Summary
이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.
Abstract
3D 침입 분석을 개발 하 고, 그들의 microenvironment의 무결성을 영향을 주지 않고 세포를 연구 하는 도전 남아 있다. 전통적인 3D Boyden 챔버 필요한 셀은 원래 문화 위치에서 전치 하 고 새로운 환경에 이동와 같은 분석 실험. 뿐만 아니라이 microenvironment, 내부는 세포질 과정을 방해 하지만 그것은 종종 세포의 손실에 결과. 이러한 문제는 드문, 또는 그들의 microenvironment에 매우 민감한 세포와 거래 할 때 특히 도전. 여기, 우리 둘 다 문제를 방지 하는 3 차원 침공 분석 결과의 개발을 설명 합니다. 이 분석 결과에서 세포는 잘 작은 내 도금 고는 ECM 매트릭스는 chemoattractant를 포함 하는 셀 위에. 이 없는 셀 변위를 요구 하 고 행렬에 위쪽으로 침략을 셀 수 있습니다. 이 분석 결과에서 셀 침공으로 세포 형태 콜라겐 젤 내 평가 될 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 희귀 하 고 민감한 세포;의 침략 적 용량 특징 유방암 세포 MCF7 고 엽/multipotent 사이의 융합에서 발생 하는 하이브리드 세포 줄기/기질 세포 (MSCs).
Introduction
세포 운동 성 세포의 정상적인 발달 및 생리 적 과정 이다. 그러나, 변화 패턴 및를 침공 하는 세포의 능력에 염증 성 질환 및 암 전이1,2,3를 포함 하 여 병 적인 상태와 연결 됩니다. 전이 암에 가장 저조한 이해 측면. 전이, 암 세포 해야 합니다 여분의 세포 매트릭스 (ECM)을 저하를 현지 조직 및 intravasate를 침략. 혈액 순환, 암 세포는 먼 사이트에 유포 됩니다, 일단 extravasate 하 고 2 차 종양을 형성 한다. 따라서, 능력 저하는 ECM 셀, 마이그레이션, 침략 하 고 관련이 그들의 전이성 잠재력. 다른 방법은 분석 하 고 세포의 이동과 침략 기능 척도 개발 되었습니다. 가장 많이 사용 되는 접근 분석 결과, 시간 경과 현미경 검사 법, 그리고 Boyden 챔버 분석 결과 치유 하는 상처를 포함 한다. 상처 치유 분석 결과4 와 시간 경과 현미경 검사 법은 간단 하 고 편리한 분석 셀 마이그레이션에 예비 통찰력을 줄 것 이라고. 그러나, 둘 다는 세포 생체 내에존재 하는 3D 환경을 반영 하지 않는 2D 분석 실험입니다. 연구 결과 세포 2D 한5,6에 비해 3D 환경에 다르게 반응으로 나타났습니다. 또한, 상처 치유 분석 실험은 재현 하 고 양적 결과7,,89를 어렵습니다. 셀 제외 영역 분석 결과, 분석 결과 치유 하는 상처의 3D 수정 이면 더 순수 관련 분석 결과 이지만 하이브리드 셀 셀 퓨전 이벤트10,11 인 등 수에 낮은 셀에 적합 하지 않습니다. .
Boyden 챔버 분석 결과 세포 연구에 대 한 관련 microenvironments를 제공 하는 3 차원 분석 결과가 이다. 그러나, 그것은 그들의 원래 microenvironment에서 제거 하 고 예금 Boyden 분석 결과 시스템 마이그레이션 및 chemoattractant 포함 매체를 향해 아래쪽으로 침략의 위 상공으로 셀 필요 합니다. 이 3D 접근 취약 그들의 microenvironment 또는 제한 번호10,,1112셀의 마이그레이션 및 침략 기능 분석에 적합 하지 않다. 셀 마이그레이션 및 침략을 분석 하는 새로운 접근은 미세 그라데이션 챔버 시험13. 적합 하 고 마이그레이션 및 침략에 신뢰할 수 있는, 비록이 분석 결과 더 비싼 이며 전형적인 실험실에 대 한 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여기 그들의 microenvironment에 민감한 세포를 포함 한 많은 세포 종류와 호환은 숫자에 제한 된 간단한 반전된 세로 침공 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 후 퍼 그 외 여러분 에 의해 제안 된 프로토콜에서 적응 시켰다 14.이 분석 결과에서 셀 그들의 원래 microenvironment 및 그들의 이동에 남아 있고 chemoattractant11를 포함 하는 콜라겐 젤에서 위쪽으로 이동 침입 모니터링. 이 분석 결과 재현성 및 최적화 되었으며 35 m m 문화 접시에. 그것은 다른 세포 문화 크기, 다른 행렬 또는 접착, 및 다른 chemoattractants의 강도 포함 하 여 다른 시험 조건에 적응 시킬 수 있었다. 이 분석 결과 약 발견 과정에서 초기 심사를 위한 생체 외에서 플랫폼으로 될 수 있습니다.
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Protocol
참고:이 프로토콜은 McArdle 외 에 설명 11. 시간 표시 막대를 그림 1에 제공 됩니다.
1입니다. 문화 접시의 준비
- 유리 아래쪽의 hydrophobicity 낮은 15 분 1 mL의 1 M 염 산 (HCl)와 10 m m 유리 바닥을 포함 하는 35 m m 문화 접시 세척.
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 모든 HCl을 제거의 1 mL로 두 번 문화 접시 세척.
- 70% 에탄올의 1 mL로 두 번 문화 접시 세척.
- 셀 특정 문화 매체의 1 mL와 함께 문화 접시 린스 (여기, 사용 α-MEM 10% 열 보충 비활성화 FBS와 1% 비 본질적인 아미노산).
참고: 대우 문화 접시 문화 매체를 포함 하는 다음 날까지 37 ° C에서 가습기와 CO2 인큐베이터에 저장할 수 있습니다. - 35 m m 문화 접시의 잘 처리 유리 하단에 100 %confluency 세포 (MSCs 및 MCF-7 공동 문화)를 성장. 공동 문화 35000 MSC 세포와 24 h MCF7 셀 75000.
2입니다. 콜라겐 젤의 준비
- 접촉 시 콜라겐의 중 합을 방지 하기 위해 냉동 실에 콜라겐 젤 pipetting 사용 micropipette 팁을 저장 합니다.
참고: 이것은 가장 중요 한 단계 이다. - 볼륨을 확인 사용 되 나 콜라겐의 농도에 따라 쥐 꼬리 콜라겐의. 이 분석 결과 대 한 콜라겐 젤 100 µ L를 준비 합니다.
참고: 쥐 꼬리 콜라겐 나 재고의 높은 농도 더 작동 합니다. 10 배 따라 콜라겐을 희석 하는 데 사용할 Dulbecco의 수정이 글의 중간의 볼륨을 결정 합니다. - 난 (3.8 µ g/mL 증권), 10 x Dulbecco의 수정 독수리의 매체 및 1 x 세포 배양 매체 2% 태아 둔감 한 혈 청 및 2.4 mg/mL의 콜라겐의 최종 농도에 적절 한 chemoattractant 보충 얼음 쥐 꼬리 콜라겐에 결합.
- 나트륨 중 탄산염 해결책 콜라겐 젤 중화의 혼합물 4.5%를 추가 합니다.
참고: 나트륨 중 탄산염 솔루션 추가의 볼륨은 다른 시 약의 정확한 pH에 따라 달라질 수 있습니다. 이 pH 중립 해결책을 보장 하거나 산도 표시기를 사용 하 여 문화 매체에 스트립으로 혼합물을 테스트 하려면 좋습니다. - 바닥에 유리-잘 접시의 바닥 문화 내의 셀 콜라겐 혼합물의 80 µ L.
- 37 ° c.에서 가습기와 CO2 배양 기에서 30 분 동안 유해를 콜라겐 젤 허용
- 감소 된 혈 청 (2%)와 세포 매체의 2 mL와 함께 콜라겐 젤 커버 하 고 37 ° c 24, 48 또는 72 h에 대 한 가습기와 CO2 인큐베이터에서 세포를 품 어.
주의: 접시는 콜라겐 젤 유리 바닥에서 분리 하지 않도록 주의 처리 되어야 합니다.
3. 콜라겐의 준비의 예 젤 3.8 µ g /mL의 쥐 꼬리 콜라겐 재고를 사용 하 여
- 얼음, 쥐 꼬리 콜라겐의 114.5 µ L, DMEM, x 10의 16.6 µ L, 문화 매체를 포함 하는 chemoattractant의 33.1 µ L를 결합 한다.
- 나트륨 중 탄산염의 14.0 µ L로 콜라겐 혼합을 무력화.
- 2.5 단계에서 계속 합니다.
4. 셀의 이미징
- 부드럽게 요리에서 미디어를 제거 합니다.
- 부드럽게 1 mL의 PBS로 젤 린스.
- 15 분 동안 4 %paraformaldehyde 1 mL와 함께 셀을 수정 합니다.
- 두 번 1 mL의 PBS로 세포 세척.
- DAPI 솔루션 (100 ng/mL) 실 온에서 20 분에 대 한 셀을 얼룩.
- Confocal 현미경을 사용 하 여 다른 위치에서 400 µ m z-스택 이미지를 16 µ m 단계에서 각 위치의 셀을 이미지. 사용 하는 현미경 confocal 영상 하얀 빛, 아크 여기 소스를 사용 하 여 수 있도록 단위 스캔 디스크가 있다. 0.75의 숫자 조리개와 활용 20 X 렌즈를 사용 합니다.
- 이미지 reconstitute
- 주어진된 젤 (약 25 이미지)에 대 한 이미지를 열고 이미지 스택 스택 이미지 → 스택 → 이미지를 클릭 하 여 만듭니다. 첫 번째 이미지는 젤 아래쪽에 대응 (z = 0 µ m), 두 번째 이미지는 z 방향에서 첫 번째 단계에 대응 (z = 16 µ m), 세 번째 이미지는 z 방향에서 두 번째 단계에 대응 (z = 32 µ m). 각 이미지 깊이에 각 핵을 평가 하 고 있는 핵 했다 날카로운 초점에 해당 특정 셀에 대 한 침입 깊이 깊이 지정.
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Representative Results
우리 유리 아래쪽와 쥐 꼬리 콜라겐 35 m m 문화 접시 사용 개발 하 고 생체 외에서 3D 침공 최적화 나 프로토콜을 분석. 우리는 유 방 암 세포 MCF7 및 MSC 보였다이 분석 결과 사용 하 여 셀 48 h 후 각각 0.04 ± 1.8 µ m 및 41.3 ± 76.0 µ m의 평균 거리에 콜라겐 젤으로 침략 수 때 IGF1 (18.6 ng/mL) chemoattractant (그림 2)로 사용 되었다. 더 중요 한 것은, 우리는 드문 셀 인 MSC와 MCF7 셀에서 퓨전 제품 뿐만 아니라 콜라겐 젤으로 침입할 수 보였다. 48 h에 침략의 그들의 평균 거리 10.7 ± 12.4 μ m 때 IGF 18.6 ng/mL에 사용 되었다 chemoattractant (그림 2). MCF7와 MSCs 침공 기능에 차이 통계적으로 유의 한 (P < 0.01)11. 융합 제품의 내 습 기능 및 MCF7 또는 MCSs 중의 차이 통계적으로 중요 한 아니었다. 그러나,이 분석 결과 지속적으로 암 세포 융합 제품 MCF7 부모의 암 세포 보다 더 큰 철새 및 침입 기능을 했다 보여주었다.
세포의 형태 및 수량 48 h 포스트 젤 중 합 (그림 3a)와 같이 실험을 통해 건강 한 남아 있었다. 거꾸로 세로 침공 분석 결과 디자인, 세포 이동과 내 습의 활동 분석된 (그림 3b, 4) 될 수 있습니다 및 셀 형태 수 있습니다 (그림 4) 평가.
그림 1 : 반전된 세로 침공 분석 결과 디자인의 타임 라인 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 암 세포 융합 제품의 침공 기능. 암 세포 융합 제품의 침공 용량 반전된 세로 침공 분석 결과 사용 하 여 결정 될 수 있는. 번호는 3 개의 별도 공동 문화 및 그들의 부모의 세포 라인 각 분석 결과 내에서 8 다른 분야에서 분석에서 4 개의 독립적인 퓨전 제품의 평균 침공 용량을 나타냅니다. 이 실험은 3 중에서 수행 되었다. Tukey의 HSD 포스트 hoc 시험 ANOVA입니다. * * P < 0.01. 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. 이 그림 11에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 세포 생존 능력 및 반전된 세로 침공 분석 결과의 Z 시리즈.
2 일 후 콜라겐 젤 아래 셀의 형태를 보여주는 밝은 필드 이미지) 20. 왼쪽에서 오른쪽 MCF7 및 MSC 공동 문화, MCF7, 및 MSC; b) 정상에 바닥에서 접시에서 두 위치 (i와 ii)를 보여주는 z 시리즈의 표현입니다. 연속 이미지는 16 µ m 떨어져 있습니다. 3.8 %FBS chemoattractant로 사용 되었다. 그린 두 패널에 동그라미 표시 침입 세포; 참고, 젤의 하단 가기 젤, 젤으로 침입에 초점에 초점. 두 패널에 빨간색 동그라미 z 시리즈 (비 침입 셀)의 아래쪽 층에 남아 있는 셀을 나타냅니다. 눈금 막대 (a): 15 µ m; (B) 바 규모: 10 µ m. 이 그림 11에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 셀 반전된 세로 침공 분석 결과에서 형태학. 아래에서 한 위치에서 콜라겐 젤에서 MSCs의 형태 (Z = 0 µ m)는 z = 20 µ m. 3.8 %FBS chemoattractant로 사용 되었다. 긴 화살표는 젤으로 침입 하는 MSC의 돌출부를 나타냅니다. 화살촉, 젤의 하단을 따라 정렬 하 고 침입 하지는 MSC를 나타냅니다. 파란색은 빨간색 표시 phalloidin 묻은 걸 필 라 멘 트 하는 동안 핵 DAPI 얼룩을 보여줍니다. 이 그림 11에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 희귀 및 그들의 microenvironment에 의존 하는 셀을 포함 하 여 세포 유형의 다양 한 편리한 간단한 반전된 세로 침공 분석 결과 설명 합니다. 이 3D 침공 분석 결과에서 세포는 그들의 원래 microenvironment에 남아 하 고 콜라겐 젤 포함 하는 chemoattractant에 의해 보호 됩니다. 세포 이동 그리고 콜라겐에 침공. 이 분석 결과에서 셀 스테인드 고 쉽게 젤 내 모니터링 될 수 있습니다. 단순 하 고이 분석 결과의 재현성은 공부 하는 암 세포 이동과 내 습 3D 시스템에 대 한 편리한 도구 합니다. 그러나, 강한 chemoattractants 셀 선호도 문화 접시의 바닥에 휴식 하는 데 필요한 것 같다.
우리는 35 m m 문화 접시에 거꾸로 세로 침공 분석 결과 최적화. 이 문화 요리는 10 m m 유리 하단 잘 이미징에 대 한 잘 장착. 이 문화 접시의 한 가지 한계 분석을 수행 하는 데 필요한 콜라겐 젤의 상당한 금액입니다. 디자인 이미지와 호환 찾는 작은 문화 요리 더 경제적인 것입니다. 35 mm 접시 디자인에 대 한 적절 한 젤 레이어 그것의 힘 때문에 매우 섬세 한 고 접시의 바닥에서 쉽게 분리할 수 있습니다 하지 않을 경우 신중 하 게 처리. 다른 셀 문화 디자인 콜라겐 젤 층의 안정성을 향상 시킬 수 있습니다 하지만 콜라겐 젤 힘과 세포 생존 사이의 호환성을 최적화 합니다.
이러한 제한에도 불구 하 고 반전된 세로 침공 분석 결과 다른 3D 침공 분석 결과 형식에 비해 많은 장점을 제공 합니다. 주요 이점은 셀 경우가 아니라면 Boyden 챔버의 분석 결과에 그들의 원래 문화 환경에 남아 있는 것입니다. 이 프로토콜은 줄기 세포15등 그들의 microenvironment에 의해 엄격 하 게 제어 하는 셀에 대 한 유리 셀 microenvironment을 유지 합니다. 이 분석 결과 또한 세포 손상 또는 특히 섬세 한 또는 드문10,11셀 대 셀 손실 방지 합니다. 또한,이 분석 결과 함께 세포 형태 및 관련된 활동 수 부과 Boyden 챔버 분석 결과 함께 불가능 젤 내. 또한, 비 생리 적인 폴 리 카보 네이트 또는 폴 리 프로필 렌 필터 Boyden 챔버 분석 결과 시스템의 반전된 세로 침공 분석 결과에 사용 되지 않습니다. 거꾸로 세로 침공 분석 결과 정적 디자인, vivo에서 동적 환경 미세 침공 분석 결과 디자인 제공을 모방 하지 않습니다 하지만 간단 하 게, 도전적이 고 비용 효율적인 3D 환경 척도를 덜 제공 합니다. 마이그레이션 및 보존 및 제어 microenvironment에서 세포 유형의 다양 한의 침공
거꾸로 세로 침공 분석 결과 병 태 생리 연구에 많은 잠재적인 응용 프로그램을 있다. 이 방법으로 배아 개발, 세포 운동 성 공부를 생체 외에서 플랫폼 상처 치유, 또는 선 동적인 응답3될 수 있습니다. 또한이 프로토콜을 사용 하 여 마이그레이션 및 침략 동안 ECM와 다른 세포 유형 세포 상호 작용에 조사 수 있습니다. 이 분석 결과 또한 안티 전이성 약물의 초기 약물 검사에 대 한 유용한 도구를 대표할 수 있었다. 기관 특정 암 전이의 모델 시스템 뿐만 아니라 반전된 세로 침공 분석 결과 사용 하 여 개발 될 수 있습니다.
거꾸로 세로 침공 분석 결과 그들의 원래 microenvironment에서 일부 세포의 변위 Boyden 챔버 분석 결과 시스템에서 선물 도전 우회 하 개발 되었다. 이 분석 결과 쉽게, 안정적이 고 재현; 그것은 유연 하며 다양 한 종류의 세포와 희귀 한 종류를 포함 하 여의 침략 적인 잠재력을 계량 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석 결과 매트릭스 저하와 관련 된 철새 활동 검색에 적용할 수 있습니다 그리고 또한 다른 매트릭스 기판에 선택적 굴욕적인 활동 연구에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 관심 있는지 선언.
Acknowledgments
이 작품에서 잭슨 주립 대학 및 미국 부서 방어, 아이디어 상 11-1-0205의 환경 건강을 위한 RCMI 센터를 통해 건강의 국가 학회 (NIMHD-G12MD007581)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
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