Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Bevæger sig opad: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensionale Invasion Assay protokol

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56568
Automatic Translation
1, 1,2,3,4,5, 6
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota - Twin Cities, 2Stem Cell Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota - Twin Cities, 4Lillehei Heart Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 5Institute for Engineering in Medicine, University of Minnesota - Twin Cities, 6Department of Biology, Jackson State University

Summary

Denne protokol beskriver en omvendt lodret invasion assay, der kunne bruges til at kvantificere migration og invasion kapaciteter af celler i en tre-dimensionelle indstilling samtidig bevare celle mikromiljø. Denne analyse er egnet for sjældne og/eller følsomme celler.

Abstract

Selv om 3D invasion assays er blevet udviklet, stadig udfordringen for at studere celler uden at påvirke integriteten af deres mikromiljø. Traditionelle 3D-undersøgelser såsom Boyden kammer kræver at celler er fordrevet fra den oprindelige placering, kultur og flyttede til et nyt miljø. Ikke alene er dette sprænges de cellulære processer, der er uløseligt forbundet med mikromiljø, men det resulterer ofte i tab af celler. Disse problemer er særligt udfordrende, når der beskæftiger sig med celler, der enten er sjældne eller yderst følsomme over for deres mikromiljø. Her, beskriver vi udviklingen af et 3D invasion assay, der undgår både bekymringer. I denne analyse, celler er forgyldt inden for et lille godt og en ECM-matrix, der indeholder en chemoattractant er lagt på toppen af cellerne. Dette kræver ingen celle fortrængning, og giver cellerne til at invadere opad i matrixen. I denne analyse, kan celle invasion samt celle morfologi vurderes inden for kollagen gel. Ved hjælp af denne analyse, karakterisere vi den invasive kapacitet af sjældne og følsomme celler; de hybride celler som følge af fusion mellem brystkræftceller MCF7 og mesenchymale/Multipotente celler stamceller/stroma (MSCs).

Introduction

Celle motilitet er en normal udviklingsmæssige og fysiologisk proces af celler. Ændringer i mønsteret og evne til celler til at migrere og invadere er imidlertid forbundet med patologiske betingelser herunder inflammatoriske sygdomme og kræft metastaser1,2,3. Metastaser er velsagtens den mest dårligt forstået aspekt i kræft. For at metastaserer, skal kræftceller nedbrydes de ekstra cellulære matrix (ECM), invadere lokale væv og intravasate. Når i omløb, kræftcellerne vil formidle til webstedet fjernt, extravasate og danner sekundære tumorer. Derfor muligheden af celler til at forringe ECM, overflytte, og at invadere er relateret til deres metastatisk potentiale. Forskellige metoder er blevet udviklet for at analysere og kvantificere funktionerne migration og invasion af celler. De mest anvendte metoder omfatter sårheling assay, time-lapse mikroskopi og Boyden kammer assay. De sår healing assay4 og tid bortfalder mikroskopi er enkel og praktisk assays, der ville give foreløbige indblik i celle migration. Begge er dog 2D assays, der ikke afspejler 3D-miljø, hvor celler findes i vivo. Undersøgelser har vist, at celler reagerer forskelligt på en 3D-miljø, sammenlignet med en 2D en5,6. Desuden, sår healing assays er svært at gengive og give kvantitative resultater7,8,9. Celle udelukkelse Zone-analysen, som er en 3D ændring af sårheling assay, er en mere fysiologisk relevante assay men det er ikke egnet til celler lavt i antal som hybrid celler som følge af celle fusion begivenheder10,11 .

Boyden kammer assay er en 3-dimensionelle analyse, der giver relevante microenvironments for cellular undersøgelser. Det kræver dog celler fjernes fra deres oprindelige mikromiljø og deponeres i det øverste kammer af Boyden assay system til at migrere og invadere nedad mod chemoattractant indeholdende medium. Denne 3D tilgang er ikke egnet til at analysere migration og invasion evnen til celler sårbare over for deres mikromiljø og/eller begrænset i antal10,11,12. En nyere tilgang til at analysere celle migration og invasion er mikrofluid gradient kammer assay13. Selvom egnet og pålideligt i migration og invasion undersøgelser, denne analyse er dyrere og kunne være en teknisk udfordring for en typisk laboratorium. Vi beskriver her en simpel omvendt lodrette invasion assay, der er kompatibel med mange celletyper, herunder celler følsomme over for deres mikromiljø og/eller begrænset i antal. Denne analyse blev tilpasset fra protokollen som Hooper et al. foreslået 14. i denne analyse, cellerne forbliver i deres oprindelige mikromiljø og deres migration og invasion er overvåget, når de bevæger sig opad i kollagen gele indeholdende en chemoattractant11. Denne analyse er reproducerbare og er blevet optimeret og godkendt i 35-mm kultur parabol. Det kunne tilpasses forskellige assay betingelser herunder forskellige celle kultur størrelser, forskellige matricer eller styrke af vedhæftning og forskellige chemoattractants. Denne analyse kunne tjene som en in vitro- platform for indledende screening i drug discovery proces.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Denne protokol er beskrevet i McArdle et al. 11. en tidslinje er fastsat i figur 1.

1. forberedelse af kultur plade

  1. Vask 35-mm kultur parabol indeholdende en 10 mm glas-bund godt med 1 mL 1 M saltsyre (HCl) til 15 min til lavere hydrophobicity af glas-bund.
  2. Vask kultur plade to gange med 1 mL af fosfat buffer saltvand (PBS) at slippe af med alle HCL-listen.
  3. Vask kultur plade to gange med 1 mL af 70% ethanol.
  4. Skyl kultur plade med 1 mL i cellekulturmedium specifikke (her, brug α-MEM suppleret med 10% varme inaktiveret FBS og 1% ikke-essentielle aminosyrer).
    Bemærk: Den behandlede kultur plade der indeholder næringssubstratet kan lagres i CO2 kuvøse med en luftfugter ved 37 ° C indtil næste dag.
  5. Vokse celler (MSCs og MCF-7 Co kultur) i den behandlede glas-bund godt af 35-mm kultur parabol til 100% confluency. Co kultur 35.000 MSC celler og 75.000 af MCF7 celler i 24 timer.

2. fremstilling af kollagen gel

  1. Gemme mikropipette tips anvendes til pipettering kollagen gel i fryseren for at undgå polymerisering af kollagen ved kontakt.
    Bemærk: Dette er den mest kritiske trin.
  2. Bestemme en volumen af rotte hale kollagen jeg skal bruges baseret på koncentrationen af kollagen lager. Forberede 100 µL af kollagen gel til dette assay.
    Bemærk: Høj koncentration af rotte hale kollagen jeg lagerfører virker bedre. Bestemme mængden af 10 x Dulbeccos modificerede Eagle Medium skal anvendes til at fortynde kollagen i overensstemmelse hermed.
  3. Kombinere på isen rotte hale kollagen jeg (3,8 µg/mL lager), 10 x Dulbecco ændret Eagle Medium og 1 x cellekulturmedium suppleret med 2% føtal bovint serum og den passende chemoattractant til en endelig koncentration på kollagen 2,4 mg/ml.
  4. Føje til blanding 4,5% af natriumbikarbonat løsning til at neutralisere kollagen gel.
    Bemærk: Mængden af natriumbikarbonat løsningen føjes kan variere baseret på den præcise pH af andre reagenser. Det er bedst at teste blandingen med pH-strips til at sikre neutrale løsning, eller bruge et pH indikator i dyrkningsmediet.
  5. Lægge 80 µL af kollagen blandingen over celler inden for glas-bund godt af kultur parabol.
  6. Tillad kollagen gel til at polymerisere for 30 min i en CO2 kuvøse med en luftfugter ved 37 ° C.
  7. Dække kollagen gel med 2 mL af celle medium med nedsat serum (2%), og der inkuberes celler ved 37 ° C i en CO2 kuvøse med en luftfugter til 24, 48 eller 72 h.
    Forsigtighed: Pladen skal håndteres med forsigtighed for at forhindre, at kollagen gel afmontering fra glas bund.

3. eksempel på forberedelse af kollagen gel ved hjælp af en rotte hale kollagen bestand af 3,8 µg /mL

  1. På is, kombinere 114,5 µL af rotte hale kollagen, 16,6 µL af 10 x DMEM og 33.1 µL af næringssubstratet indeholdende chemoattractant.
  2. Neutralisere kollagen blandingen med 14,0 µL af natriumbikarbonat.
  3. Fortsætte som i trin 2,5.

4. imaging af celler

  1. Forsigtigt fjerne medier fra fadet.
  2. Forsigtigt skyl gel med 1 mL PBS.
  3. Fix cellerne med 1 mL af 4% PARAFORMALDEHYD i 15 min.
  4. Cellerne vaskes to gange med 1 mL PBS.
  5. Pletten celler med DAPI løsning (100 ng/mL) i 20 min. ved stuetemperatur.
  6. Image celler ved hjælp af en Konfokal mikroskop på forskellige steder og at tage 400 µm z-stak billeder af hver placering i 16 µm-skridt. Mikroskop bruges har en disk scanning enhed, der muliggør Konfokal imaging ved hjælp af et hvidt lys, arc magnetisering kilde. Bruge en 20 X linse med numerisk blænde på 0,75.
  7. Rekonstruere billeder.
    1. Åbne billeder til en given gel (ca. 25 billeder) og oprette en billedstak ved at klikke på billedet → stakke → billeder at stable. Det første billede svarede til bunden af gelen (z = 0 µm), det andet billede svarede til det første trin i z-retning (z = 16 µm), det tredje billede svarede til det andet trin i z-retning (z = 32 µm). Vurdere hver kerne i hver billeddybde og udpege den dybde, hvormed kernen var i skarpeste fokus som invasion dybde for den pågældende celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har brugt en 35-mm kultur fad med et glas bund og rotte hale kollagen jeg at udvikle og optimere en in vitro- 3D invasion assay protokol. Ved hjælp af denne analyse, vi viste at bryst kræftceller MCF7 og MSC celler kunne invadere i kollagen gel til en gennemsnitlige afstand på 0,04 ± 1.8 µm og 41,3 ± 76,0 µm henholdsvis efter 48 h når IGF1 (18.6 ng/mL) blev brugt som chemoattractant (figur 2). Endnu vigtigere, viste vi at fusion produkter fra MSC og MCF7 celler, som er sjælden celler, kunne invadere i kollagen gelen så godt. Deres gennemsnitlige afstand af invasionen i 48 h var 10.7 ± 12,4 µm når IGF jeg på 18.6 ng/mL blev brugt som chemoattractant (figur 2). Forskellen i invasion evnen MCF7 og MSCs var statistisk signifikant (P < 0,01)11. Forskellen mellem invasion evne til fusion produkter og en af MCF7 eller MCSs var ikke statistisk signifikant. Denne analyse viste imidlertid konsekvent, at kræft celle fusion produkter havde en større vandrende og invasive kapacitet end forældrenes kræftcellerne, MCF7.

Celler forblev raske hele eksperimenter som det fremgår af deres morfologi og mængde 48 h post gel polymerisation (figur 3en). Med omvendt lodrette invasion assay design, kinetik af celle migration og invasion kan være analyseret (figur 3b, 4) og celle morfologi kan være vurderet (figur 4).

Figure 1
Figur 1 : Tidslinje for omvendt lodrette invasion assay design Venligst klik her for at se en større version af dette tal.  

Figure 2
Figur 2 : Invasion kapacitet af kræft celle fusion produkter. Invasion kapacitet af kræft celle fusion produkter kunne bestemmes ved hjælp af den omvendt lodrette invasion assay. Tallene repræsenterer den gennemsnitlige invasion kapacitet af fire uafhængige fusion produkter fra tre separate Co kulturer og deres forældres cellelinjer analyseret fra otte forskellige områder inden for hvert assay. Dette forsøg blev udført i tre eksemplarer. ANAVA med Tukey's HSD post hoc test. ** P < 0,01. Fejllinjer udgør standardafvigelse (SD). Dette tal er blevet tilpasset fra 11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Celle levedygtighed og Z serie af den omvendt lodrette invasion assay.
a) 20 X lysfelt billeder viser morfologi af celler under kollagen gel efter to dage. Fra venstre til højre MCF7 og MSC Co kultur, MCF7 og Civilingeniør; b) repræsentation af z serien viser to steder (i og ii) i en parabol fra bunden til toppen. Successive billeder er 16 µm apart. 3,8% FBS blev brugt som en chemoattractant. Grønne cirkler på begge paneler viser invaderende celler; Bemærk, ude af fokus på bunden af gelen og i fokus i den øverste gel, invaderer i gelen. Røde cirkler på begge paneler angive celler forbliver på det nederste lag af z-serien (ikke-invaderer celler). Skalalinjen (a): 15 µm; Skalere bar (b): 10 µm. Dette tal er blevet tilpasset fra 11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Celle morfologi i omvendt lodrette invasion assay. Morfologi af MSCs i kollagen gele på ét sted fra bunden (Z = 0 µm) til Z = 20 µm. 3,8% FBS blev brugt som en chemoattractant. Den lange pil angiver vedhæng til en MSC invaderer i gelen. Pilespidsen angiver en MSC, som er afstemt langs bunden af gelen, og ikke invaderende. Blå viser nukleare DAPI pletten, mens røde viser phalloidin farves actin filamenter. Dette tal er blevet tilpasset fra 11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her, beskriver vi en simpel omvendt lodrette invasion assay, som er bekvem for en række forskellige celletyper, herunder celler, der er sjældne og/eller afhængige af deres mikromiljø. I denne 3D invasion assay, celler forbliver i deres oprindelige mikromiljø og er omfattet af kollagen gelen indeholder et chemoattractant. Cellerne derefter migrere og invadere i kollagen. I denne analyse, kan cellerne farves og nemt overvåges i gelen. Enkelhed og reproducerbarhedsværdierne af denne analyse gør det et praktisk redskab til at studere kræft celle migration og invasion i en 3D system. Stærk chemoattractants synes dog at være forpligtet til at bryde det celle affinitet til bunden af kultur parabol.

Vi optimeret den omvendt lodrette invasion assay i 35-mm kultur parabol. Denne kultur parabol har et 10 mm glas-bund godt, hvilket er godt udstyret til billedbehandling. En begrænsning af denne kultur parabol er den betydelige mængde af kollagen gel kræves for at udføre en analyse. At finde mindre kultur retter med et design, der er kompatibel med billedbehandling ville være mere økonomisk. Gel lag passende for 35-mm parabol design er meget følsom på grund af sin styrke og kan nemt løsne sig fra bunden af pladen, hvis ikke håndteres forsigtigt. En anden celle kultur design kan forbedre stabiliteten af kollagen gel lag men kompatibilitet mellem kollagen gel styrke og celle levedygtighed skal optimeres.

På trods af disse begrænsninger præsenterer den omvendt lodrette invasion assay mange fordele i forhold til andre 3D invasion assay formater. Den største fordel er, at celler forbliver i deres oprindelige kultur miljø, hvilket ikke er tilfældet i Boyden kammer assay. Denne protokol bevarer celle mikromiljø, der er fordelagtigt for celler nøje kontrolleret af deres mikromiljø som stamceller15. Denne analyse også forhindrer celleskader eller celletab især for celler, der er delikat eller sjældne10,11. Derudover med denne analyse, kunne celle morfologi og tilknyttede kinetik vurderes inden for gel, som ikke er mulige med Boyden kammer assay. Desuden bruges ikke-fysiologisk polycarbonat eller polypropylen filter af Boyden kammer assay system ikke i den omvendt lodrette invasion assay. Omvendt lodrette invasion analyse er en statisk design, det efterligne ikke i vivo dynamisk miljø der mikrofluid invasion assay design tilbyder men det giver en enklere, mindre udfordrende og omkostningseffektiv 3D miljø til at kvantificere migration og invasion af en række forskellige celletyper i en bevarede og kontrolleret mikromiljø.

Omvendt lodrette invasion analysen har mange potentielle anvendelser i patofysiologiske undersøgelser. Denne tilgang kunne tjene som en in vitro- platform til at studere cellen motilitet under fosterudviklingen, sår healing, og/eller inflammatoriske respons3. Celle interaktion med ECM og andre celletyper under migration og invasion kunne også undersøges ved hjælp af denne protokol. Denne analyse kan også udgøre et nyttigt redskab for oprindelige stof screening af anti-metastatisk narkotika. En modelsystem af orgel-specifikke kræft metastaser kan udvikles ved hjælp af omvendt lodrette invasion analysen samt.

Omvendt lodrette invasion analysen blev udviklet for at omgå den udfordring, fordrivelse af nogle celler fra deres oprindelige mikromiljø præsenterer i Boyden kammer assay system. Denne analyse er nem, pålidelig og reproducerbar; Det er fleksibelt og kan bruges til at kvantificere de invasive potentialet i en lang række celletyper herunder følsomme og sjældne celletyper. Denne analyse kan anvendes til at afsløre den vandrende aktivitet forbundet med matrix nedbrydning og kan også tilpasses til at studere den selektive nedværdigende aktivitet på forskellige matrix substrater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har erklæret, at ingen konkurrerende interesser findes.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) gennem RCMI-Center for miljø og sundhed ved Jackson State University og US Department of Defense, idé Award 11-1-0205.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MatTek P35G-1.5-10C MatTek Corporation, Ashland, MA P35G-1.5-10-C mattek glass bottom dishes
Rat tail collagen I Corning, Corning, NY, USA 354236 Collagen gel
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA H1758 HCl
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA 10010023 PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA D2429 10X DMEM
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA S5761 NaHCO3
Confocal Fluorescent microscope Olympus America, Center Valley, PA, USA Olympus IX81 Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA SH30070.03 FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA 40x NA 0.8 objective MPLSM
Imaris software Bitplane Inc. Zurich, CH Imaris 7.5.2 Imaris software
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA D9542 DAPI
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA 50980487 PFA
α-minimum essential medium Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA M0894
MDA-MB-231 ATCC; Manassas, VA, USA HBT-22
MSC Trivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPO Olympus America, Center Valley, PA, USA 36-064 Olympus UPLSAPO 20X Objective

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  2. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  3. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
  4. Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
  6. Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
  7. Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
  8. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
  9. Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
  10. Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
  11. McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
  12. Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
  13. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
  14. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
  15. Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).

Tags

Kræftforskning sag 133 inverteret Invasion Migration tre-dimensionelle (3D) følsomme mikromiljø sjældne
Bevæger sig opad: En enkel og fleksibel <em>In Vitro</em> tredimensionale Invasion Assay protokol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McArdle, T. J., Ogle, B. M.,… More

McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol. J. Vis. Exp. (133), e56568, doi:10.3791/56568 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter