있었다. 위의 프로토콜 형태 및 속도;에 따라 선박을 식별 하는 관찰자에 따라 달라 집니다. 그러나, 동맥 특정 염료 선박 종류33사이 더 명확한 분류 줄을 쉽게 추가할 수 있습니다.
이 기술은 contusive에 평가 제한 및 다른 충격 모델, 호감의 부상과 방사선 상해 뿐만 아니라 하지만에 BSCB의 초점을 맞추고, 뿐만 아니라 혈관 침투성 변경. 스키, 외 루 경화 증 (ALS), 다 발성 경화 증 (MS) 등 다른 신경 퇴행 성 질환에 따라 혈관 변화를 공부 하 사용 될 수 있습니다. 또한, 동적 neurovascular 상호 작용을 공부 하는 유전자 변형 동물 모델에 양도 될 수 있습니다. 강력한 검사 도구로 서 미래 연구는 척수 부상에 대 한 치료의 효능을 평가 하기 위해 여기에 설명 된 이미징 기술을 활용 수 있습니다.
결론적으로, vivo에서 듀오 컬러 방법은 신뢰할 수 있는, 실시간 vivo에서 접근 도구는 시간적 공간적 혈관 프로필의 동적 혈관 변화를 평가 하 고 치료에 대 한 심사 영향은 다음과 같은 2 차 피해를 줄이기 위해
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH NS059622, NS073636, 국방부 CDMRP W81XWH-12-1-0562, 장점을 검토 상 I01 미국 재향 군인 담당 부서, 크레이그 H Neilsen 재단 296749, 인디애나 척수 및 뇌 손상 연구 재단 (BX002356에 의해 부분적으로 지원 ISCBIRF) 인디애나 주 보건 (019919), 및 Mari Hulman 조지 기부금 펀드의.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | Skin sterilization |
| Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Patterson Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | Anesthetic agent |
| Buprenorphine(0.03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
| Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | Non-steroidal anti-inflammatory drug |
| Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | Skin sterilization |
| Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | Skin sterilization |
| Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | Prevent drying eyes |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average mol wt 70kDa |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | Average mol wt 70kDa |
| Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
| Spine stabilizer set | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Vetbond | 3M Animal Care Products | 1469SB | Tissue adhesive Glue |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | Stop bleeding |
| Noyes Spring Scissors | F.S.T | 15013-12 | |
| Fine Forceps- Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
| Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
| Scalpel Blade #15 | Royal-Tek | BS2982 | skin cut |
| micro angled scissors | World Precision Instruments | 500260 | Can be from any vendor |
| 3-0 vicryl sutures | Ethicon | J393H | Can be from any vendor |
| Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18" | LOOK | 786 | Can be from any vendor |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | Can be from any vendor |
| 21 gauge needle | BD | 305165 | Can be from any vendor |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Can be from any vendor |
| Two-photon Laser Scanning Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | ||
| LISA device | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Corporation | Imaging software | |
| PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | Two-photon imaging software | |
| ImageJ | Image analysis software | ||
| Matlab statistics toolbox | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | Image analysis software |
References
- National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. , (2016).
- Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59 (4), 606-619 (2006).
- Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (1), 23-27 (2016).
- Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (10), 1678-1684 (2016).
- Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164 (3), 837-843 (1987).
- Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86 (3), 483-492 (1997).
- Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2 (3), 197-200 (1974).
- Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
- Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32 (2), 260-268 (1993).
- Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103 (1), 34-40 (1989).
- Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24 (3), 492-507 (2007).
- Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27 (4), 403-408 (2005).
- Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22 (3), 332-341 (2009).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4 (2), e22 (2006).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), e38590 (2012).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691 (2015).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 84-94 (2002).
- Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149 (2015).
- Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220 (1), 9-22 (2009).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25 (10), 1227-1240 (2008).
- Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228 (2014).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760 (2012).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
