Summary
في هذه المخطوطة، يصف لنا استخدام مقايسة مراسل fluorescence المستندة إلى الخميرة تحديد المكونات الخلوية متورطة في تهريب وقتل العمليات للسآمة للخلايا وحدة فرعية من مادة الريسين السمية النباتية (RTA).
Abstract
البكتيريا والنبات A/السموم ب استغلال مسارات الاتجار بالأشخاص الطبيعية في الخلايا حقيقية النواة للوصول إلى بهم داخل الخلية الهدف (ق) في سيتوسول وقتل في نهاية المطاف. هذه A/السموم ب تتألف عموما من نشاط انزيماتيكالي أسوبونيت (مثلاً، الريسين (RTA)) وخلية واحدة أو أكثر ملزم Bsubunit(s)، التي تعتبر مسؤولة عن السمية ملزمة محددة إلى الخلية المستقبلات السطحية. معرفتنا الحالية بطريقة أ/ب السموم قادرون على المسكرة العلماء الخلايا التي ساعدت على فهم الآليات الخلوية الأساسية، مثل الالتقام والبروتين داخل الخلية الفرز في الخلايا حقيقية النواة أعلى كفاءة. من وجهة نظر طبية، من المهم أيضا تحديد طرق الاتجار السمية الرئيسية لإيجاد حلول العلاج المناسب للمرضى أو لتطوير التطبيقات العلاجية على أساس السمية لعلاج السرطان في نهاية المطاف.
منذ التحليلات على نطاق الجينوم (أ) والتكسينية ب الاتجار في خلايا الثدييات هي معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة، عدة دراسات على أ/ب السم النقل قد أجريت في الحي النموذجي الخميرة Saccharomyces cerevisiae. على الرغم من كونها أقل تعقيداً العمليات الخلوية الأساسية في الخميرة وخلايا حقيقية النواة أعلى كثيرا من النتائج التي تحققت في الخميرة وهي مماثلة يمكن نقلها إلى حالة الثدييات.
هنا، يمكننا وصف مقايسة مراسل سريعة وسهلة الاستخدام لتحليل الاتجار داخل الخلايا لهيئة الطرق والمواصلات في الخميرة. ميزة أساسية للتحليل الجديد الفرصة للتحقيق ليس فقط المواصلات الرجعية-إزفاء من هيولى (ER) إلى سيتوسول، ولكن بدلاً من ذلك النقل الالتقام والسمية إلى الوراء من غشاء البلازما لائحة. الإنزيم يجعل استخدام بلازميد المراسل تمكن من قياس غير مباشر سمية هيئة الطرق والمواصلات من خلال الانبعاثات الأسفار من البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) وبعد الترجمة في فيفو . هذا الإنزيم منذ المواصلات كفاءة يمنع الشروع في تخليق البروتين الحيوي قبل 28S الرنا الريباسي ديبورينيشن، يسمح تحديد بروتينات الخلية المضيفة المعنية بالنقل المواصلات داخل الخلايا عن طريق الكشف عن التغييرات في الانبعاثات الأسفار.
Introduction
المرضى الذين يعانون من التهابات بالسمية تنتج البكتيريا تمثل عبئا طبية ومالية شديدة لكل نظام الرعاية الصحية الاجتماعية، لا سيما نظراً لكفاءة العلاجات العلاجية لا تزال مفقودة إلى حد كبير. لوضع استراتيجيات علاجية جديدة، آليات التسمم معقدة من الناحية الطبية ذات الصلة/ب السموم مثل الكوليرا السمية، والسمية شيغا، أو الريسين يجب أن تكون مفهومة تماما على المستوى الجزيئي استناداً إلى رواية فحوصات القوية التي يتعين تنفيذها.
في السنوات الأخيرة، حاولت عدة دراسات لتحليل أ/ب السم النقل في خلايا الثدييات باستخدام أساليب مضيعة للوقت وباهظة التكلفة مثل السمية الإشعاعية والخميرة وسم1،2 ، فضلا عن الفحص على أساس siRNA تقترب من3. وفي بعض الحالات، الاتجار بالسمية قد تصور في فيفو بالفحص المجهري الأسفار بعد اقتران الكيميائية و/أو الوراثية لمفارز السمية الفردية مع فلوروفوريس أو النقاط الكم أو بروتينات الفلورسنت4،5. لسوء الحظ، مثل هذه التعديلات غالباً ما تؤدي إلى غير نشط و/أو تغيير الخصائص الطبيعية للسموم. طريقة أنيقة أخرى غير مباشر الإجابة على مجموعة واسعة من المسائل العلمية هو استخدام نظم مراسل استناداً إلى الإنزيمات مثل لاكز، لوسيفراس، أو البروتينات الفلورية (مثل التجارة والنقل أو ديسكوسوما sp. (البروتين الأحمر نيون دسريد)).
في هذه المخطوطة، يوصف بروتوكول بسيط الذي يحدد مكونات الخلوية اللازمة للنقل داخل الخلايا للمواصلات اكستراسيلولارلي التطبيقية في S. cerevisiae. وبالتالي، بلازميد مراسل الأسفار التي تحتوي على إشارة الطرفي ن ER-استيراد تليها التجارة والنقل بمثابة جهاز استشعار بروتين الحيوي، الذي يقيس تثبيط البروتين هيئة الطرق والمواصلات بوساطة الترجمة غير مباشر بالتجارة والنقل fluorescence الانبعاثات بعد الحية الترجمة6. في حالة أن الالتقام المواصلات و/أو الاتجار بها داخل الخلايا سلبا (أو إيجاباً) يتأثر في متحولة حذف خميرة خاصة مقارنة بالبرية من نوع، يمكن هذا الكشف من خلال الزيادة (أو النقصان) في التجارة والنقل fluorescence انبعاث6.
وحتى الآن، جميع أساليب تحليل النقل المواصلات في خلايا الخميرة اقتصرت على عملية الرجعية-إزفاء ER إلى سيتوسول لهيئة الطرق والمواصلات. في مثل هذا نظام مصطنع، يعبر عن المواصلات التي تحتوي على إشارة استيراد ER من عاملاً إيندوسيبلي أدى إلى الانتحار من النمط الظاهري1،7. على الرغم من أن الخلية ملزمة ب-وحدة فرعية من مادة الرايسين المثل مفقود في الإعداد التجريبي المبين في هذه المخطوطة، وهكذا، لا يعكس الحالة الطبيعية لمادة الرايسين هولوتوكسين التسمم8، النقل السمية من البلازما يمكن أن يكون الغشاء عن طريق جهاز غولجي للائحة يحاكي عن كثب مع هذا التحليل رواية. من المثير للاهتمام، تشير النتائج الأولية التي تم الحصول عليها في الدراسة التجريبية إلى أن مسارات الاتجار استخدامها من قبل هيئة الطرق والمواصلات تكشف عن أوجه الشبه ملفتة للنظر مع مسار التسمم بالريسين هولوتوكسين.
وباختصار، يمكن استخدام الأسلوب وصف لتحديد الدور المحدد للاتجار بالخميرة والبروتينات الخلوية المحدد في الالتقام هيئة الطرق والمواصلات. وعلاوة على ذلك، هذا الإعداد التجريبية قد تكون تتكيف بسهولة مع الريبوسوم الأخرى يخمد السموم المنتجة ويفرز من مختلف الأنواع البكتيرية مثل زيموسين أو السمية شيغا والخميرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: نظرة عامة سير العمل التجريبي العام هو مبين في الشكل 1.
تنبيه: هيئة الطرق والمواصلات شديدة السمية بالنسبة للبشر. هناك حاجة إلى سلامة مختبر إذن S2 (ما يعادل 2 مستوى السلامة الأحيائية). يرجى ارتداء القفازات خلال التجربة بأكملها.
1-مغايرة التعبير عن المواصلات صاحب معلم في الإشريكيّة القولونية
- تحويل الخلايا كولاي مع التعبير بلازميد pET24-هيئة الطرق والمواصلات(له) 6 أو pET24a متجه فارغة(+) باستخدام البروتوكولات القياسية انهانسر9،10. الخلايا التي تحتوي على بلازميد فارغة كعنصر سلبي.
- بعد اختيار استنساخ إيجابية على ألواح رطل (100 ميكروغرام/مل) الذي يحتوي على كاناميسين، تلقيح خلايا تحتوي على بلازميد تعبير هيئة الطرق والمواصلات أو متجه فارغة في المتوسطكان مل 5 رطل (متوسط رطل مع 100 ميكروغرام/مل من كاناميسين) واحتضان في 37 درجة مئوية و 220 لفة في الدقيقة ح 24.
- الملحق 1 رطل Lكان متوسطة مع ثقافة ما قبل 5 مل واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة حتى وصلت إلى خلايا التطوير التنظيمي600 من 0.8-1.0 (حوالي 3-4 ح). بعد ذلك، خفض الثقافة درجة الحرارة إلى 28 درجة مئوية وإعداد م 1 الأيزوبروبيل-β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) حل الأسهم في ح2o.
- حمل تعبير هيئة الطرق والمواصلات من كولاي بإضافة إيبتج إلى تركيز نهائي من 1 مم.
- بعد ح 3.5 في 28 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة، خلايا الحصاد بالطرد المركزي في ز 10,000 x و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، يغسل بيليه مرتين مع 5 مل من ربط المخزن المؤقت (500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 مم، و 20 مم خ2ص4 ، pH = 7.4) 10 آلاف x ز و 4 درجات مئوية عن 10 دقيقة، وبيليه ريسوسبيند في المخزن المؤقت لربط 5 مل.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول في هذه المرحلة، ويمكن تخزين الخلايا عند 80 درجة مئوية لعدة أيام.
2-تنقية صاحب معلم المواصلات عبر التقارب اللوني
- Sonicate الخلايا على الجليد باستخدام البروتوكول التالي: 15 s نبض (20 ميكرون)، 30 s وقفه. كرر هذه الخطوة من خمس مرات.
- الطرد المركزي خلية في 21,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وتصفية المادة طافية باستخدام نظام تصفية المحاقن معقمة (0.2 ميكرون حجم المسام).
ملاحظة: الكريات الخلايا من عينات سونيكاتيد بنجاح تظهر حدود شفافة. - استخدام نظام تنقية الآلي مجهزة 5 مل ني2 +-القائمة على عمود النسب لتنقية الكسر المواصلات صاحب معلم من العقيمة التي تمت تصفيتها كولاي طافية. بشكل عام، استخدم بسرعة شطف 1 مل/دقيقة وتبريد نظام تنقية كاملة لمنع فقدان النشاط السمية والسمية غير الكفء الملزمة.
ملاحظة: يتم سرد المعلمات لكفاءة المواصلات تنقية في الجدول 1. انظر أيضا بيكر وآخرون. لمزيد من المعلومات،9.- بإيجاز، حجته العمود تقارب مع 20 مل من المخزن المؤقت ملزم لإزالة المخزن المؤقت التخزين. وتنطبق المادة طافية العقيمة تصفية على عمود النسب استخدام المحاقن.
- أغسل العمود مع مل 25-35 من المخزن المؤقت ملزم لإزالة البروتينات غير منضم من العمود. نفذ الخطوة الغسيل حتى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نيوتن متر بالقرب من الأشعة فوق البنفسجية القيمة الأولية.
- الوت منضم الكسر هيئة الطرق والمواصلات في مل 20-35 من شطف المخزن المؤقت (ايميدازول 500 ملم، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 20 مم خ2ص4، ودرجة الحموضة = 7.2) والاحتفاظ بالعينة على الجليد (الشكل 2 ألف و 2 باء الشكل).
ملاحظة: تم وضع علامة شطف الكسر هيئة الطرق والمواصلات بزيادة في امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. يرجى ملاحظة حصرا جمع هذا الكسر لمنع التلوث مع البروتينات منضم غير محدد. - استخدام 20 ميليلتر من عينات التيد لأداء الأزرق أخذ تلطيخ11 أو12،تحليل لطخة غربية13 (اختياري). استخدم الابتدائية صاحب المضادة الأجسام المضادة (1:1، 000) والثانوي المضادة-موس-مفتش-برنامج الصحة الإنجابية (01:10، 000) للكشف عن هيئة الطرق والمواصلات، والتحقق من نموذج النقاء (الشكل 3).
- تحلية التيد الكسر هيئة الطرق والمواصلات على عمود ديسالتينج 5 مل وحجته عينة في السوربيتول 0.8 م.
- استبدال العمود تقارب نظام تنقية حسب العمود ديسالتينج وحجته الأولى العمود مع 20 مل السوربيتول 0.8 م.
- تطبيق الكسر المواصلات التيد إلى العمود عن طريق حقنه. أغسل العمود مع 100 مل السوربيتول 0.8 متر والوت الكسر هيئة الطرق والمواصلات ديسالتيد في أنبوب 15 مل حالما يبدأ امتصاص الأشعة فوق البنفسجية زيادة (الشكل 2).
- تخزين الكسر المواصلات التيد في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: إيقاف مباشرة هيئة الطرق والمواصلات جزء المعاينة عند زيادة الموصلية لتجنب تلوث الملح. يتم سرد المعلمات لإجراء ديسالتينج في الجدول 1.
- تركز الوتيد الكسر هيئة الطرق والمواصلات في ز 10,000 x و 4 درجة مئوية لمدة 30-180 دقيقة استخدام عمود دوران وقف إنتاج المواد الانشطارية كاتشين 10 إلى وحدة تخزين نهائي 1-2 مل وتخزين العينات في 4 درجات مئوية لمدة 3-4 أسابيع.
تنبيه: لا تجميد العينة منذ التجميد يؤدي إلى خسارة كاملة لنشاط هيئة الطرق والمواصلات. - تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة أدوات تصميم بروتين تقليدية. وينبغي تركيز البروتين في النطاق من 1-1.5 ملغ/مل.
ملاحظة: هيئة الطرق والمواصلات يميل إلى التعجيل إذا كان تركيز البروتين مرتفع جداً (> 5 ملغ/مل).
3-الخميرة التحول وإزالة جدار الخلية
- تحويل طفرات الحذف الخميرة البرية من نوع أو المحدد مع بروتينات فلورية خضراء مراسل بلازميد pRS315 K28SPبروتينات فلورية خضراء-6 استخدام الليثيوم القياسية خلات تحول أساليب14. احتضان خلايا على leucine التسرب (د/س) لوحات الجلوكوز (السكر 2% أجار 1.5%، كبريتات الأمونيوم 0.5%, 0.17% قاعدة النيتروجين الخميرة (YNB) و 0.087% d/يا ميكس دون leucine) عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام للتحديد استنساخ إيجابية.
- اختيار 3 استنساخ الخميرة مختلفة من كل لوحة وتطعيم المستنسخين في 100 مل من ليوسيني د/س raffinose المتوسطة (raffinose 2% كبريتات الأمونيوم 0.5%, 0.17% YNB و 0.087% d/يا مزيج دون leucine) في دورة في الدقيقة 220 و 30 درجة مئوية إلى OD600 = 1.0 2.0 (2-4 × 107 خلايا/مل).
ملاحظة: يختلف نمو الخلايا من سلالات الحذف الخميرة مختلفة. رصد OD600 عن طريق جهاز المطياف الضوئي. - لحساب قيم600 OD، تخفف من العينات إلى OD600 = 0.1-0.3 (1:5 إلى 01:10 تخفيف) وقياس OD600 في جهاز المطياف الضوئي. كمرجع، استخدام ح2س تستكمل مع المبلغ المقابل ل leucine د/س رافيونوسي المتوسطة.
- بعد الانتهاء من الخطوة 3، 5، مزيج 4 ميليلتر لثقافة سفيروبلاستيد 50 مل مع المخزن المؤقت سفيروبلاستينج ميليلتر 496 (حوالي 2 × 106 جدارها) والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 400 x ز.
- ريسوسبيند بيليه في 10 مل ح2س المقطر، نموذج دوامة ل 30 ثانية، ولوح بها 10 ميليلتر من العينة على leucine د/س ألواح الجلوكوز (السكر 2% أجار 1.5%، كبريتات الأمونيوم 0.5%, 0.17% YNB و 0.087% d/يا ميكس دون leucine).
- احتضان خلايا لمدة 3 أيام في 30 درجة مئوية. إجمالي عدد مستعمرات الخلايا المزروعة على اللوحة. لتقييم البيانات، استخدم فقط من العينات بكفاءة أعلى من 98% (إجمالي عدد الخلايا مستعمرة < 40 المستعمرات/اللوحة).
4-التجارة والنقل مراسل المقايسة القياس في لوحات 96-جيدا
- البذور من جدارها خلايا الخميرة التي تم الحصول عليها في الخطوة 3، 7 إلى 96-جيدا لوحات (200 ميليلتر في البئر).
- إضافة 70 ميليلتر لوسين استقرت د/س raffinose المتوسطة التي تحتوي على عنصر التحكم السلبي (النذرة ني2 +-تقارب خلية المنقي ليستي من الخلايا التي يسببها إيبتج كولاي معربا عن متجه فارغة) أو تنقية هيئة الطرق والمواصلات في تركيز هيئة الطرق والمواصلات نهائي من 5 ميكرومتر ( المقابلة لهيئة الطرق والمواصلات 160 غرام/لتر) في كل بئر.
- فورا إضافة 30 ميليلتر استقرت اللبن الحل (اللبن 30 ٪، السوربيتول 0.8 متر) للحث على تعبير بروتينات فلورية خضراء وبعد ذلك البدء القياس.
ملاحظة: إجراء replicates التقنية على الأقل 3 للتجربة وإنشاء نسخ متماثلة 3 البيولوجية كل سلالة الخميرة. - بعد الانتهاء من إعداد نموذج (الخطوات 4، 1-4-3)، وضعت لوحة 96-جيدا في قارئ الأسفار وبدء القياس. استخدام عامل تصفية نانومتر 475/509 مجموعة مطلوبة من أجل كشف fluorescence التجارة والنقل. إجراء القياسات في 30 درجة مئوية، 120 دورة في الدقيقة، ويبلغ قطرها 1 ملم على مدى إطار زمني من ح 20 (قياس فترات من 10 دقيقة) تهتز.
ملاحظة: تعيين عامل تصفية بروتينات فلورية خضراء تتوفر عادة في جميع نظم القارئ. يمكن ضبط درجة الحرارة، والإطار الزمني، قياس فترات، وتركيز هيئة الطرق والمواصلات للاحتياجات الخاصة. وتظهر نتائج الممثل في الشكل 4. - اختياري: استخدام ضوابط داخلية إضافية في القياس لمراقبة الجودة. إعداد عنصر تحكم سلبية بإضافة 30 ميليلتر لوسين استقرت د/س raffinose المتوسطة بدلاً من اللبن 30% (لا التجارة والنقل التعريفي). وباﻹضافة إلى ذلك، أضف ميليلتر 70 من 0.8 م السوربيتول استقرت G418 الحل (300 ميكروغرام/مل). بمثابة مثبط ترجمة البروتين G418 مراقبة إيجابية لتثبيط البروتين كما أنه يمنع التعبير بروتينات فلورية خضراء في الخميرة.
- حساب النسبية fluorescence بروتينات فلورية خضراء في المئة للنقطة 20 ح الوقت وفقا للمعادلة التالية (انظر الشكل 4A):
"نورث كارولاينا حيث" هو التحكم بالسلبية
- وبدلاً من ذلك، تحديد الأسفار بروتينات فلورية خضراء النسبي لكل نقطة قياس (في هذه الحالة 10 دقيقة، انظر أيضا خطوة 4.4) باستخدام المعادلة المذكورة أعلاه. كما هو موضح في الشكل 4 باء، إنشاء رسم بياني من النشاف كثافات fluorescence بروتينات فلورية خضراء المحور (ص) على مر الزمن (س).
"نورث كارولاينا حيث" هو التحكم بالسلبية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سير العمل العام للبروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة يتضح في الشكل 1، تلخص تقريبا واحد خطوات ناجحة المواصلات تنقية وبروتينات فلورية خضراء مراسل مقايسة التجربة اللاحقة. يمكن الاطلاع على وصف أكثر تفصيلاً لكل خطوة فردية في البروتوكول. ويبين الشكل 2 النتيجة المتوقعة لتنقية المواصلات الناجحة التي تقارب اللوني (الشكل 2A)، ومكافحة ناقلات فارغة (الشكل 2). ويبين الشكل 2 نتيجة تمثيلاً لتجربة desalting يوضح الفصل المثالي من ذروة البروتين (الأزرق) وذروة التيد الملح (براون). ويرد تنقية المواصلات فعالة شكل الملطخة بأخذ الحزب الديمقراطي الصربي-جل في الشكل 3. وأخيراً، يلخص الشكل 4 بعض النتائج الأصلية التي تم الحصول عليها بهذا الأسلوب المقايسة مراسل بسيطة وقوية تستند إلى التجارة والنقل6. ويوضح الشكل 4A أن المقايسة مراسل بروتينات فلورية خضراء ثابتة قادرة على تحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها، ويصور تخطيطياً بلازميد مراسل التجارة والنقل المستخدمة في هذه الدراسة. في الرسم البياني، الأسفار بروتينات فلورية خضراء النسبي من جدارها الخميرة تحت ظروف المواصلات المعالجة وغير المعالجة مقارنة مع بعضها البعض. كما هو متوقع، تظهر الخلايا المستحثة بغير فضلا عن تعامل G418 تقريبا لا الأسفار التجارة والنقل. في الخلايا غير المعالجة والسلبية المعالجة بالتحكم (موجه فارغ)، وتعبير بروتينات فلورية خضراء لا يتأثر ولا تراعي الاختلافات الكبيرة بين كل العينات. على النقيض من ذلك، العلاج المواصلات يؤدي إلى التخفيض المتوقع بروتينات فلورية خضراء fluorescence توسط الريبوسوم تثبيط النشاط. في الشكل 4 باء، يتم عرض منحنى وقت لتثبيط fluorescence التجارة الناجمة عن هيئة الطرق والمواصلات والنقل. هذا النوع من العرض التقديمي للبيانات تحتوي على معلومات إضافية حول التوقيت التعبير التجارة والنقل (90 دقيقة بعد التعريفي اللبن) ونقطة انطلاق لتثبيط متعدية بهيئة الطرق والمواصلات (210 دقيقة بعد التطبيق في البرية من نوع الخلايا). يعكس التأخير في انخفاض الأسفار بوساطة هيئة الطرق والمواصلات الأكثر احتمالاً بحركية الامتصاص والنقل داخل الخلايا لهيئة الطرق والمواصلات إلى سيتوسول. ويوضح الشكل 4 fluorescence بروتينات فلورية خضراء النسبية تم الحصول عليها من طفرات الخميرة المحدد بعد ح 20 هيئة الطرق والمواصلات-العلاج ومقارنة لهيئة الطرق والمواصلات-العلاج ومقارنة مع المعالجة بالمواصلات البرية من نوع الخلايا. وقد تم اختيار مكونات أراد Hrd1p و Der1p كعناصر تحكم مناسبة إيجابية لأن الدراسات السابقة أثبتت بالفعل أن كل البروتينات ينطوي على ريتروترانسلوكيشن ER إلى سيتوسول لهيئة الطرق والمواصلات في الخميرة1. ولذلك، تظهر كلا طفرات الزيادة المتوقعة في الأسفار بروتينات فلورية خضراء مقارنة بالخلايا البرية من نوع. وفي المقابل، بروتينات فلورية خضراء fluorescence القيم النسبية في Δyos9 والخلايا Δnup120 لا تختلف اختلافاً كبيرا. فعلا فقد وصف بأنه لا نقص يكتين مراقبة الجودة ER Yos9p لا نقص في البروتين المسام النووية Nup20p تؤثر على المواصلات سمية والنقل1. يمكن الاطلاع على قائمة بمعلمات الفصل اللوني والملحي النسب المحددة في الجدول 1.
رقم 1: سير العمل العامة لتنقية هيئة الطرق والمواصلات والتحليل القائم على التجارة والنقل مراسل. تنقية هيئة الطرق والمواصلات (يسار) يبدأ بالتحول من كولاي بالتعبير أو متجه فارغة متبوعاً بزراعة والمواصلات التي يسببها إيبتج التعبير. بعد تحلل الخلية والعقيمة الترشيح، هو تنقية المادة طافية عبر ني2 + التقارب اللوني ويتم التحقق من نقاء العينة عن طريق أخذ تلطيخ أو لطخة غربية. قبل الكسور المواصلات الوتيد جاهزة للاستخدام في التجربة المقايسة مراسل بروتينات فلورية خضراء، الكسور تحتاج إلى ديسالتيد ومركزة، ويجب تحديد تركيز البروتين. بروتينات فلورية خضراء مراسل مقايسة التجربة (يمين) يبدأ بتحول طفرات الحذف الخميرة البرية من نوع و/أو المحدد مع بنية التعبير التجارة والنقل. بعد زراعة، يتم إزالة جدار الخلية بواسطة العلاج الأنزيمي للسماح لهيئة الطرق والمواصلات في فيفو امتصاص. ثم، يتم قياس fluorescence بروتينات فلورية خضراء من الخميرة الخلية جدارها تحت ظروف السمية المعالجة وغير المعالجة على مر الزمن في قارئ الأسفار (475/509 نانومتر). وأخيراً، النسبي بروتينات فلورية خضراء fluorescence تحدد باستخدام المعادلة هو موضح في الخطوة 4، 6 ويتم عرض كما هو موضح في الشكل 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: اللوني تقارب الممثل والملحي نتائج كولاي الخلايا التي تحتوي على الحيوانات الأليفة-المواصلات(له) 6 أو ناقلات فارغة. (أ) تنقية نموذجي الرسم البياني عينة ليساتي كولاي خلية معربا عن هيئة الطرق والمواصلات(له) 6 من ناقلات pET24-المواصلات(له) 6. يمثل المنحنى الأزرق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 nm الناجمة عن الحلقات العطرية من الأحماض الأمينية Cys الراديكالي وصور، ويخدم كمؤشر البروتين. أثناء تحميل العمود، يتم الكشف عن البروتينات غير منضم في التدفق من خلال (0-10 مل). بعد إزالة البروتينات غير منضم بالغسيل مع المخزن المؤقت ملزم، هو زيادة تركيز المخزن المؤقت شطف من 0 إلى 100% (المنحنى الأحمر) وهي التيد البروتينات المرتبطة مباشرة من العمود. تمثل ذروة المنحنى الأزرق بين 25 و 30 مل جزء صغير المواصلات صاحب معلم منضم (الصندوق الأسود). (ب) تنقية نموذجي الرسم البياني كولاي ليستي من الخلايا معربا عن مكافحة ناقلات فارغة. بروتوكول تنقية نفسه كما هو الحال في (أ). كما هو موضح في المربع الأسود، هي الوتيد البروتينات لا من الأعمدة في عنصر التحكم السلبي. (ج) رسم تخطيطي ديسالتينج كولاي pET24-هيئة الطرق والمواصلات(له) 6 عينة بعد انجذاب تطهير. الرسم البياني يوضح انفصال جزء صغير البروتين المواصلات (ذروة 280 nm الاستيعاب بين 20-30 مل) والكسر الملح (زيادة الموصلية الذروة بعد 30 مل).الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
رقم 3: تحليل عينات مختلفة قبل وبعد انجذاب تطهير الغربية الممثل. 20 ميليلتر خلية ليساتي (الممرات 2-4) أو عينة المنقي (الممرات 5-7) لمختلف المتغيرات المواصلات (استخدمت فقط غير معدلة المواصلات في هذه الدراسة) تحليلها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وتلطيخ أخذ الأزرق. لين 1، سلم البروتين؛ لين 2، غير معدلة المواصلات؛ لين 3،هديلمن هيئة الطرق والمواصلات؛ لين 4،KDELمن هيئة الطرق والمواصلات؛ لين 5، هيئة الطرق والمواصلات غير معدلة؛ لين 6،هديلمن هيئة الطرق والمواصلات؛ لين 7، هيئة الطرق والمواصلاتKDEL. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الحصول على نتائج ممثلة بمقايسة مراسل للمعالجة بالمواصلات البرية من نوع ومختارة الخميرة طفرات الحذف. الأسفار (A) النسبي بروتينات فلورية خضراء من البرية من نوع جدارها الخميرة تحتوي على مراسل بلازميد pRS315-K28س-التجارة والنقل (يمين) تحت المستحث (اللبن 3%، جفبيند.) والناجمة عن عدم (raffinose 2 ٪، جفبريبر.) الظروف بعد ح 20 بروتينات فلورية خضراء التعريفي. النسبي بروتينات فلورية خضراء fluorescence تم تحليلها أيضا بحضور هيئة الطرق والمواصلات (5 ميكرومتر)، G418 (300 ميكروغرام/مل) أو مراقبة سلبية (NC). التحكم الإيجابي بمثابة مثبط ترجمة البروتين G418 ويمنع التعبير بروتينات فلورية خضراء في الخميرة. يتم الإشارة إلى قيم المتوسط الحسابي، والانحراف المعياري (SD). (ب) النسبي بروتينات فلورية خضراء الأسفار من (أ) عرض بالوقت الحال ما يزيد على 20 ح. هذا الرسم التخطيطي يوفر معلومات إضافية حول التوقيت لتثبيط التعبير والترجمة بروتينات فلورية خضراء بهيئة الطرق والمواصلات؛ ويعكس سلوك منحنى غير مباشر حركية امتصاص هيئة الطرق والمواصلات والنقل داخل الخلايا سيتوسول. (ج) نتيجة تمثيلية مختارة الخميرة طفرات خلل في البروتينات الخلوية التي هي معروفة لتكون المشاركة (Hrd1p و Der1p) أو لا تشارك (Yos9p و Nup120p) في هيئة الطرق والمواصلات الاتجار بالخميرة1،6. خط منقط يمثل حدا أقصى الأهمية التي تستند إلى انبعاث الأسفار التي حصل عليها سلالات السيطرة الإيجابية (لمزيد من التوضيح راجع المرجع6). يتم الإشارة إلى قيم المتوسط الحسابي، والانحراف المعياري (SD). تم تعديل الرقم من بيكر et al. 6 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المعلمة تشروموتوجرافي تقارب | ||
| قياس البارامترات | الأشعة فوق البنفسجية (280 nm)، شطف المخزن المؤقت التركيز، الموصلية | |
| إعدادات | متغير/الوحدة | القيمة |
| معدل التدفق | مل/دقيقة | 1 |
| ضغط عمود كحد أقصى | الآلام والكروب الذهنية | 0.35 |
| الطول الموجي | شمال البحر الأبيض المتوسط | 280 nm |
| المخزن المؤقت للربط | مضخة موقف | A |
| شطف المخزن المؤقت | مضخة موقف | ب |
| انطلاق تركيز شطف العازلة | % | 0 |
| نظام حجم التعويض | مل | 10 |
| الموازنة العمود | مل | 20 |
| حقن عينة على سوبيرلوب/حقنه | مل | حجم الخلية ليستي |
| غسالة خطوة | مل | 20-35 |
| خطوة شطف | مل | 20-35 |
| المخزن المؤقت شطف التركيز أثناء شطف | % | 100 |
| تقويم العمود مع 20% EtOH | مل | 50 |
| المعلمة الملحي | ||
| قياس البارامترات | الأشعة فوق البنفسجية (280 nm)، الموصلية | |
| إعدادات | متغير/الوحدة | القيمة |
| معدل التدفق | مل/دقيقة | 4 |
| ضغط عمود كحد أقصى | الآلام والكروب الذهنية | 0.35 |
| الطول الموجي | شمال البحر الأبيض المتوسط | 280 nm |
| المخزن المؤقت للربط | مضخة موقف | A |
| شطف المخزن المؤقت | مضخة موقف | ب |
| انطلاق تركيز شطف العازلة | % | 0 |
| نظام حجم التعويض | مل | 10 |
| الموازنة العمود | مل | 20 |
| حقن عينة على سوبيرلوب/حقنه | مل | حجم الخلية ليستي |
| الملحي حقن المخزن المؤقت (0.8 م السوربيتول) | مل | 100 |
| تقويم العمود مع 20% EtOH | مل | 50 |
الجدول 1: المعلمات المستخدمة لتنقية المستندة إلى عمود النسب والملحي. قائمة بكافة إعدادات الأعمدة ذات الصلة (مثلمعدل التدفق وشطف المخزن المؤقت تركيز، والموازنة ومدة خطوة الغسيل) وقياس البارامترات (مثلاًأو الموصلية أو امتصاص الأشعة فوق البنفسجية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عند تنفيذ هذا البروتوكول، نوصي بالاقتراحات التالية لتحقيق نتيجة ناجحة لهذه التجربة.
للتعبير مغايرة من البروتين، ومن المهم أن لا يتجاوز تركيز إيبتج 1 مم. تركيزات إيبتج > 1 مم تمنع التعبير هيئة الطرق والمواصلات وتؤدي إلى انخفاض غلة السمية المستحثة بالمروج. وعلاوة على ذلك، الخلايا لا ينبغي المزروعة في درجة حرارة أعلى من 28 درجة مئوية لمنع تشكيل الهيئة إدراج وعدم كفاءة قابلة للطي، والمنظمة السمية. من الممكن التعبير المواصلات في انخفاض درجة الحرارة (مثلاً، 20-28 درجة مئوية) ويؤدي أيضا إلى إنتاج البيولوجية والتكسينية النشطة. ومع ذلك، خفض درجة حرارة إضافية لا يحسن إلى حد كبير نشاط هيئة الطرق والمواصلات/الطي والنتائج في عائد إجمالي السمية أقل مقارنة إلى 28 درجة مئوية (البيانات لا تظهر).
تنقية معايير التقارب اللوني (الجدول 1) هي الأمثل لاستخدام نظام تنقية الآلي مجهزة 5 مل ني2 + تقارب العمود وينبغي تعديل أنظمة أخرى للعمود الصنع أو التجارية إذا هيئة الطرق والمواصلات نقاء والغلة دون المستوى الأمثل. في حالة نقاء المواصلات دون المستوى الأمثل (المشار إليها بمظهر البروتينات الإضافية في الحزب الديمقراطي الصربي-المواد الهلامية الملطخة بأخذ)، زيادة في تركيز ايميدازول المخزن المؤقت ملزم يقلل عادة ملزمة غير محدد من البروتينات مشحونة بشكل إيجابي العمود، مما يؤدي إلى زيادة نقاء هيئة الطرق والمواصلات العامة. في حالة دون المستوى الأمثل المواصلات الغلال، والأخذ بخطوات إضافية صوتنه (4-8 البقول) أو حضانة أطول الأوقات (ح 5) أو وحدات تخزين أكبر من ثقافة (> 1 لتر) يمكن أن تساعد على تحسين الغلة السمية الشاملة. ومع ذلك، هناك أيضا فرصة لتنقية هيئة الطرق والمواصلات بنجاح عن طريق زيادة ونقصان العمود على أساس نظم (البيانات لا تظهر) إذا لم يتوفر نظام مؤتمت في المعمل.
أثناء الخطوة ديسالتينج، من المهم أن تخطي إجراءات أخذ العينات حالما يبدأ الموصلية في الارتفاع. ويؤثر التلوث مع الملح، ولا سيما ايميدازول، قياس تركيز البروتين، أسفر عن تحديد تركيز هيئة الطرق والمواصلات غير دقيقة مما يؤثر تأثيراً مباشرا على محتوى المواصلات المستخدمة في التحليل مراسل بروتينات فلورية خضراء.
من الضروري لتخزين المواصلات المنقاة في 4 درجات مئوية وتجنب تجميد. إظهار العينات المجمدة انخفاض نشاط من هيئة الطرق والمواصلات في الخلية على أساس XTT فحوصات حيوية في خلايا هيلا (البيانات لا تظهر). يمكن الاحتفاظ بعينات المنقي لحوالي 3-4 أسابيع قبل النشاط البيولوجي يتناقص باستمرار. وباﻹضافة إلى ذلك، تركيزات عالية من هيئة الطرق والمواصلات (إيه فايف mg/mL) بعد تركيز عمود الدوران الحاسمة للمواصلات يظهر ميلا التعجيل في السوربيتول 0.8 م.
عيب الأسلوب هو حقيقة أن هيئة الطرق والمواصلات هي عادة لم يأخذ بخلايا الخميرة سليمة. لتحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها، يحتاج جدار خلية الخميرة المراد إزالتها تماما بالعلاج الأنزيمي. ولذلك، من الضروري أن تحقق الكفاءة تشكيل سفيروبلاست لكل سلالة الخميرة بالطرق الموضحة في الخطوات 3.4-3.5. في حالة إعداد سفيروبلاست دون المستوى الأمثل، ينبغي الأمثل وقت الحضانة وتركيز الإنزيم الحال ورصدها عن طريق الطوري. ويمكن منع أوفيرديجيسشن (تشكيل شبح) يقلل وقت الاعتقال و/أو حضانة الإنزيم الحال حين النهج المعاكس مطلوب في حالة عدم كفاية الهضم. ينبغي أن تستبعد البيانات من سلالات مع إزالة جدار الخلية غير كافية من تقييم البيانات.
كما تجدر الإشارة إلى أن الإعداد التجريبية لا تقليد تماما عملية التسمم الطبيعي لمادة الريسين. يفتقد وحدة ب ملزمة خلية فرعية من مادة الريسين (RTB) المسؤولة عادة عن السمية كفاءة الربط ببقايا اللبن على سطح خلية من خلايا الثدييات15. من الناحية النظرية، يمكن التغلب على هذا القيد عن طريق إجراء التجربة مع الريسين المنقي هولوتوكسين المتضمن في وحدة فرعية A و B. ومع ذلك، لا تملك خلايا الخميرة بقايا اللبن على سطحها الخلية التي يمكن التوسط الملزم ل RTB8؛ وهذه الحقيقة يفسر أيضا لماذا خلايا الخميرة سليمة ليست حساسة ضد الريسين. وهكذا من الواضح إذا RTB سيكون بمثابة خلية ربط مكون في نموذج الخميرة. من المثير للاهتمام، أثبتت الدراسات السابقة أن هيئة الطرق والمواصلات قادرة على الوصول إلى سيتوسول خلايا الثدييات دون خليته ملزمة وحدة فرعية ب16. لفهم هذه الظاهرة، قررنا استخدام المواصلات فقط في الإعداد التجريبي لتحديد المكونات الخلوية بالخميرة التي تيسر السمية الاتجار من غشاء البلازما في سيتوسول. من المستغرب أن إظهار مكونات المتورطين في الاتجار بالخميرة هيئة الطرق والمواصلات الشبه ملفتة للنظر إلى المكونات المطلوبة لمادة الرايسين كفاءة النقل هولوتوكسين في خلايا الثدييات6. وبناء على هذه النتائج، يمكن أن يكون تكهنت أن RTB يلعب دوراً ثانوياً في النقل الريسين داخل الخلايا مما سبق من المفترض والمهم فقط للاتصال الأولى إلى سطح الخلية الثديية.
وفي المقابل، الأنظمة المستندة إلى siRNA في خلايا الثدييات تماما تعكس الحالة الطبيعية السمية، ولكن تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة3. وعلاوة على ذلك، استخدام طفرات الحذف الخميرة يتحمل الميزة الهامة التي تظهر طفرات المغلوب كاملة من بروتين الفائدة، بينما الأنظمة المستندة إلى siRNA تؤدي عموما إلى انخفاض مستوى البروتين. وفي بعض الحالات، يمكن أن تكون مستويات البروتين المتبقية كافية للنقل السمية حيث يتم ملاحظة لا تغيير من النمط الظاهري، وهكذا، مشاركة البروتين محددة غير مرئية في الأنظمة المستندة إلى siRNA.
على الرغم من أن سلالات الخميرة غير الضروري فقط حذف استخدمت في الأصل دراسة6، سلالات حساسة للحرارة، فضلا عن انخفاض وفرة مرناً اضطراب (رطبة) جمع السلالات17 (التعبير انخفاض مستوى أساسي البروتينات) أيضا مناسبة لهذا النوع من الأسلوب في المستقبل. وبصفة عامة، لا يمكن أن يكون دور البروتينات الأساسية بالتحقيق مع هذا التحليل بسبب افتقارها إلى مقومات البقاء، ولذلك تمثل قيداً لنظام الفحص.
بيد المقايسة مراسل جديد يمثل استراتيجية أنيقة والبديلة للأساليب القائمة التي تحاول تحليل النقل المواصلات في الكائن الحي النموذجي S. cerevisiae. أن الدراسات الحالية المستخدمة داخل الخلايا يحركها بلازميد أنظمة تعبير هيئة الطرق والمواصلات ومقيدة لتحليل الرجعية-إزفاء لائحة إلى1،سيتوسول7. التنفيذ الناجح لتطبيق اتفاقات التجارة الإقليمية خارج الخلية الآن يفتح إمكانية دراسة ليس فقط ريتروترانسلوكيشن ER ولكن أيضا لتحليل غير مباشر النقل المواصلات من بعد الظهر على الرغم من غولجي للائحة.كوظيفة الخلوية وتوطين الغالبية من الخميرة في الوقت الحاضر تم اكتشاف الجينات والمتاحة في قواعد البيانات، البروتينات المرشح المحددة يمكن تخصيصها مباشرة إلى أماكن محددة و/أو مسارات النقل.
عموما، يمثل طريقة المقايسة مراسل أدخلت نهجاً سهلة وقوية لتحديد مرشح البروتينات المشاركة في الاتجار داخل الخلايا من السموم أو مفارز السمية (مثلاً، هيئة الطرق والمواصلات) الذي منع البروتين الترجمة في فيفو. وتؤكد هذه التصريحات الانحرافات المعيارية منخفضة نسبيا (1-10%)، فضلا عن إمكانية تكرار نتائج البيانات عالية في الدراسة الأصلية. بسبب شكل لوحة 96، حسنا، لفحص سريع لمختلف الخميرة طفرات أمر ممكن في غضون يوم بعد تنقية السمية.
في المستقبل، وهناك إمكانية لاستخدام الأسلوب للفرز الفائق الخميرة حذف المكتبات. في الإعداد الحالية، تركيز هيئة الطرق والمواصلات التطبيقية (5 ميكرون) قادرة على تقليل fluorescence بروتينات فلورية خضراء النسبية إلى 50%. في ظل هذه الظروف، يقدم الأسلوب ميزة تحديد طفرات الحذف مع آثار إيجابية (انخفاض بروتينات فلورية خضراء الأسفار) على النقل المواصلات وسلبية (زيادة بروتينات فلورية خضراء الأسفار). لعروض عالية الإنتاجية، فرقا أقوى بين العينات المعالجة وغير المعالجة مفيد في بعض الأحيان. باستخدام تركيزات أعلى هيئة الطرق والمواصلات و/أو زيادة فترة التدبير (مثلاً، ح 48)، ينبغي أن تكون كتلة حتى أكثر وضوحاً للتعبير بروتينات فلورية خضراء قابلة للتحقيق.
بالتأكيد على أن هذا الأسلوب لا يقتصر فقط على تحليل عملية التسمم المواصلات التطبيقية خارج الخلية في الخميرة، ولكن هناك أيضا فرصة لتحليل استيراد أية هيئة الطرق والمواصلات بالإعراب عن هيئة الطرق والمواصلات عن طريق بلازميد في هذه السلالة مراسل بروتينات فلورية خضراء (البيانات لا سيظهر). وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها بالنهج الفرز المثل لدراسة مسارات النقل داخل الخلايا الأخرى تخليق البروتين الحيوي تثبيط البروتينات مثل زيموسين18 في المستقبل. وعلى النقيض من طريقة القتل كذلك تتسم زيموسين، المعروف قليل نسبيا حول مسارات الاتجار بالأشخاص المسؤولين عن السمية كفاءة النقل في19،سيتوسول20. وبالتالي، يمثل زيموسين مرشح أمثل للدراسات المستقبلية بطبيعة الحال هو تناول زيموسين بخلايا الخميرة. وهكذا، يمكن حذف إزالة جدار الخلية مما يحسن الأداء العام للتحليل مراسل التجارة والنقل (فيما يتعلق بالوقت والتكاليف). مع المساعدة من هذا الإنزيم المراسل قوية، من المجدي لتشريح المسار النقل داخل الخلايا من زيموسين في الخميرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وكانت أجزاء من هذه الدراسة يرجى تدعمها منحة من دويتشه الأوقيانوغرافية (SFB 1027، A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
