Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

В естественных условиях Дуэт цветной метод для визуализации сосудистой динамика после тупыми спинного мозга

Published: December 31, 2017 doi: 10.3791/56565
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4, 1, 3, 3,5, 1, 1
1Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, and Department of Neurological Surgery, Indiana University School of Medicine, 2Program in Medical Neuroscience, Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University School of Medicine, 3Norton Neuroscience Institute, Norton Healthcare, 4Department of Human Anatomy & Histoembryology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, 5Department of Neurological Surgery, University of Louisville School of Medicine

Summary

Мы представляем в vivo imaging метод с использованием двух разных флуоресцентных красителей для отслеживания динамических позвоночника сосудистых изменений после тупыми спинного мозга у взрослых крыс Sprague-Dawley.

Abstract

Травмы спинного мозга (SCI) вызывает значительные сосудистые нарушения на месте травмы. Сосудистая патология возникает сразу же после SCI и продолжается на протяжении всего этапа острой травмы. В самом деле эндотелиальные клетки, как представляется, быть первым, чтобы умереть после тупыми SCI. Начале сосудистых событий, включая повышение проницаемости барьер крови-спинного мозга (BSCB), вызвать отек vasogenic и способствовать события пагубных вторичных повреждений, вызванных сложные повреждения механизмов. Таким образом, ориентация сосудистые нарушения, может быть ключевой стратегией по сокращению вторичных повреждений каскадов, которые способствуют гистологические и функциональные расстройства после SCI. Предыдущие исследования проводились главным образом на посмертный образцов и не смогли захватить динамические изменения сосудистой сети. В этом исследовании мы разработали в vivo дуэт цвет 2 Фотон изображений метод мониторинга острой сосудистой динамических изменений, после тупыми SCI. Этот подход позволяет определять поток крови, диаметр судна и других сосудистых патологий на различных участках же крысы до и после травмы. В целом этот метод обеспечивает отличное место для изучения сосудистой динамики.

Introduction

Травматические спинного мозга (SCI) является общей травмы, ведущих к ухудшению моторные, сенсорные и автономной функции. Согласно национальной спинного мозга травмы статистический центр (NSCISC) в 2016 году, примерно 282,000 человек пострадали в то время как 69% из них были главным образом вследствие дорожно-транспортных происшествий или падает1. Эти пациенты часто требуют интенсивной терапии; Однако в настоящее время доступен без эффективного лечения. Поэтому срочно необходимы новые эффективные стратегии к SCI.

SCI главным образом делится на две фазы: первичной травма и вторичные травмы. Основной вред включает физическое оскорбление, вызывая геморрагические некроз в месте воздействия2, последовал ряд вторичных повреждений событий, таких как воспаление, апоптоз клеток и демиелинизации оставшихся аксонов, которые постепенно привести для расширения Морфологические и функциональные дефициты3,4,5,6. Кровотечение является первый видимый знак травмы, указывающее немедленное сосудистые нарушения в острой фазе SCI7,8. Нейропротекторной стратегии, направленной на сокращение раннего сосудистое повреждение может улучшить восстановление пациентов, но это требует лучшего понимания патофизиологические механизма раннего сосудистых событий после травмы.

Несмотря на предыдущие исследования с использованием различных методов для изучения позвоночника сосудистую остаются значительные ограничения. Наиболее общий недостаток изучает только посмертных образцы, например, водорода Распродажа9, радиоавтография10, microangiogram8, сосудистой коррозии слепки11и иммуногистохимия12 ,13. Хотя и обеспечивает Лазерная доплеровская флоуметрия Неинвазивный мониторинг спинного мозга крови поток14в реальном времени, он не может различать сосудистых систем и выявления сосудистых морфологические изменения. Динамический контраст расширение МРТ (DCE-МРТ) также является неинвазивным, но она создает изображения с низким разрешением и требует дорогостоящей инфраструктуры15.

Хотя в vivo imaging с помощью 2-Фотон лазерная сканирующая микроскопия (2 P-LSM) был разработан для изучения vasodynamics в коре16,17,18, имеют ограниченное количество исследований продемонстрировали сосудистые изменения после SCI. Тан et al. показали изменения в поток крови на крае поражения сайта в гемисекция модель19, но изображений после тупыми травмы является более сложным по двум причинам. Во-первых традиционное стекло оптическое окно над места повреждения не будет поддерживать механического воздействия и оставаться функциональным для воображения. Во-вторых, утечки трассировщика в паренхиме из-за кровотечения создает трудности с работой с образами после травмы.

