Summary
O manuscrito, descreveremos o uso de um ensaio de repórter de fluorescência baseada em fermento para identificar componentes celulares envolvidos no tráfico e matar processos dos citotóxicos uma subunidade da ricina de toxina da planta (RTA).
Abstract
Bacteriana e planta A / toxinas B exploram os caminhos naturais de tráfico em células eucarióticas para alcançar seu alvo (s) intracelular no citosol e, finalmente, matar. Tal A / toxinas B consistem geralmente em um enzimaticamente ativo Asubunit (por exemplo, toxina ricina um (RTA)) e uma ou mais células vinculação Bsubunit(s), que é responsáveis por toxina vinculação específica de receptores de superfície da pilha. Nosso conhecimento atual de como A / B toxinas são capazes de intoxicante eficientemente células ajudados cientistas para entender os mecanismos celulares fundamentais, como a endocitose e proteína intracelular em células eucarióticas superiores. Do ponto de vista médico, é igualmente importante identificar as rotas de tráfico de toxina principais para encontrar soluções de tratamento adequado para pacientes ou eventualmente desenvolver aplicações terapêuticas baseadas em toxina para terapia do câncer.
Desde análises de todo o genoma da / toxina B tráfico em células de mamíferos é complexo, demorado e caro, vários estudos na / transporte de toxina B foram executadas no organismo modelo levedura Saccharomyces cerevisiae. Apesar de ser menos complexos, fundamentais processos celulares em leveduras e células eucarióticas superiores são semelhantes e muitas vezes os resultados obtidos no fermento podem ser transferidos para a situação dos mamíferos.
Aqui, descrevemos um ensaio rápido e fácil de usar do repórter para analisar o tráfico intracelular de RTA em levedura. Uma vantagem essencial do novo ensaio é a oportunidade de investigar não só RTA retrô-translocação do retículo endoplasmático (ER) no citosol, mas prefiro endocitose e toxina retrógrada de transporte da membrana plasmática no pronto-socorro. O ensaio faz uso de um repórter do que permite a medição indirecta de toxicidade de RTA através de emissão de fluorescência da proteína verde fluorescente (GFP) após a tradução na vivo . Desde que o RTA eficientemente impede a iniciação da biossíntese de proteínas por depurinação do rRNA 28S, este ensaio permite a identificação de proteínas de célula de acolhimento envolvidas no transporte intracelular de RTA através da detecção de alterações em emissão de fluorescência.
Introduction
Pacientes que sofrem de infecções pela toxina produzindo bactérias representam um fardo de médico e financeiro grave para cada sistema de saúde social, em particular desde tratamentos terapêuticos eficientes ainda são em grande parte faltando. Para desenvolver novas estratégias terapêuticas, os mecanismos complexos de intoxicação do clinicamente relevante A / toxinas B como toxina da cólera, toxina Shiga ou ricina precisam ser completamente compreendido a nível molecular, baseado no romance poderosos ensaios que devem ser implementadas.
Nos últimos anos, vários estudos tentaram analisar A / transporte de toxina B em leveduras e células de mamíferos usando métodos demorados e onerosos como toxinas radioactivas rotulagem1,2 , bem como a triagem de siRNA-baseado aproxima-se3. Em alguns casos, toxina tráfico tem sido visualizada na vivo por microscopia de fluorescência após acoplamento químico e/ou genético de subunidades de toxina individual com fluorophores, pontos quânticos ou proteínas fluorescentes4,5. Infelizmente, tais modificações muitas vezes levam a inativas e/ou alteradas propriedades naturais das toxinas. Outra maneira elegante de responder indiretamente uma grande variedade de questões científicas é a utilização de sistemas de repórter baseados em enzimas como lacZ, luciferase, ou proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP ou Discosoma sp. (proteína fluorescente vermelha dsRed)).
Neste manuscrito, um simples protocolo é descrito que identifica celulares componentes necessários para o transporte intracelular de RTA extracelularmente aplicada no S. cerevisiae. Desse modo, um plasmídeo de fluorescência-repórter contendo um sinal de N-terminal ER-importação seguido de GFP funciona como um sensor de biossíntese de proteínas, que mede indiretamente a inibição da tradução de proteínas mediada por RTA por GFP fluorescência emissão após in vivo tradução6. No caso que endocitose RTA e/ou tráfico intracelular é negativa (ou positiva) afetado em um mutante de levedura especial exclusão em relação ao tipo selvagem, isto pode ser detectado através de um aumento (ou diminuição) na GFP de emissão de fluorescência6.
Até agora, todos os métodos de análise de transporte de RTA em células de levedura foram restringidos ao processo de translocação retrô ER-para-citosol de RTA. Em um sistema artificial, RTA contendo um sinal de importação ER é expressa de um promotor inducible, resultando em um fenótipo suicida1,7. Embora a célula de ligação B-subunidade de ricina desapareceu da mesma forma na instalação experimental descrita neste manuscrito e, assim, não totalmente representa a situação natural de ricina holotoxin intoxicação8, transporte de toxina do plasma membrana através do aparelho de Golgi ao pronto-socorro pode ser imitada estreitamente com este ensaio de romance. Curiosamente, os resultados preliminares obtidos no estudo piloto indicam que as vias de tráfico usadas pelo RTA revelam semelhanças marcantes com a via de intoxicação de ricina holotoxin.
Em resumo, o método descrito pode ser usado para determinar o papel específico das proteínas celulares selecionadas em endocitose RTA e do tráfico de levedura. Além disso, esta configuração experimental pode ser facilmente adaptada para outra Ribossoma inactivar as toxinas produzidas e secretadas de vários espécies de leveduras e bactérias como zymocin ou toxina Shiga.
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Protocol
Nota: Uma visão geral do fluxo de trabalho geral experimental é descrita na Figura 1.
Cuidado: RTA é altamente tóxico para os seres humanos. É necessário permissão do laboratório de segurança S2 (nível de biossegurança 2 equivalente). Por favor, use luvas durante todo o experimento.
1. heteróloga expressão de RTA com sua Tag em Escherichia coli
- Transforme células de Escherichia coli com o expressão do plasmídeo pET24-RTA(seu) 6 ou o vetor vazio pET24a(+) usando o padrão electroporation protocolos9,10. Células contendo o plasmídeo vazio servem como um controle negativo.
- Após a seleção de clones positivos em placas LB (100 µ g/mL) contendo canamicina, inocular as células contendo o plasmídeo de expressão RTA ou o vetor vazio no meio dekan 5ml LB (LB médio com 100 µ g/mL de canamicina) e incubar a 37 ° C e 220 rpm por 24 h.
- 1 LB Lkan média com a pré-cultura 5 mL de suplemento e incubar as células a 37 ° C e 220 rpm até células têm alcançado uma OD600 de 0.8-1.0 (aproximadamente 3-4 h). Depois disso, reduza a temperatura de cultura a 28 ° C e prepare um 1 M de solução-mãe de isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) em H2O.
- Induzi a expressão de RTA da e. coli pela adição de IPTG para uma concentração final de 1 mM.
- Depois de 3,5 h de 28 ° c e 220 rpm, com colheita de células por centrifugação a 10.000 x g e 4 ° C por 10 min, lave o pellet duas vezes com 5 mL de tampão de ligação (500 mM NaCl, imidazol 10 mM e 20 mM KH2PO4 pH = 7,4) em 10.000 x g e 4 ° C por 10 min e ressuspender pelota em 5 mL de tampão de ligação.
Nota: O protocolo pode ser pausado, nesta fase, e as células podem ser armazenadas a 80 ° C por vários dias.
2. purificação de RTA com sua Tag através de cromatografia de afinidade
- Proceda à sonicação células no gelo usando o seguinte protocolo: 15 pulso s (20 mícrons), 30 s de pausa. Repita essa etapa cinco vezes.
- Centrifugue a célula lisada em 21.000 x g e 4 ° C por 15 min e filtrar o sobrenadante através de um sistema de filtro de seringa estéril (tamanho de poro de 0,2 µm).
Nota: Pelotas de célula de amostras com sucesso lisadas mostram bordas transparentes. - Usar um sistema de purificação automatizados, equipado com um 5 mL Ni2 +-com base em coluna de afinidade para purificar a fração RTA com sua Tag do filtrado estéril Escherichia coli sobrenadante. Em geral, use uma velocidade de eluição de 1 mL/min e fixe o sistema de purificação de todo para impedir a ligação da toxina não-eficiente e perda da atividade da toxina.
Nota: Parâmetros para a purificação de RTA eficiente estão listados na tabela 1. Veja também Becker et al. para mais informações9.- Brevemente, equilibrar a coluna de afinidade com 20 mL de tampão de ligação para remover o buffer de armazenamento. Aplica o sobrenadante filtrado estéril para a coluna de afinidade, usando uma seringa.
- Lave a coluna com 25-35 mL de tampão de ligação para remover as proteínas desvinculadas da coluna. Executar a etapa de lavagem até absorção UV em 280 nm aproxima-se o valor inicial de UV.
- Eluir acoplada fração RTA em 20-35 mL de tampão de eluição (imidazol 500 mM, 500 mM de NaCl, 20mm KH2PO4, pH = 7,2) e manter a amostra em gelo (Figura 2A e 2B figura).
Nota: A eluição da fração RTA é marcada pelo aumento da absorção de UV. Por favor note para coletar exclusivamente esta fração para evitar a contaminação com proteínas acopladas inespecíficas. - Usar 20 µ l de eluted amostras para realizar11 de coloração de azul de Coomassie ou Western blot análise12,13 (opcional). Use primário antisua anticorpos (1:1, 000) e secundária anti-mouse-IgG-HRP (01:10, 000) para detectar RTA e verificar a pureza da amostra (Figura 3).
- Do desalt eluted fração RTA em uma coluna do desalting 5ml e equilibrar a amostra em sorbitol de 0,8 M.
- Substituir a coluna de afinidade do sistema de purificação por coluna do desalting e primeiro equilibrar a coluna com 20 mL de sorbitol de 0,8 M.
- Aplica a fração RTA eluted à coluna através de uma seringa. Lavar a coluna com 100 mL de sorbitol 0,8 M e eluir a fração RTA demolhada em um tubo de 15 mL, assim como a absorção de UV começa a aumentar (Figura 2).
- Armazenar a fração RTA eluted a 4 ° C.
Nota: Pare diretamente amostragem de fração RTA quando aumenta a condutância para evitar a contaminação de sal. Parâmetros para o procedimento do desalting estão listados na tabela 1.
- Eluted fração RTA a 10.000 x g e 4 ° C por 30-180 min usando uma coluna de rotação de corte 10 kDa até um volume final de 1 a 2 mL de concentrar e armazenar a amostra a 4 ° C por 3-4 semanas.
Cuidado: Não congele a amostra desde congelamento leva a uma perda completa da atividade de RTA. - Determine a concentração de proteína usando um kit de determinação de proteína convencional. Concentração de proteína deve ser na faixa de 1-1,5 mg/mL.
Nota: RTA tende a precipitar-se a concentração de proteínas é muito alta (> 5 mg/mL).
3. transformação e remoção da parede celular de levedura
- Transforme mutantes de exclusão de levedura selvagem-tipo ou selecionado com o GFP repórter do plasmídeo pRS315-K28SP- GFP6 usando acetato de lítio padrão a transformação métodos14. Incubar as células no abandono leucina (d/s) placas de glicose (glicose 2%, ágar 1,5%, 0,5% de sulfato de amónio, 0,17% fermento nitrogênio Base (YNB) e mistura de 0,087% d/s sem leucina) a 30 ° C, por 2-3 dias para a seleção de clones positivos.
- Escolha 3 fermento diferentes clones de cada prato e inocular os clones em 100 mL de meio de rafinose de d/s leucina (rafinose de 2%, 0,5% de sulfato de amónio, 0,17% YNB e misture sem leucina e 0,087% d/s) a 220 rpm e 30 ° C a OD600 = 1,0-2,0 (2-4 x 107 células/mL).
Nota: O crescimento de células das diferentes exclusão cepas de leveduras é diferente. Monitor OD600 através de um espectrofotômetro. - Para calcular valores de600 OD, diluir as amostras para OD600 = 0.1-0.3 (1:5 a 01:10 diluições) e medir OD600 em um espectrofotômetro. Como referência, use H2O, complementado com a quantidade correspondente de meio de raffionose de d/s leucina.
- Depois passo acabamento 3.5, misture 4 µ l da cultura spheroplasted 50 mL com tampão de spheroplasting µ l 496 (aproximadamente 2 × 106 spheroplasts) e centrifugar durante 10 min a 400 g de x.
- Ressuspender pelota em 10 mL de H2O destilado, amostra de vórtice para 30 s e a placa para fora 10 µ l da amostra em placas de glicose de d/s leucina (2% de glicose, ágar 1,5%, 0,5% de sulfato de amónio, 0,17% YNB e mistura de 0,087% d/s sem leucina).
- Incubar as células durante 3 dias a 30 ° C. Conte o número total de colônias de células crescidas na placa. Para a avaliação de dados, use apenas amostras com eficiência superior a 98% (total número de colônia de célula < 40 colônias/placa).
4. GFP repórter ensaio medição em placas de 96 poços
- Semente as spheroplasts de células de levedura obtidos na etapa 3.7 em placas de 96 poços (200 µ l/poço).
- Adicionar 70 meio de rafinose d e/s de µ l de leucina estabilizado, contendo controle negativo (eluato de um Ni2 +-afinidade purificada lisado celular de células induzida por IPTG Escherichia coli expressando o vetor vazio) ou purificada RTA em concentração final de 5 µM (RTA correspondente a 160 g/L RTA) em cada poço.
- Imediatamente adicione 30 µ l estabilizado galactose solução (30% de galactose, sorbitol 0,8 M) para induzir a expressão de GFP e posteriormente iniciar a medição.
Nota: Realizar no mínimo 3 repetições técnicas por experiência e 3 biológicos Replica por levedura. - Depois de terminar a preparação da amostra (etapas 4.1-4.3), coloquei a placa de 96 poços em um leitor de fluorescência e iniciar a medição. Use o filtro de 475/509 nm conjunto necessário para a deteção de fluorescência de GFP. Realize medições a 30 ° C, 120 rpm e com um tremendo diâmetro de 1 mm sobre uma janela de tempo de 20 h (medição em intervalos de 10 min).
Nota: O conjunto de filtro GFP é normalmente disponível em todos os sistemas do leitor. Temperatura, janela de tempo, medindo intervalos e a concentração de RTA pode ser ajustada para as próprias necessidades. Resultados representativos são mostrados na Figura 4. - Opcional: Use controles internos adicionais na medição para controle de qualidade. Prepare um controlo negativo, acrescentando meio rafinose d e/s de leucina estabilizado de µ l de 30 em vez de 30% de galactose (sem indução de GFP). Além disso, adicione 70 µ l de solução de G418 de sorbitol estabilizado de 0,8 M (300 µ g/mL). O inibidor da tradução de proteínas G418 serve como controle positivo para inibição da proteína que impede a expressão de GFP no fermento.
- Calcular a fluorescência de GFP relativa por cento por ponto de tempo de 20 h, de acordo com a seguinte equação (ver Figura 4A):
onde NC é a do controlo negativo
- Em alternativa, determinar a fluorescência de GFP relativa para cada ponto de medição (neste caso 10 min, ver também passo 4.4) usando a equação acima. Como mostrado na Figura 4B, crie um gráfico borrando as intensidades de fluorescência de GFP (eixo y) ao longo do tempo (eixo x).
onde NC é a do controlo negativo
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Representative Results
O fluxo de trabalho geral do protocolo descrito neste manuscrito é ilustrado na Figura 1, aproximadamente, resumindo os passos simples para purificação de RTA bem sucedida e o experimento de ensaio de repórter GFP subsequente. Uma descrição mais detalhada de cada etapa individual pode ser encontrada no protocolo. A Figura 2 ilustra o resultado esperado de uma purificação de RTA bem sucedido por cromatografia de afinidade (Figura 2A) e controle de vetor vazio (Figura 2B). A Figura 2 mostra um resultado representativo de um experimento do desalting ilustrando a separação ideal do pico de proteína (azul) e o pico de sal-eluída (marrom). Uma purificação eficaz de RTA é apresentada na forma de manchas de Coomassie SDS-gel na Figura 3. Finalmente, a Figura 4 resume alguns originais resultados obtidos por este simples e robusto baseado em GFP repórter ensaio método6. Figura 4A ilustra que o ensaio da repórter GFP estabelecido é capaz de produzir resultados fiáveis e mostra esquematicamente o plasmídeo do repórter GFP utilizado neste estudo. No gráfico, a fluorescência de GFP relativa de spheroplasts de levedura condições RTA-tratados e não tratados é comparada com o outro. Como esperado, não induzida, bem como G418-tratada células não mostram quase nenhuma fluorescência de GFP. Em células não tratados e negativos controle-Tratado (vazio vector), expressão de GFP não é afetado e não foram observadas diferenças significativas entre as duas amostras. Em contraste, o RTA tratamento leva para a esperada redução de fluorescência GFP mediada por sua Ribossoma inibindo a atividade. Na Figura 4B, uma curva de tempo de inibição de fluorescência induzida por RTA GFP é exibida. Este tipo de apresentação de dados contém informações adicionais sobre o timing da expressão de GFP (90 min após a indução de galactose) e o ponto de partida da inibição da translação por RTA (210 min após a aplicação em células de tipo selvagem). O atraso na diminuição de fluorescência RTA-mediada provavelmente reflete a cinética de absorção e o transporte intracelular de RTA para o citosol. A Figura 4 ilustra a fluorescência de GFP relativa obtidos de mutantes de levedura selecionada após um 20 h RTA-tratamento e comparado a RTA-tratamento e comparação com RTA-tratadas selvagem-tipo pilhas. Os componentes da ERAD Hrd1p e Der1p foram escolhidos como positivo apropriado controla porque estudos anteriores já demonstraram que ambas as proteínas estão envolvidas em retrotranslocation ER-para-citosol de RTA em fermento1. Portanto, ambos mutantes mostram o esperado aumento na fluorescência de GFP, em comparação com células do tipo selvagem. Em contraste, os valores relativos da fluorescência de GFP em Δyos9 e Δnup120 células não são significativamente diferentes. Já tem sido descrito que a falta da lectina de controle de qualidade de ER Yos9p, nem a falta da proteína do poro nuclear Nup20p afeta RTA toxicidade e transporte1. Uma lista de parâmetros de cromatografia e dessalinização a afinidade específica pode ser encontrada na tabela 1.
Figura 1: fluxo de trabalho geral de purificação RTA e ensaio baseado em GFP repórter. A purificação de RTA (à esquerda) começa com a transformação de e. coli com a expressão ou o vetor vazio seguido de cultivo e expressão induzida por IPTG RTA. Após a lise celular e filtração estéril, o sobrenadante é purificado através de cromatografia de afinidade do Ni2 + e pureza da amostra é verificada através de Coomassie mancha ou borrão ocidental. Antes as frações RTA eluted estão prontas para usar o experimento de ensaio de repórter GFP, frações precisam ser postas e concentrado, e concentração de proteína deve ser determinada. O experimento de ensaio de repórter GFP (à direita) começa com a transformação de mutantes de exclusão de levedura selvagem-tipo e/ou selecionado com a construção de expressão de GFP. Após o cultivo, a parede celular é removida por tratamento enzimático para permitir a absorção de RTA em vivo . Em seguida, fluorescência de GFP de spheroplasts de células de levedura é medida em condições de toxina-tratados e não tratados ao longo do tempo em um leitor de fluorescência (475/509 nm). Finalmente, fluorescência de GFP relativa é determinada usando a equação mostrada na etapa 4.6 e é exibida conforme ilustrado na Figura 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cromatografia de afinidade representativa e dessalinização resultados de células de e. coli contendo o animal de estimação-RTA(seu) 6 ou o controle de vetor vazio. (A) gráfico de purificação típicas de uma amostra de lisado celular em Escherichia coli expressando RTA(seu) 6 de vector pET24-RTA(seu) 6. Curva azul representa a absorção UV em 280 nm causada por anéis aromáticos dos aminoácidos Cys, Tyr e Trp e serve como indicador de proteína. Durante o carregamento da coluna, as proteínas unbound são detectadas no escoamento (0-10 mL). Depois de remover as proteínas unbound lavando com tampão de ligação, concentração de tampão de eluição aumenta de 0 para 100% (curva vermelha) e ligado a proteínas são imediatamente eluídas da coluna. O pico da curva azul entre 25 e 30 mL representa a fração de acoplado com sua tag RTA (caixa preta). (B) gráfico de purificação típicas de uma Escherichia coli lisado de células expressando o controle de vetor vazio. Mesmo protocolo de purificação como em (A). Conforme mostrado na caixa preta, sem proteínas são eluídas da coluna no controle negativo. (C) Desalting diagrama de uma amostra de(dele) 6 pET24-RTA Escherichia coli após a purificação da afinidade. O diagrama mostra a separação da fração de proteína do RTA (pico de absorção de 280 nm entre 20-30 mL) e a fração sal (aumentando o pico de condutância após 30 mL).Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise Western representante das diferentes amostras antes e após a purificação da afinidade. 20 µ l célula lisado (faixas 2-4) ou purificada amostra (faixas 5-7) de diferentes variantes de RTA (só não modificado RTA foi usado neste estudo) analisadas por SDS-PAGE e coloração azul de Coomassie. Pista 1, escada de proteína; pista 2, RTA não modificado; pista 3, RTAHDEL; pista 4, RTAKDEL; faixa 5, RTA não modificado; faixa 6, RTAHDEL; Lane 7, RTAKDEL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: resultados representativos obtidos pelo ensaio da repórter para mutantes de levedura selvagem-tipo e selecionado RTA-tratados exclusão. Fluorescência (A) GFP relativo do selvagem-tipo spheroplasts de levedura contendo o repórter do plasmídeo pRS315-K28SP- GFP (à direita) abaixo dos induzida (galactose 3%, GFPind.) e não-induzida (rafinose de 2%, GFPrepr...) as condições após 20 h GFP indução. Fluorescência de GFP relativa também foi analisada na presença de RTA (5 µM), G418 (300 µ g/mL) ou o controlo negativo (NC). O inibidor da tradução de proteínas G418 serve como controle positivo e impede a expressão de GFP no fermento. Valores médios e desvio padrão (SD) são indicados. (B) relativa GFP fluorescência do (A) exibida como curso de tempo mais 20 h. Este diagrama fornece informações adicionais sobre o timing da inibição de expressão e tradução de GFP por RTA; o comportamento de curva reflete indiretamente a cinética de absorção de RTA e transporte intracelular para o citosol. (C) resultado representativo de defeituoso de mutantes de levedura selecionada em proteínas celulares que são conhecidos por serem envolvidas (Hrd1p e Der1p) ou não envolvido (Yos9p e Nup120p) no RTA tráfico de fermento1,6. A linha pontilhada representa um limiar de significância que se baseia a emissão de fluorescência obtida pelas cepas de controle positivo (para mais explicações consulte referência6). Valores médios e desvio padrão (SD) são indicados. A figura foi modificada de Becker et al . 6 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetro de afinidade chromotography | ||
| Parâmetros de medição | UV (280 nm), concentração de tampão de eluição, condutância | |
| Configurações | Variável por unidade | Valor |
| Taxa de fluxo | mL/min | 1 |
| Pressão máxima da coluna | MPa | 0.35 |
| Comprimento de onda | nm | 280 nm |
| Tampão de ligação | Bomba posição | A |
| Tampão de eluição | Bomba posição | B |
| Tampão de eluição de concentração inicial | % | 0 |
| Compensação de volume do sistema | mL | 10 |
| Equilíbrio de coluna | mL | 20 |
| Injeção de amostra sobre superloop/seringa | mL | volume de lisado celular |
| Etapa de lavagem | mL | 20-35 |
| Etapa de eluição | mL | 20-35 |
| Tampão de eluição de concentração durante a eluição | % | 100 |
| Recalibração de coluna com 20% EtOH | mL | 50 |
| Parâmetro do desalting | ||
| Parâmetros de medição | UV (280 nm), condutância | |
| Configurações | Variável por unidade | Valor |
| Taxa de fluxo | mL/min | 4 |
| Pressão máxima da coluna | MPa | 0.35 |
| Comprimento de onda | nm | 280 nm |
| Tampão de ligação | Bomba posição | A |
| Tampão de eluição | Bomba posição | B |
| Tampão de eluição de concentração inicial | % | 0 |
| Compensação de volume do sistema | mL | 10 |
| Equilíbrio de coluna | mL | 20 |
| Injeção de amostra sobre superloop/seringa | mL | volume de lisado celular |
| Injeção de tampão do desalting (sorbitol 0,8 M) | mL | 100 |
| Recalibração de coluna com 20% EtOH | mL | 50 |
Tabela 1: parâmetros utilizados para a purificação da afinidade baseada na coluna e dessalinização. Lista de todas as configurações de coluna relevantes (por exemplo, taxa de fluxo, concentração de tampão de eluição, equilibrio e lavagem passo duração) e parâmetros medidos (por exemplo, condutância ou absorção de UV).
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Discussion
Ao executar o protocolo acima, recomendamos as seguintes sugestões para alcançar um resultado bem sucedido do experimento.
Para a expressão da proteína heteróloga, é importante para não exceder a concentração de IPTG de 1 mM. Concentrações de IPTG > 1mm inibir induzida pelo promotor expressão RTA e chumbo para reduzir a produção de toxina. Além disso, as células não devem ser cultivadas em temperaturas acima de 28 ° C para evitar a formação de corpo de inclusão, dobradura ineficiente e inactivação de toxina. Expressão de RTA em temperatura mais baixa (por exemplo, 20-28 ° C) é possível e também leva à produção de toxina biológica activa. No entanto, a redução de temperatura adicional não melhora significativamente RTA atividade/dobradura e resulta em um rendimento total de toxina mais baixo comparado a 28 ° C (dados não mostrados).
Parâmetros de purificação da cromatografia de afinidade (tabela 1) são otimizados para o uso de um sistema automatizado de purificação equipado com 5ml Ni2 + coluna de afinidade e deve ser ajustado para outros sistemas de coluna home-made ou comercial se RTA pureza e rendimento estão abaixo do ideal. Em caso de pureza de RTA sub-ótimo (indicada pelo aparecimento de proteínas adicionais em geles de SDS manchadas de Coomassie), um aumento da concentração de imidazol do buffer ligação normalmente reduz inespecíficas ligação de proteínas positivamente carregadas para o coluna, aumentando assim a total pureza de RTA. No caso de rendimentos de RTA sub-ótimo, introdução de etapas adicionais de sonorização (4-8 pulsos), incubação mais vezes (5 h) ou volumes maiores de cultura (> 1 L) pode ajudar a melhorar o rendimento global de toxina. No entanto, há também a oportunidade de se purificar com êxito o RTA através de sistemas de coluna com base de rotação (dados não mostrados) se um sistema automatizado não está disponível no laboratório.
Durante a etapa do desalting, é importante ignorar o procedimento de amostragem, assim como a condutância começa a subir. Contaminação com sal, especialmente o imidazol, influencia a medição da concentração de proteína, resultando na determinação da concentração RTA imprecisa que afecta directamente o conteúdo de RTA utilizado no ensaio de repórter de GFP.
É essencial para armazenar RTA purificado a 4 ° C e evitar o congelamento. Amostras congeladas mostram uma atividade reduzida de RTA em celular baseado em XTT ensaios de vitalidade em células HeLa (dados não mostrados). Purificado de amostras podem ser mantidas por cerca de 3-4 semanas antes de sua atividade biológica é continuamente diminuída. Além disso, altas concentrações de RTA (≥ 5 mg/mL) após a concentração de coluna de rotação são críticas porque RTA mostra uma tendência a precipitar em sorbitol de 0,8 M.
Uma desvantagem do método é o fato de que o RTA é normalmente não retomado por células de levedura intacta. Para alcançar resultados fiáveis, a parede celular de levedura precisa ser completamente removido por tratamento enzimático. Portanto, é essencial para verificar a eficiência de formação do spheroplast de cada cepa de levedura pelos métodos descritos nas etapas 3.4-3.5. No caso de preparação do spheroplast abaixo do ideal, o tempo de incubação e a concentração da enzima lítica devem ser otimizados e monitorados através de microscopia de contraste de fase. Overdigestion (formação de fantasma) pode ser prevenida, reduzindo o tempo de concentração e/ou incubação de enzima lítica, Considerando que a abordagem oposta é necessária em caso de insuficiente digestão. Dados de estirpes com remoção insuficiente de parede celular devem ser excluídos da avaliação de dados.
Também deve ser mencionado que a instalação experimental completamente não imitar o processo natural de intoxicação de ricina. A subunidade B ligação celular ricina (RTB) está faltando que é normalmente responsável pela ligação de toxina eficiente aos resíduos de galactose na superfície celular de células de mamíferos,15. Teoricamente, esta limitação pode ser superada através da realização do experimento com holotoxin de ricina purificada contendo sua subunidade A e B. No entanto, as células de levedura não possuem resíduos de galactose na sua superfície celular que pode mediar a ligação de RTB8; Este facto também explica por que as células de levedura intacta não são sensíveis contra ricina. Assim, não está claro se o RTB agiria como componente de ligação celular no modelo de levedura. Curiosamente, estudos anteriores já demonstraram que o RTA é capaz de alcançar o citoplasma de células de mamífero sem sua célula de ligação B subunidade16. Para entender este fenômeno, decidimos usar apenas RTA a instalação experimental para identificar componentes celulares na levedura, que facilitam a toxina tráfico de membrana plasmática no citosol. Surpreendentemente, os componentes envolvidos no RTA tráfico de levedura mostram semelhanças marcantes com os componentes necessários para o transporte de holotoxin eficiente ricina em células de mamíferos6. Com base nestes resultados, pode ser especulado que RTB desempenha um papel menor no transporte intracelular ricina do que supunha e só é importante para o contato inicial à superfície de células de mamíferos.
Em contraste, sistemas baseados em siRNA em células de mamíferos perfeitamente refletem a situação de toxina natural, mas são caros e time-consuming3. Além disso, a utilização de mutantes de levedura exclusão tem a importante vantagem que os mutantes mostram um nocaute completo da proteína de interesse, Considerando que sistemas baseados em siRNA geralmente levam a uma redução do nível de proteína. Em alguns casos, os níveis de proteína residual podem ser suficientes para o transporte de toxina pelo qual nenhum fenótipo alterado é observado e, assim, o envolvimento da proteína específica não é visível em sistemas baseados em siRNA.
Embora cepas de leveduras apenas não-essenciais e exclusão foram usadas no original estudo6, cepas sensíveis à temperatura, bem como a diminuição da abundância de mRNA perturbação (DAmP) coleção cepas17 (nível de reduzida expressão do essencial proteínas) da mesma forma são adequadas para este tipo de método no futuro. Em geral, o papel das proteínas essenciais não pode ser investigado com este ensaio por causa de sua falta de viabilidade, portanto, representar uma limitação do sistema de ensaio.
No entanto, o novo ensaio da repórter representa uma estratégia elegante e alternativa aos métodos existentes que tentam analisar o transporte de RTA no organismo modelo S. cerevisiae. Os estudos existentes utilizados intracelular do plasmídeo-driven sistemas de expressão RTA e são restritas à análise de retrô-translocação do PS para o citosol1,7. Implementação bem sucedida da aplicação extracelular RTA agora abre a possibilidade de não só estudar ER retrotranslocation, mas também analisar indiretamente transportes de RTA do PM embora o Golgi ao pronto-socorro.Como a função celular e a localização da maioria das leveduras genes hoje em dia é descoberto e disponível em bancos de dados, as proteínas de candidatos identificados podem ser alocadas diretamente para compartimentos específicos e/ou vias de transporte.
No geral, o método de ensaio de repórter introduzido representa uma abordagem fácil e robusta para identificar candidatos proteínas envolvidas no tráfico intracelular de toxinas ou subunidades de toxina (por exemplo, RTA) que bloqueiam proteína tradução na vivo. Desvios-padrão relativamente baixos (1-10%), bem como a reprodutibilidade de dados de alta no estudo original confirma estas afirmações. Devido ao formato de placa de 96 poços, um rastreio rápido de vários mutantes de levedura é possível dentro de um dia após a purificação de toxina.
No futuro, há a possibilidade de usar o método de rastreio com throughput alto das bibliotecas de exclusão de levedura. Na configuração atual, a concentração de RTA aplicada (5 µM) é capaz de diminuir a fluorescência de GFP relativa a 50%. Nestas condições, o método oferece a vantagem para identificar os mutantes de exclusão com negativo (aumento da fluorescência GFP) e positivo (redução de GFP de fluorescência) efeitos sobre o transporte de RTA. Para seleções de alto rendimento, uma forte diferença entre amostras de tratados e não tratados às vezes é benéfica. Por usar concentrações mais elevadas de RTA e/ou aumentar o intervalo de medida (por exemplo, 48 h), um bloco ainda mais pronunciado de expressão de GFP deve ser alcançável.
É de salientar que este método não é restrito apenas para analisar o processo de intoxicação do extracelular RTA aplicada no fermento, mas há também a oportunidade de analisar a importação de ER de RTA expressando RTA um plasmídeo nesta estirpe de repórter GFP (dados não mostrado). Além disso, a abordagem de rastreio do mesmo modo pode ser adaptada para estudar as vias de transporte intracelular de outro biossíntese de proteínas inibindo as proteínas tais como zymocin18 no futuro. Em contraste com o modo de matar bem caracterizadas de zymocin, relativamente pouco é conhecido sobre as vias de tráfico responsáveis pelo transporte de toxina eficiente para o citosol19,20. Desse modo, o zymocin representa um candidato ideal para estudos futuros como zymocin naturalmente é retomada por células de levedura. Assim, a remoção da parede celular pode ser omitida que melhora o desempenho geral do ensaio repórter GFP (com relação ao tempo e custos). Com a ajuda deste teste de repórter poderoso, seria viável para dissecar as vias de transporte intracelular de zymocin no fermento.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Partes deste estudo foram gentilmente com uma subvenção da Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