Здесь мы представляем романа дуэт цвет изображения метод, который позволяет изображений же отдельных судов на этапах до и после травмы времени. Кроме того он обеспечивает временной и пространственный профиль сосудистых динамических изменений после тупыми SCI. Она также имеет потенциал для обработки изображений в нескольких точках время после травмы. Этот протокол может применяться непосредственно к трансгенных животных для изучения взаимодействия нервно-сосудистых.

Protocol

Все хирургические и животных обработки процедуры выполнялись, утвержденных согласно руководству для ухода и использования лабораторных животных (Национальный исследовательский совет) и руководящих принципах Индиана университета Школа медицины институциональных животных ухода и использования Комитета.

1. Хирургическое подготовка

  1. Простерилизуйте все хирургические инструменты, включая стабилизатор позвоночника. Чистый операционный стол и все окрестности с 70% этиловом спирте. Для приготовления хирургическая процедура-выживание место чистой хирургической площадку на вершине 37 ° C, грелку.
  2. Для этого исследования используйте шесть неделя старый Sprague-Dawley (УР) крыса. Весят и анестезировать Крыса с внутрибрюшинного введения кетамин (87,7 мг/кг) и смесь Ксилазина (12.3 мг/кг). Подтвердите надлежащей стадии наркоза, когда животное перестает реагировать на мыс щепотку стимул. Подкожно вводить 0.01-0.05 мг/кг бупренорфина и 5 мг/кг Carprofen до операции.
  3. Брить крыса в 2 областях: шейный отдел позвоночника региона на спине и шее региона на стороне груди. Тампон участки кожи с хирургической скраб Бетадин и 70% спиртом салфеток. Примените Глазную мазь для предотвращения сухого глаза во время операции. Место животного в лежачем положении на чистой хирургической pad.

2. Внешние яремной катетеризации

  1. Найдите внешний яремной вены, находя точки импульса вблизи ключицу и резать с ножницами мелких весной сделать вертикальный разрез на месте, который является точкой крест 3 Анатомические точки: хвостовой Рамус правой челюсти, более бугорка плечевой кости и рукоятка (рис. 1A). Изолируйте судна, используя ножницы весной и тонкой щипцами. Галстук дистального конца с 1 стерильные хирургические шовные линии (рис. 1 c)20.
  2. Подготовьте один шприц 1 мл заполнены соленой и связаны с специализированными катетер из 21-иглы (рис. 1B). Сделайте небольшой разрез с помощью микро ножницы на судне и слайд катетера в сосуд.
    1. Безопасности иглы, связывая оба проксимальном и дистальном конце (рис. 1 c). Специализированных Катетер изготавливается из 21-иглы. Измельчить плоский кончик и сварки с куском 2-мм кончика, отрезаны от другой 21-иглы. Это может предотвратить соскальзывание вне катетер.
      Примечание: Небольшое количество крови, протекающей в иглу показывает, что игла успешно вошла в кровеносный сосуд.

3. позвоночника стабилизации и C5-C7 Ламинэктомия

  1. Место животного в лежачем положении. Вырежьте кожу вдоль средней линии с лезвием скальпеля № 15 на желаемом уровне спинного мозга. Вскрыть мышечных слоев от 5тыс 7го шейных позвонков (C5-C7) на двусторонней основе подвергать боковых граней (рисунок 2A)21.
    Примечание: Найдите второй грудного позвонка (T2), находя Спайк между лопатку. Граф вверх от T2 позвонка найти C7 позвонков21,,2223,24.
  2. Стабилизации позвоночника крысы с использованием модифицированных стабилизирующим аппарат. Сделайте разрез по обе стороны от боковых позвоночной кости. Слайд оружия из нержавеющей стали под гранями подвергаются поперечного отростка и затяните винты для обеспечения стабильности (рис. 2B).
  3. Осторожно удалите C5-C7 пластинки (ламинэктомии, рис. 2 c).
  4. Место небольшой кусок соленой пропитанной gelfoam поверх подвергаются Дура-матер, чтобы держать его увлажненной (Рисунок 2D).

4. Установка окна изображения двух Фотон (2P)

  1. Небольшие кусочки материал gelfoam в зазор между мышцами и позвоночной кости, также вещи тонкая линия gelfoam между спинного мозга и позвоночной кости, а затем использовать ткань клей клей для уплотнения в окрестностях мышц кость. Подождите 5 минут для полной сухости (Рисунок 2E).
    Примечание: Этот шаг предотвращает будущие кровотечения в окно и негерметичности погружения решений.
  2. Подготовка 4% агар с ddH2O в микроволновую печь. После того, как агар полностью не растворится, подождите, пока он возвращается в осязаемый температуры. Заполните 1 мл стерильного шприца раствором агар и труба его на край окна, чтобы построить стену (Рисунок 2E). Раствор твердеет быстро и остается гибким, чтобы позволить объектив или цель свободно передвигаться.
  3. Когда все готово для воображения, удалите gelfoam и место погружения жидкости внутри окна 2Р, визуализации (Рисунок 2F). Передача стабилизированный животных темной камере 2-Фотон микроскопа и место 2P визуализации окна непосредственно под объектив. Опустите объектив тщательно в окне изображений.

5. инъекции первого Люминесцентную краску и исходных изображений

  1. Подготовить 0,5 мл родамин B Изотиоцианаты декстрана (4 мг/мл Средний молекулярный вес ~ 70kDa) в солевой раствор. Заполняют раствором 1 мл стерильного шприца и соедините шприц ранее установленный катетер.
    Примечание: Подготовка решения Люминесцентную краску перед использованием рекомендуется.
  2. Привнести первый красителя, угнетающие шприц очень медленно (рис. 3B). Во-первых используйте окуляр для определения области интересов. Используйте камеру спаренных устройств (CCD) плату приобрести изображение ярко поля структуры поверхности кровеносных сосудов в нижней увеличение как ориентир изображение. Переключитесь в режим лазерного сканирования и затем открыть 2Р, визуализации программного обеспечения для сбора оба изображения и линии сканирования данных.
  3. Выберите правильное 2P волны возбуждения, мощности и флуоресцентные (красный канал для первого краситель) в матче с флуорофоров, используемых в образ ткани и затем выполнить в vivo изображений (Рисунок 3E). Держите животное на грелку в ходе всего процесса.

6. C7 тупыми травмы с помощью устройства Лиза

  1. Выполните C7 срединной ушиба травмы с помощью аппарата системы Луисвилл травмы (Лиза) устройства согласно ранее установленного протокола25,26.
    1. Короче говоря поместите животное на сцене Лиза, после калибровки.
После выбора параметра обнуление точке и регулируя ткани перемещения (0,800 мм в данном случае), нажмите кнопку «Запустить эксперимент» программного обеспечения, чтобы вызвать освобождение ударного элемента и создания травмы.
  • После травмы место еще один небольшой кусочек соленой пропитанной gelfoam поверх подвергаются dura mater держать его увлажненной.
  • Повторите шаг 4.3 и повторно выполнить в vivo изображений на той же площади, видимый с ранее вводили красного красителя (рис. 3 c & F).
  • Перенесите животных обратно в хирургической и держать животных, под наркозом с соответствующим анестезии после протокол IACUC-IUSM.

    • 7. инъекции второй Люминесцентную краску и изображений после травмы

    1. Подготовить 0,5 мл флуоресцеин Изотиоцианаты декстрана (4 мг/мл, средний молекулярный вес ~ 70 кДа) в солевых же как и 5.1. Заполните решение в 1-мл стерильного шприца и соединиться с ранее установленный катетер.
    2. Передача стабилизированный животных обратно в камере 2P Микроскоп темного и заново образ той же области красного канала для первого красителя и зеленый канал для второй краситель (цифры 3D & G).
    3. В конце обработки изображений отпустите крысы из спинного стабилизации устройства и очистить стену агар.

    8. животных жертву

    1. После съемки, пожертвуйте после transcardial перфузии протокол27крыса. Сбор образцов спинного и исправить их в 4% PFA.

    9. автономных данных анализа: Количественная оценка судна диаметров

    1. Передача файлов изображений на рабочую станцию для анализа в автономном режиме.
    2. Откройте ImageJ и выберите «файл» и затем выберите ранее сохраненные необработанных данных и откройте файл связанного одного изображения (рис. 4B).
    3. Калибровка изображения, выбрав «Анализировать» следуют «Задать шкалу» (рис. 4 c). Значение, придаваемое в «Расстояние в пикселах» рассчитывается с помощью уравнения, отображаемый в рисунке 4A. Калибровка оптический объектив 2-Фотон определяет значение по умолчанию в уравнении. Значение «opticalZoom» находится в Excel Languagefile расширяемый разметки (XML-файл), связанного с файлом одного изображения (рис. 4B).
    4. Нарисуйте линию перпендикулярно длинной оси судна (Рисунок 4 d1 & E1) и выберите «Анализировать» следуют «Мера». Измерение диаметра сосуда отображается в окне результат (рис. 4 d2 & E2). Повторите 3 раза через судно получить среднее значение.

    10. автономный анализ данных: Количественная оценка красных кровяных клеток (РБК) скорость

    1. Передача строки проверять файлы на рабочую станцию для анализа.
    2. Запустите программу ImageJ и выберите «файл» и затем выберите сохраненные необработанных данных и открыть все связанные строки проверять файлы с расширением имени «.ome».
    3. Открыть «Изображения» и выберите «Стеки» следуют «образы в стек». Конвертировать все файлы OME в один стек TIFF файл образа.
    4. Запустите Matlab программного обеспечения и нажмите кнопку «Открыть», выберите файл кода «LSPIV_parallel.m». Примечание: Matlab код для LS-PIV может быть загружен на https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18
    5. Выберите следующие заказы: «Run» > «Сменить папку» > «артерия». Выберите изображение стека TIFF файл, созданный в 10.3.
    6. Введите «Y» и нажмите клавишу Enter.
    7. Поместите курсор на левой и правой стороны изображения, соответственно, и программа начинает для обработки данных.
    8. В конце программы, введите 2 значений для расчета окончательного чтения: «pixel_meter преобразования значение» и «сканирования время преобразования значение». Как можно найти в файле XML, связанный с данными строки сканирования. Окончательное значение выражается как среднее и стандартное отклонение скорости в единицах миллиметр в секунду (мм/сек).

    Representative Results

    Метод имеет возможность контролировать в естественных условиях динамической позвоночника сосудистые изменения в отдельных сосудах пред- и пост-травматического SCI. Во-первых устанавливается катетер через внешние яремной предоставлять доступ для последующих Люминесцентную краску инъекции (рис. 1A-C, рис. 3). На втором шаге специализированный аппарат используется для стабилизации подвергаются C5-C7 (рис. 1 d-F, рис. 2A-B). Этот этап стабилизации можно устранить артефакты дыхание и обеспечить устойчивый изображений. После ламинэктомии (рис. 2 c) следующим шагом является установка 2Р, визуализации окна над C5-C7 (Рисунок 2D-F). Сведение к минимуму периферических тканей, кровотечение вокруг позвоночника визуализации окна имеет решающее значение для успешного сосудистой изображений. Следующий шаг — придать флуоресцентного красителя родамин декстрана (красный) через вышеупомянутые катетер ориентир и карта сосудистой сети как базовый (Рисунок 3А-B, E). После C7 срединная тупыми травмы средней тяжести, FITC-декстрана (зеленый) вводится в нужное время после травмы точках (Рисунок 3А & D). Красота метода дуэт цвет является, что все еще может обнаружить сосудистой структуры, с использованием второй красителя, когда первый краска уже просочились в паренхиме из-за травмы (Рисунок 3 g).

    Во время визуализации сессии желательно держать животное на грелку для поддержания температуры тела ядро после индукции анестезии.

    Методом наш дуэт цвет, диаметр и красных кровяных клеток скорость (скорость РБК) отдельных судов можно измерить и рассчитывается. Для диаметра ImageJ можно использовать для измерения судна в его большой диаметр для 3 повторяется после калибровки (рис. 4). Для скорости линия скан изображения измеряются с помощью программы Matlab (MATLAB R2013a) для вычисления скорости (рис. 5) РБК18. Основываясь на морфологию, скорости кровотока и диаметр сосуда, сосуды можно разделить на 2 категории: артерии и Вены (см. таблицу 1).

    Figure 1
    Рисунок 1 . Катетеризация и позвоночника стабилизации яремной вены.
    (A)     схема, чертеж для обнаружения внешних яремной вены. (B) специализированные катетер из 21-иглы. Отзыв был плоский и сварные с куском кончика 2 миллиметра, отрезаны от другой 21-иглы. (C) схема катетеризации. Дистальный конец перевязано сначала, затем проксимальный катетер стабилизации, заканчивая креплением иглы наряду с корабля (судна перевязки, синие стрелки). (D) образ стабилизатор модифицированных позвоночника. Отображается окно C5-C7 до Ламинэктомия (E) и после ламинэктомии и тупыми SCI (F) . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 2
    Рисунок 2 . Принципиальная схема установки оптического окна шаг за шагом.
    (A)     шаг 1: разоблачить позвонка резки кожи и мышц, вдоль средней линии. (B) шаг 2: стабилизация позвоночника. (C) шаг 3: Ламинэктомия. (D) шаг 4: сохранить влагу спинного мозга, поместив частичку saline пропитанной gelfoam. (E) шаг 5: печать пробелы с стерильных gelfoam и vetbond. После высыхания слой агар стены построен на краю окна. Шаг 6 (F) : когда вы будете готовы для обработки изображений, удаление gelfoam и место погружения жидкости внутри 2Р, визуализации окна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 3
    Рисунок 3 . В vivo дуэт цветной метод процедура поэтапного.
    Вся процедура состоит из 5 шагов (A). После шаг 1 и шаг 2, пара декстрана Трейсеры с размером приблизительно 70 кДа, вводят в последовательности для обозначения спинного сосудистую до (,B и C) и после тупыми SCI (D). (E)-(G) представитель 2P изображения отображение спинного сосудистую на шаг 3 по шаг 5. Белые стрелки указывают на первой волны красного красителя утечки (F и G), бирюзовый стрелок отображения второй волны зеленый краситель утечки (G). Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 4
    Рисунок 4 . Приобретение и количественного определения диаметров позвоночника судна.
    После подготовки единый образ файлы приобретают под 2 P микроскопии, вместе с XML-файлами калиброванного значения (B). (A) уравнение показывает расчет «пиксель за микрон», основанной на ценностях оптический зум. После калибровки в ImageJ (C), диаметры судно измеряются в 3 точках поперек продольной оси до (D1) и после (E1) травмы. (D2) и (E2) отображение измеренных значений. (F) количественная оценка судна диаметров на базовые и 30 мин после травмы. Шкалы бар = 50 µm. данные отображаются как означает ± SD, *** p < 0,0001, двустороннее паре t-тест.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 5
    Рисунок 5 . Приобретение и количественная оценка скорости позвоночника судна.
    Линия скан файлы изображений приобретают под 2 P микроскопии для вычисления скорости одно судно. (A) пример выбранной судна и метода для оценки скорости кровеносный сосуд РБК. Пример артериальной линии сканирования изображение и соответствующий файл печати для расчета скорости (B) , а также пример Вену (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Артерия Вен
    Морфология Стены прямые, гладкие, толстые судна Ветви, шероховатостей
    Скорость потока крови Быстро Медленно, но меняется
    Диаметр 30-80 мкм 100-250 мкм

    Таблица 1: Критерии для идентификации типов судов

    Discussion

    Одна из задач для сосудистых исследований после SCI является техническое ограничение потому, что традиционные методы во многом ограничены изменения сосудистой структуры в посмертных образцы. Этот роман в vivo imaging описанным выше способом обеспечивает динамическое измерение потока крови и связанных параметров (скорость и судно диаметр) с помощью 2 P-LSM в живой крысы. Она также позволяет повторный экзамен в одинаковых сосудов в разное время точках после тупыми SCI. Предыдущие методы визуализации 2-Фотон микроскопии смогли захватить посттравматической сосудистых структур из-за утечки трассирующими одного. Наш дуэт цвет дизайн позволяет динамической сосудистой изображений для травматического моделей. Кроме того гибкость этого метода обеспечивает возможность создания временной и пространственный профиль острых сосудистых изменений, после SCI.

    Есть несколько важных шагов в нашей в vivo дуэт цвет изображений методом. Во-первых она имеет основополагающее значение для обеспечения физической стабильности спинного мозга до замедленной изображений, особенно уменьшение дыхательные движения артефакт. Мы разработали форму позвоночника зажимы слегка поднять высоту спинной позвонок во время стабилизации. Таким образом движение спинного корреляции для дыхания животных может быть значительно снижается (рис. 1 d-F, 2B). Рекомендуется для проверки стабильности спинного мозга до начала каждой сессии изображений. Если спинной мозг не удается добиться стабильности, произвести корректировку для выравнивания и герметичности спинного зажимы. Во-вторых, периферических тканей (кости, слой мышц и кожи) кровотечение в окно визуализации может рисков загрязнения представления. Для сеанса гладкой изображений gelfoam и ткань клей клей следует применять на окружающие ткани для эффективной профилактики. В-третьих флуоресцентных красителей, которые мы выбираем имеют аналогичного размера как альбумин (66 кДа), который является белком плазмы крови основные высокой молекулярной массой. Гомеостатических условиях красители были во многом сохранил внутри судна, аналогичные как альбумин28. После травмы красители прошли через нарушается структура эндотелия и утечка в паренхиме, вызывая значительное увеличение интенсивности флуоресценции в периферийной зоне сосудистую (Рисунок 3F-G). Кроме того есть две причины, почему мы выбираем внешний яремной катетеризации. Во-первых она может обеспечить неизменно доступной маршрут доставки в любое время эксперимента. Во-вторых она может использоваться как маршрут для будущей лечения инъекций.

    Хотя наш дуэт цвет в vivo метод способен обеспечить Роман место для визуализации сосудистой травматического, должна решаться некоторые оговорки относительно этой техники. В настоящее время этот метод предназначен для оценки сосудистых изменений 2 момента времени (базовый и 1 очко после травмы времени), но это возможно переключиться на несколько моментов времени, если доступны дополнительные флуоресцентных красителей и каналы. Хотя есть несколько исследований, с использованием имплантированных стекла для хронической прижизненной визуализации, никто из них не может предоставить базовую информацию на том же судне после травматического повреждения19,,2930, 31,32. В отличие от этих исследований наши окно является окном без стекла. Это удобно для изображений до и после травмы, но это может быть сложным для восстановления окна для долгосрочного наблюдения. Наши будущие исследования работает над технического усовершенствования для хронических воображения. Сосудистой системы состоит из нескольких типов судов (артерии, вен и капилляров), и каждый отличается в аспектах морфологии и функции. Дифференциация среди типов судов во время визуализации может помочь дразнить из четкая схема сосудистых изменений. Протокол выше, зависит от наблюдателя, идентификации судов, основанный на словотолковании и скорости; Однако артерии конкретных краситель могут добавляться легко дать более точные классификации между судно типа33.

    Этот метод является не только ограничивается оценок на тупыми и других травматических модели, такие как раздавить травм и травм излучения, но и на исследования, посвященные нарушению BSCB, а также сосудистой проницаемости изменения. Кроме того SCI он может использоваться для изучения сосудистые изменения после других нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS) и рассеянный склероз (РС). Кроме того это может быть передаваемой трансгенных животных модель для изучения динамических нейроваскулярных взаимодействия. Как инструмент мощный скрининга будущие исследования могли бы использовать изображений техники, описанную здесь, для оценки эффективности лечения травмы спинного мозга.

    В заключение в естественных условиях дуэт цветной метод является надежной, в реальном времени, в естественных условиях подход инструмент для оценки динамических сосудистых изменений, которые идеально подходит для характеризации временных и пространственных сосудистой профиля и скрининга для лечения снижению вторичного ущерба после SCI.

    Disclosures

    Авторы не имеют ничего сообщать.

    Acknowledgments

    Эта работа частично поддержали низ NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, заслуги обзор премии I01 BX002356 от Департамента по делам ветеранов США, Крейг H Neilsen фонд 296749, Индиана спинного и головного мозга травмы исследовательский фонд ( ISCBIRF) Индиана государственный департамент здравоохранения (019919), и Мари Hulman Джордж Дотационного фонды.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Purdue Products Betadine Surgical Scrub Fisher Scientific 19-027132 Skin sterilization
    Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) Patterson Veterinary  07-881-9413, 07-890-5745 Anesthetic agent
    Buprenorphine(0.03 mg/mL)  Patterson Veterinary  07-891-9756 Pain relief agent
    Carprofen Patterson Veterinary 07-844-7425 Non-steroidal anti-inflammatory drug
    Dukal Gauze Sponges  Fisher Scientific 22-415-490 Skin sterilization
    Decon Ethanol 200 Proof Fisher Scientific 04-355-450 Skin sterilization
    Artificial Tears Eye Ointment Webster Veterinary 07-870-5261  Prevent drying eyes 
    Cotton Tipped Applicators Fisher Scientific  1006015
    Rhodamine B isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich R9379 Average mol wt 70kDa
    Fluorescein isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich 46945 Average mol wt 70kDa
    Instrument Sterilizer Fine Science Tools 18000-50 for sterilizing surgery tool
    Spine stabilizer set Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Vetbond 3M Animal Care Products 1469SB Tissue adhesive Glue
    Gelfoam Henry Schein 9083300 Stop bleeding
    Noyes Spring Scissors F.S.T 15013-12
    Fine Forceps- Dumont #5 F.S.T 11254-20
    Rongeur Fine Science Tools 16021-14 laminectomy
    Surgical Retractor Fine Science Tools 17005-04
    Scalpel Fine Science Tools 10003-12  skin cut
    Scalpel Blade #15 Royal-Tek BS2982 skin cut
    micro angled scissors World Precision Instruments 500260 Can be from any vendor
    3-0 vicryl sutures Ethicon J393H Can be from any vendor
    Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18" LOOK 786 Can be from any vendor
    1 ml syringe Henke Sass Wolf 4010.200.V0 Can be from any vendor
    21 gauge needle BD 305165 Can be from any vendor
    Agar Sigma-Aldrich A1296 Can be from any vendor
    Two-photon Laser Scanning Microscope Bruker Fluorescence Microscopy
    LISA device Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
    HCImage Live Hamamatsu Corporation Imaging software
    PrairieView Prairie Technologies/Bruker Two-photon imaging software
    ImageJ Image analysis software
    Matlab statistics toolbox The MathWorks, Inc. https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle Image analysis software

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. , (2016).
    2. Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).
    3. Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
    4. Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59 (4), 606-619 (2006).
    5. Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (1), 23-27 (2016).
    6. Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (10), 1678-1684 (2016).
    7. Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164 (3), 837-843 (1987).
    8. Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86 (3), 483-492 (1997).
    9. Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2 (3), 197-200 (1974).
    10. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
    11. Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32 (2), 260-268 (1993).
    12. Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103 (1), 34-40 (1989).
    13. Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24 (3), 492-507 (2007).
    14. Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27 (4), 403-408 (2005).
    15. Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22 (3), 332-341 (2009).
    16. Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (20), 8473-8478 (2011).
    17. Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4 (2), e22 (2006).
    18. Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), e38590 (2012).
    19. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691 (2015).
    20. Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 84-94 (2002).
    21. Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149 (2015).
    22. Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220 (1), 9-22 (2009).
    23. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
    24. Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
    25. Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25 (10), 1227-1240 (2008).
    26. Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
    27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
    28. Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932 (2013).
    29. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
    30. Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228 (2014).
    31. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760 (2012).
    32. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
    33. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).

    Tags

    Нейронауки выпуск 130 два Фотон в vivo изображений дуэт цвет изображения тупыми спинного сосудистой динамика крыса
    <em>В естественных условиях</em> Дуэт цветной метод для визуализации сосудистой динамика после тупыми спинного мозга
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Chen, C., Zhang, Y. P., Sun, Y.,… More

    Chen, C., Zhang, Y. P., Sun, Y., Xiong, W., Shields, L. B. E., Shields, C. B., Jin, X., Xu, X. M. An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (130), e56565, doi:10.3791/56565 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter