Summary
בכתב היד, נתאר את השימוש assay כתב המבוסס על שמרים זריחה כדי לזהות רכיבים התאית מעורבת הסחר ולהרוג את התהליכים של ציטוטוקסיות של יחידת משנה של ריצין הרעלן הצמח (RTA).
Abstract
בקטריאלי, צמח A / B רעלים ניצול של מסלולים סחר טבעי בתאים האיקריוטים להגיע שלהם target(s) תאיים ב ציטוזול ו להרוג בסופו של דבר. כזה A / B רעלים מורכבת בדרך כלל פעיל enzymatically Asubunit (למשל, ריצין רעלן (RTA)), תא אחד או יותר מחייב Bsubunit(s), אשר אחראים על רעלן קשירה ספציפי ל התא קולטנים משטח. הידע הנוכחי שלנו על איך A / B רעלים מסוגלים ביעילות משכר תאי עזר מדענים להבין את המנגנונים התאיים הבסיסיים, כמו אנדוציטוזה וחלבון תאיים מיון גבוהה התאים האיקריוטים. מנקודת מבט רפואית, חשוב גם לזהות את המסלולים סחר הרעלן הגדולות כדי למצוא פתרונות טיפול הולם עבור חולים או ובסופו של דבר לפתח יישומים מבוססי-הרעלן טיפולית לטיפול בסרטן.
מאז ניתוח ברמת הגנום של A / הרעלן B תאים בתרבית של סחר בבני אדם היא מורכבת, גוזלת זמן יקר, מספר מחקרים על A / B הרעלן תחבורה בוצעו באורגניזם מודל שמרים האפייה. למרות היותו פחות מורכב, יסוד תהליכים תאיים שמרים ואת התאים האיקריוטים גבוה יותר דומים הינם לעיתים קרובות התוצאות המתקבלות שמרים ניתן להעביר למצב יונקים.
כאן, אנו מתארים assay כתב מהיר, קל לשימוש כדי לנתח את וגדילת של RTA ב שמרים. היתרון חיוני וזמינותו חדשה הוא הזדמנות לחקור לא רק RTA רטרו-טרנסלוקציה של תוך-פלזמית (ER) ציטוזול, אבל מעדיף אנדוציטוזה, הרעלן רטרוגרדית תחבורה של קרום פלזמה לחדר המיון. הבדיקה עושה שימוש פלסמיד כתב המאפשר מדידה עקיפות של RTA רעילות דרך פליטת קרינה פלואורסצנטית חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לאחר תרגום ויוו . מאז RTA מונע ביעילות אתחול של חלבון ביוסינטזה מאת 28S rRNA depurination, וזמינותו זו מאפשרת זיהוי חלבונים בתא המארח מעורב התחבורה RTA תאיים באמצעות זיהוי שינויים פליטת קרינה פלואורסצנטית.
Introduction
חולים הסובלים זיהומים על ידי הרעלן לייצר חיידקים מייצגים מעמסה רפואית וכלכלית חמורה עבור כל מערכת הבריאות חברתית, במיוחד מאז טיפולי יעיל חסרים עדיין במידה רבה. לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, מנגנונים מורכבים שיכרון א גם לא רלוונטי רפואית / B רעלנים כגון כולרה טוקסין, רעלן שיגה או ריצין צריך להיות מובן במלואו ברמה המולקולרית המבוססת על הרומן מבחני רב עוצמה שיש ליישם.
בשנים האחרונות, מספר מחקרים ניסו לנתח A / B הרעלן תחבורה בין שמרים בתרבית של תאים באמצעות שיטות ועתירת עלות עתירי כמו רעלן רדיואקטיבי תיוג1,2 , כמו גם סינון שמבוסס siRNA ניגש3. במקרים מסוימים, הרעלן סחר כבר מטמיעים ויוו על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ לאחר צימוד כימי ו/או גנטי של הרעלן בודדים subunits עם fluorophores, נקודות קוונטיות או חלבונים פלורסנט4,5. למרבה הצער, ושינויים אלו לעיתים קרובות להוביל מאפיינים טבעיים לא פעילים ו/או שינו הרעלנים. דרך אלגנטית נוספת בעקיפין לענות על מגוון רחב של שאלות מדעיות היא השימוש במערכות כתב המבוסס על אנזימים כגון לוציפראז lacZ, או חלבונים פלורסנט (למשל GFP או Discosoma sp. (חלבון פלואורסצנטי אדום dsRed)).
כתב יד זה, מתואר פרוטוקול פשוט אשר מזהה הסלולר הרכיבים הדרושים עבור הובלה תאיים של RTA extracellularly יישומית ב cerevisiae ס. ובכך, זריחה-כתב פלסמיד המכיל אות N-מסוף ER-ייבוא ואחריו GFP משמש חיישן ביוסינטזה חלבון, אשר מודד בעקיפין בתיווך RTA חלבון תרגום עיכוב על ידי GFP פלורסצנטיות פליטה לאחר ויוו תרגום6. במקרה זה RTA אנדוציטוזה ו/או וגדילת לרעה (או באופן חיובי) מושפע ב מוטציה מחיקה שמרים מסוים לעומת פראי-סוג, זה ניתן לאתר באמצעות עלייה (או ירידה) פליטת קרינה פלואורסצנטית GFP6.
עד כה, כל שיטות ניתוח תחבורה RTA תאי שמרים היו מוגבלים לתהליך רטרו-רוברטסונית אר-אל-ציטוזול RTA. במערכת כזו מלאכותי, מתבטאת RTA המכיל אות ייבוא אר מ יזם inducible וכתוצאה מכך פנוטיפ אובדניות1,7. למרות התא מחייב B-יחידת משנה של ריצין הוא חסר הגדרת הניסוי המתואר בכתב היד, וכך, לא לגמרי מייצגים את המצב הטבעי של שיכרון ריצין holotoxin8, הרעלן תחבורה של פלזמה ממברנה דרך מנגנון גולג'י לחדר המיון יכול להיות חיקה בשיתוף פעולה הדוק עם assay הרומן הזה. מעניין, תוצאות ראשוניות שהושגו במחקר פיילוט מציינים כי המסלולים סחר בשימוש על ידי RTA לחשוף את הדמיון הבולט עם תוואי שיכרון ריצין holotoxin.
לסיכום, שיטת שתואר יכול לשמש כדי לקבוע את התפקיד הספציפי של החלבונים שנבחרו ב- RTA אנדוציטוזה, סחר בבני אדם שמרים. יתר על כן, הגדרת הניסוי הזה יכול בקלות להתאים אחרים ריבוזום inactivating רעלנים המופרשים שמרים שונים ומינים חיידקיים כגון zymocin או טוקסין שיגה והופק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: סקירה כללית של תהליך העבודה הכללי ניסיוני מתואר באיור1.
זהירות: RTA היא רעילה ביותר עבור בני אדם. בטיחות מעבדה הרשאה S2 (אבטחה ברמה מקבילה 2) נדרש. בבקשה ללבוש כפפות במהלך הניסוי כולו.
1. heterologous ביטוי של RTA שלו מתויגת ב- Escherichia coli
- להפוך e. coli תאים המכילים את הביטוי פלסמיד pET24-RTA6 (שלו) או את pET24a וקטור ריק(+) באמצעות תקן אלקטרופורציה פרוטוקולים9,10. תאים המכילים את פלסמיד ריק לשמש פקד שלילי.
- לאחר בחירת שיבוטים חיובית על צלחות ליברות (100 µg/mL) המכילות kanamycin, לחסן את התאים המכילים את פלסמיד ביטוי RTA או הווקטור ריק מ ל LBקאן בינוני (LB בינוני עם µg/mL 100 של kanamycin), דגירה-37 ° C ו- 220 סל"ד במשך 24 שעות ביממה.
- תוספת 1 L LBקאן בינוני עם תרבות קדם 5 מ"ל, דגירה תאים על 37 ° C ו- 220 סל"ד עד תאים מיצית את יתר של600 של 0.8-1.0 (כ 3-4 שעות). לאחר מכן, לצמצם את תרבות הטמפרטורה 28 ° C ולהכין של 1 מ' של איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) מניות פתרון H2O.
- זירוז RTA לביטוי e. coli על-ידי הוספת IPTG ריכוז סופי של 1 מ מ.
- לאחר h 3.5 ב 28 ° C ו- 220 סל"ד, קציר תאים על ידי צנטריפוגה-g 10,000 x ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לשטוף את גלולה פעמיים עם 5 מ של איגוד מאגר (500 מ מ NaCl imidazole 10 מ מ, 20 מ מ ח'2PO4 pH = 7.4) 10,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, resuspend צנפה במאגר איגוד מ ל.
הערה: פרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה, תאים שניתן לאחסן ב 80 מעלות צלזיוס במשך מספר ימים.
2. טיהור של RTA שלו מתויג באמצעות כרומטוגרפיית זיקה
- Sonicate תאים על קרח באמצעות פרוטוקול הבאים: s 15 דופק (20 מיקרון), השהה s 30. חזור על שלב זה חמש פעמים.
- תגובת שיקוע באמצעות מערכת סינון סטרילי מזרק (0.2 µm גודל הנקבוביות) צנטריפוגה תא lysate-21,000-g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולסנן.
הערה: תא כדורי דוגמאות בהצלחה sonicated של הצג גבולות שקוף. - השתמש מערכת טיהור אוטומטיות מצויד של מ ל2 +ני-מבוססת עמודת זיקה לטהר את השבר שלו מתויג RTA מ סטרילי-מסוננים e. coli supernatant. באופן כללי, השתמש על מהירות • תנאי של 1 mL/min. ומגניב מערכת טיהור כל כדי למנוע מחייב רעלן שאינו יעיל ואובדן של פעילות הרעלן
הערה: פרמטרים עבור טיהור RTA יעיל מפורטים בטבלה 1. ראה גם בקר ואח. עוד מידע9.- בקצרה, equilibrate עמודת זיקה עם 20 מ של איגוד המאגר כדי להסיר את מאגר אחסון. החל סטרילי-מסוננים תגובת שיקוע על גבי עמודת זיקה באמצעות מזרק.
- לשטוף את העמודה עם 25-35 מ ל איגוד המאגר כדי להסיר את החלבונים לא מאוגד מן העמודה. בצע את שלב כביסה עד ספיגת UV-280 ננומטר נמצא בקרבת הערך ההתחלתי UV.
- Elute שבר RTA המאוגדים ב- 20-35 מ ל • תנאי מאגר (500 מ מ imidazole, 500 מ מ NaCl, 20 מ מ ח'2PO4, pH = 7.2) ולשמור את הדגימה על קרח (איור 2A ו- 2B איור).
הערה: • תנאי של השבר RTA מסומן על ידי עלייה קליטה UV. אנא שימו לב לאסוף באופן בלעדי זה שבר למניעת זיהום עם חלבונים מאוגד לא ספציפית. - להשתמש µL 20 eluted דגימות לביצוע כחול Coomassie מכתים11 או12,ניתוח תספיג13 (אופציונלי). השתמש הראשי שלו נגד נוגדנים (1:1, 000) משני אנטי-mouse-אג-HRP (1:10, 000) כדי לזהות RTA ולוודא מדגם טוהר (איור 3).
- Desalt שבר RTA eluted על עמודה desalting מ ל, equilibrate מדגם בסורביטול 0.8 מ'.
- להחליף את עמודת זיקה של המערכת לטיהור באמצעות עמודת desalting, equilibrate תחילה את העמודה עם 20 מ של 0.8 מ' בסורביטול.
- השבר RTA eluted חלות על העמודה באמצעות מזרק. רוחצים את העמודה עם 100 מ של 0.8 מ' בסורביטול את elute השבר RTA desalted בשפופרת 15 מ"ל ברגע קליטתם UV מתחיל לגדול (איור 2C).
- לאחסן את השבר RTA eluted ב 4 º C.
הערה: עוצרים ישירות RTA שבר דגימה כאשר מוליכות מגביר כדי למנוע זיהום מלח. פרמטרים עבור ההליך desalting מפורטים בטבלה 1.
- להתרכז שבר RTA eluted ב 10,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 30-180 דקות באמצעות עמודת ספין 10 kDa ניתוק נפח סופי של 1-2 מ ל ולאחסן מדגם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3-4 שבועות.
התראה: אין להקפיא את הדגימה מאז קפוא מוביל אובדן מוחלט של RTA פעילות. - לקבוע ריכוז חלבון באמצעות ערכת קביעת חלבון קונבנציונלי. ריכוז חלבון צריך להיות בטווח של 1-1.5 מ"ג/מ"ל.
הערה: RTA נוטה לזרז אם ריכוז חלבון גבוהה מדי (> 5 מ"ג/מ"ל).
3. שמרים טרנספורמציה והסרה דופן התא
- בעקבות מוטציות שמרים פראי-סוג או שנבחרו למחיקה GFP כתב פלסמיד pRS315-K28SP- GFP6 באמצעות שיטות טרנספורמציה של ליתיום סטנדרטית אצטט14. דגירה לתאים לאוצין הנשירה (d/o) צלחות גלוקוז (2% גלוקוז, 1.5% אגר, 0.5% אמוניום סולפאט, 0.17% בסיס חנקן שמרים (YNB) ו- 0.087% d/o לערבב בלי לאוצין) ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים לבחירה שיבוט חיובי.
- לאסוף 3 שמרים שונים שיבוטים של כל צלחת ואת לחסן השיבוטים ב- 100 מ של לאוצין בינוני של raffinose d/o (2% raffinose, 0.5% אמוניום סולפאט, 0.17% YNB ו- 0.087% d/o לערבב בלי לאוצין)-220 סל ד ו- 30 ° C עד OD600 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 תאים/mL).
הערה: צמיחת תאים של זנים מחיקה שמרים שונים היא שונה. לפקח על יתר600 ויה ספקטרופוטומטרים. - כדי לחשב ערכי600 OD, לדלל דגימות OD600 = 0.1-0.3 (1:5 עד 1:10 דילולים) ולמדוד את יתר600 בספקטרופוטומטר. אזכור, השתמש H2O בתוספת הכמות המתאימה של לאוצין d/o raffionose בינונית.
- לאחר שלב הגמר 3.5, לערבב 4 µL של התרבות spheroplasted 50 מ עם מאגר spheroplasting µL (spheroplasts6 × 10 כ- 2) 496, צנטריפוגה 10 דקות ב 400 x g.
- Resuspend צנפה 10 מ ל H2O מזוקקים, דוגמת מערבולת עבור s 30, ואת הצלחת לצאת µL 10 המדגם על צלחות d/o לאוצין של גלוקוז (2% גלוקוז, 1.5% אגר, 0.5% אמוניום סולפאט, 0.17% YNB ו- 0.087% d/o לערבב בלי לאוצין).
- תקופת דגירה תאים של 3 ימים ב- 30 ° C. לספור את המספר הכולל של מושבות תאים בוגרים על הצלחת. להערכת נתונים, להשתמש רק דוגמאות עם יעילות גבוהה יותר 98% (מספר מושבת תאים כולל < מושבות 40/צלחת).
4. GFP כתב Assay מדידה ב 96-ובכן צלחות
- זרע spheroplasts תא שמרים שהושג בשלב 3.7 96-ובכן לוחות (200 µL טוב).
- להוסיף 70 µL לאוצין מיוצב d/o בינוני raffinose המכיל בקרה שלילית (eluate של ני2 +-זיקה מטוהרים תא lysate מתאי IPTG-induced e. coli לבטא את הווקטור ריק) או מטוהרים RTA ב ריכוז RTA הסופי של 5 מיקרומטר ( המתאים 160 g/L RTA) כל היטב.
- מיד להוסיף 30 µL התייצב גלקטוז פתרון (30% גלקטוז, בסורביטול 0.8 מ') זירוז ביטוי GFP, ולאחר מכן להתחיל את המדידה.
הערה: בצע משכפל טכנית לפחות 3 לכל ניסוי ומשוכפלת 3 ביולוגי לכל זן שמרים. - לאחר סיום הכנת הדוגמא (שלבים 4.1-4.3), מכניסים את הצלחת 96-ובכן קורא פלורסצנטיות ולהתחיל את המדידה. השתמש במסנן nm 475/509 להגדיר נדרש לגילוי קרינה פלואורסצנטית GFP. לבצע מדידות ב 30 מעלות צלזיוס, 120 סל ד, ועם חזק בקוטר של 1 מ מ מעל חלון זמן של 20 h (מדידה במרווחים של 10 דקות).
הערה: ערכת מסנן GFP זמין בדרך כלל בכל מערכות הקורא. טמפרטורה, חלון זמן, מדידה, במרווחי זמן וריכוז RTA יכול להיות מותאם לצרכים שלך. נציג התוצאות מוצגות באיור4. - אופציונלי: השתמש בקרות פנימיות נוספות במדידה לבקרת איכות. להכין פקד שלילי על-ידי הוספת 30 µL לאוצין מיוצב d/o raffinose בינוני במקום 30% גלקטוז (אין אינדוקציה GFP). בנוסף, להוסיף µL 70 של 0.8 מ' בסורביטול התייצב G418 פתרון (300 µg/mL). החומר המדכא תרגום החלבון G418 משמש בקרה חיובית עבור עיכוב חלבונים כמו זה מונע GFP ביטוי שמרים.
- לחשב פלורסצנטיות GFP היחסי באחוזים עבור נקודת הזמן 20 h לפי המשוואה הבאה (ראה איור 4A):
איפה NC הוא הפקד שלילי
- לחלופין, לקבוע את פלורסצנטיות GFP היחסי עבור כל נקודה מדידה (תוך עשר דקות במקרה זה, ראה גם שלב 4.4) באמצעות המשוואה הנ ל. כפי שמוצג באיור 4B, ליצור גרף על ידי סופג עוצמות קרינה פלואורסצנטית GFP (ציר y) במשך הזמן (ציר x).
איפה NC הוא הפקד שלילי
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תהליך העבודה הכללי של הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מודגם באיור 1, בערך מסכם את השלבים יחיד עבור הניסוי assay עוקבות של הכתב GFP וטיהור RTA מוצלחת. תיאור מפורט יותר של כל שלב בודדים ניתן למצוא בפרוטוקול. איור 2 ממחישה את התוצאות הצפויות טיהור RTA מוצלחת מאת כרומטוגרפיית זיקה (איור 2 א) ושליטה וקטור ריק (איור 2B). איור 2C מראה תוצאה נציג של ניסוי desalting הממחישות את ההפרדה אידיאלי של הפסגה חלבון (כחול), פסגת eluted-מלח (חום). טיהור יעיל RTA מוצגת בצורת שהוכתמו Coomassie מרחביות-ג'ל באיור3. לבסוף, איור 4 מסכם כמה תוצאות המקורי מתקבל על ידי זה פשוט וחזק מבוסס-GFP כתב assay בשיטה6. איור 4A ממחיש כי וזמינותו כתב GFP הוקמה הוא מסוגל לייצר תוצאות אמינות, סכמטי מתארת את פלסמיד כתב GFP השתמשו במחקר זה. בגרף, זריחה GFP היחסי של שמרים spheroplasts בתנאים RTA- ובא שאינם מטופלים מושווה אחד עם השני. כצפוי, התאים הלא-induced, כמו גם שטופלו G418 מראים כמעט אין קרינה פלואורסצנטית GFP. תאים שאינם מטופלים ושליליים שטופלו שליטה (ריק וקטורית), הביטוי GFP אינו מושפע, לא נצפו הבדלים משמעותיים בין שני מדגמים. לעומת זאת, טיפול RTA מוביל ההפחתה הצפויה GFP פלורסצנטיות מתווכת על-ידי שלה ריבוזום עיכוב פעילות. איור 4B, מוצגת עקומה זמן של RTA-induced GFP פלורסצנטיות עיכוב. סוג זה של מסדי נתונים מכיל מידע נוסף על העיתוי של GFP ביטוי (90 דקות לאחר אינדוקציה גלקטוז) לבין נקודת ההתחלה של עיכוב translational מאת RTA (210 דקות לאחר היישום בפראי-סוג תאים). העיכוב פלורסצנטיות בתיווך RTA ירידה ככל הנראה משקף את ספיגת קינטיקה ותחבורה ציבורית תאיים של RTA ציטוזול. איור 4C ממחיש את פלורסצנטיות GFP היחסי המתקבל מוטציות שמרים שנבחרו לאחר ה 20 RTA-טיפול, בהשוואה ל- RTA-טיפול, בהשוואה ל- RTA שטופלו פראי-סוג התאים. הרכיבים עירד Hrd1p ו- Der1p נבחרו כפי חיובי מתאימים קובע כי מחקרים מוקדמים יותר כבר הוכיחה כי שני חלבונים מעורבים retrotranslocation אר-אל-ציטוזול של RTA שמרים1. לכן, שתי מוטציות להציג את הגידול הצפוי פלורסצנטיות GFP בהשוואה לפראי-סוג התאים. לעומת זאת, יחסי ערכים פלורסצנטיות GFP Δyos9, Δnup120 תאים אינם שונים באופן משמעותי. עברו כבר מתואר כי לא חוסר לקטין בקרת איכות ER Yos9p ולא חסר החלבון נקבוביות הגרעין Nup20p להשפיע RTA רעילות ותעבורה1. ניתן למצוא רשימה של הפרמטרים אחווה מסוימות כרומטוגרפיה ו- desalting טבלה 1.
איור 1: כללי זרימת עבודה של RTA טיהור ואת וזמינותו מבוסס-GFP כתב. הטיהור של RTA (משמאל) מתחיל עם הפיכתו של e. coli עם הביטוי או וקטור ריקה ואחריה טיפוח וביטוי RTA IPTG-induced. לאחר פירוק התא, סינון סטרילי, תגובת שיקוע מטוהר באמצעות ני2 + כרומטוגרפיית, טוהר דגימה מאומתת באמצעות Coomassie מכתים או תספיג חלבון. לפני שברים RTA eluted מוכנים להשתמש GFP כתב assay לניסוי, שברים צריך להיות desalted ולא מרוכז, ריכוז חלבון להיקבע. הניסוי assay כתב GFP (מימין) מתחיל עם הטרנספורמציה של מוטציות שמרים פראי-סוג ו/או שנבחרו למחיקה עם הבונה ביטוי GFP. לאחר טיפוח, דופן התא הוא הוסר על ידי טיפול אנזימטי RTA ויוו ספיגת לאפשר. ואז, GFP זריחה של שמרים תא spheroplasts נמדד בתנאים שטופלו הרעלן, שאינם מטופלים לאורך זמן, קורא קרינה פלואורסצנטית (475/509 ננומטר). לבסוף, זריחה GFP היחסי נקבע באמצעות המשוואה המוצגים בשלב 4.6 ומוצגת כמופיע באיור4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נציג כרומטוגרפיית זיקה, desalting תוצאות של e. coli תאים המכילים את חיית המחמד-RTA6 (שלו) או הפקד ריק וקטור. (א) טיהור טיפוסי גרף של e. coli תא lysate דוגמה המבטאת RTA6 (שלו) של וקטור pET24-RTA6 (שלו). עקומת הכחול מייצג את הספיגה UV-280 ננומטר הנגרמת על ידי טבעות ארומטיות חומצות אמינו Trp, טיר ואת Cys ומשמש מחוון חלבון. במהלך טעינת עמודה, לא מאוגד חלבונים מזוהים ב הזרימה דרך (0-10 מ"ל). לאחר הסרת חלבונים לא מאוגד בשטיפה עם איגוד מאגר, ריכוז מאגר • תנאי הוא גדל מ- 0 ל- 100% (עיקול אדום), חלבונים מאוגדים הם מיד eluted מן העמודה. הפסגה של העקומה כחול בין 25 ו-30 מ"ל מייצג את חלק מאוגדת שלו מתויג RTA (קופסה שחורה). (B) טיהור טיפוסי גרף e. coli lysate מתאי לבטא בקרה הריק וקטור. באותו פרוטוקול טיהור כמו (א). כפי שמוצג הקופסה השחורה, אין חלבונים eluted מן העמודה בפקד שלילי. (ג) Desalting תרשים של דוגמה6 (שלו) e. coli pET24-RTA לאחר טיהור זיקה. הדיאגרמה מציגה את ההפרדה של השבר חלבון RTA (שיא של ספיגת 280 nm בין 20-30 מ ל) לבין השבר מלח (הגדלת מוליכות שיא לאחר 30 מ ל).אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח המערבי נציג דוגמאות שונות לפני ואחרי טיהור זיקה של. 20 µL תא lysate (נתיבים 2-4) או מטוהרים מדגם (נתיבים 5-7) של וריאציות שונות של RTA (רק שלא שונתה RTA נעשה שימוש במחקר זה) נותחו על ידי עמודים מרחביות, Coomassie כחול מכתים. ליין 1, חלבון סולם; ליין 2, RTA שלא שונתה; ליין 3, RTAHDEL; ליין 4, RTAKDEL; ליין 5, RTA שלא שונתה; ליין 6, RTAHDEL; ליין 7, RTAKDEL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תוצאות נציג מתקבל על ידי וזמינותו כתב למוטאנטים מחיקה שטופלו RTA פראי-סוג ונבחרת שמרים- קרינה פלואורסצנטית (A) GFP היחסי של פראי-סוג שמרים spheroplasts המכיל את הכתב פלסמיד pRS315-K28SP- GFP (מימין) מתחת המושרה (3% גלקטוז, GFPind.) ו- induced (2% raffinose, GFPrepr.) תנאים לאחר 20 h GFP אינדוקציה. קרינה פלואורסצנטית GFP היחסי נותחו גם בנוכחות RTA (5 מיקרומטר), G418 (300 µg/mL) או הפקד שלילי (NC). החומר המדכא תרגום החלבון G418 משמש בקרה חיובית ומונע GFP ביטוי שמרים. סטיית תקן (SD) וערכים רשע מצוינים. זריחה (B) GFP היחסי של (A) מוצג כמובן זמן מעל 20 h. דיאגרמה זו מספקת מידע נוסף אודות התזמון של דיכוי הביטוי ותרגום GFP מאת RTA; עקומת ההתנהגות משקפת בעקיפין את קינטיקה של RTA ספיגת ותחבורה תאיים ציטוזול. (ג) תוצאה נציג של שמרים שנבחר תקינה מוטציות בחלבונים הסלולר אשר ידועים להיות מעורב (Hrd1p ו- Der1p) או לא מעורב (Yos9p ו- Nup120p) RTA בבני אדם שמרים1,6. הקו המנוקד מייצג את הסף של משמעות אשר מבוססת על הפליטה פלורסצנטיות מתקבל על ידי זנים בקרה חיובית (לקבלת הסבר נוסף ראה הפניה6). סטיית תקן (SD) וערכים רשע מצוינים. הדמות שונה של בקר. et al. 6 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פרמטר chromotography זיקה | ||
| מדידת פרמטרים | UV (280 ננומטר), ריכוז מאגר • תנאי, מוליכות | |
| הגדרות | משתנה ליחידה | ערך |
| קצב הזרימה | mL/min | 1 |
| העמודה המרבי לחץ | MPa | 0.35 |
| אורך גל | nm | 280 ננומטר |
| מאגר איגוד | משאבה עמדה | A |
| • תנאי מאגר | משאבה עמדה | B |
| מאגר • תנאי ההתחלה של ריכוז | % | 0 |
| מערכת אחסון פיצוי | mL | 10 |
| Equilibration טור | mL | 20 |
| דוגמת הזרקת מעל superloop/מזרק | mL | תא אחסון lysate |
| שטיפת שלב | mL | 20-35 |
| • תנאי שלב | mL | 20-35 |
| ריכוז מאגר • תנאי במהלך • תנאי | % | 100 |
| למשובטים של עמודה עם 20% EtOH | mL | 50 |
| הפרמטר desalting | ||
| מדידת פרמטרים | UV (280 ננומטר), מוליכות | |
| הגדרות | משתנה ליחידה | ערך |
| קצב הזרימה | mL/min | 4 |
| העמודה המרבי לחץ | MPa | 0.35 |
| אורך גל | nm | 280 ננומטר |
| מאגר איגוד | משאבה עמדה | A |
| • תנאי מאגר | משאבה עמדה | B |
| מאגר • תנאי ההתחלה של ריכוז | % | 0 |
| מערכת אחסון פיצוי | mL | 10 |
| Equilibration טור | mL | 20 |
| דוגמת הזרקת מעל superloop/מזרק | mL | תא אחסון lysate |
| מאגר desalting הזרקה (בסורביטול 0.8 מ') | mL | 100 |
| למשובטים של עמודה עם 20% EtOH | mL | 50 |
טבלה 1: הפרמטרים המשמשים לטיהור מבוססת עמודת זיקה desalting. רשימה של כל ההגדרות העמודה הרלוונטית (למשל, קצב הזרימה, ריכוז מאגר • תנאי, equilibration ומשך הכביסה שלב) נמדדו פרמטרים (למשל, מוליכות או UV הקליטה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעת ביצוע בפרוטוקול לעיל, אנו ממליצים על ההצעות הבאות על מנת להשיג תוצאות מוצלחות של הניסוי.
ביטוי חלבון heterologous, חשוב לא תעלה על ריכוז IPTG של 1 מ מ. ריכוז IPTG > 1 מ"מ לעכב יזם-induced RTA ביטוי ולהוביל להורדת התשואות הרעלן. יתר על כן, התאים לא צריך להיות מעובד בטמפרטורה גבוהה יותר 28 ° C כדי למנוע היווצרות הגוף הכללה, קיפול לא יעיל ו איון הרעלן. RTA ביטוי בטמפרטורה נמוכה (למשל, 20-28 מעלות צלזיוס) אפשרית, מוביל גם ייצור הרעלן פעילים ביולוגית. עם זאת, הפחתת טמפרטורה נוספים ולשפר RTA פעילות/קיפול ותוצאות תשואה הרעלן הכוללת נמוכה יותר בהשוואה ל- 28 מעלות צלזיוס (נתונים לא מוצג).
טיהור הפרמטרים של כרומטוגרפיית זיקה (טבלה 1) ממוטבים עבור השימוש במערכת טיהור אוטומטיות מצויד ני מ ל2 + טור זיקה, צריך להיות מותאם למערכות אחרות עמודה תוצרת בית או מסחרי אם RTA טוהר ועם תשואה הם תת אופטימלית. במקרה של טוהר RTA תת אופטימלית (מסומן על ידי הופעתו של חלבונים נוספים בתוך מוכתם Coomassie מרחביות-ג'ל), עלייה בריכוז imidazole של המאגר מחייב בדרך כלל מפחית איגוד לא ספציפי של חלבונים הטעון חיובית טורים, ובכך מגדיל את טוהר RTA הכללית. במקרה של תת אופטימלית RTA התשואות, הקדמה של sonification נוספים בשלבים (4-8 פולסים), זמן הדגירה פעמים (5 שעות) או אחסון תרבות גדולים יותר (> 1 ליטר) יכול לעזור לשפר את התשואה הכוללת של הרעלן. עם זאת, יש גם ההזדמנות לטהר RTA בהצלחה באמצעות מערכות עמודה מבוסס סחרור (נתונים לא מוצג) אם מערכת אוטומטית אינה זמינה במעבדה.
במהלך השלב desalting, חשוב לדלג על ההליך דגימה ברגע מוליכות מתחיל לעלות. זיהום עם מלח, במיוחד imidazole, השפעות המדידה ריכוז חלבון, וכתוצאה מכך לא מדויק קביעת ריכוז RTA המשפיע ישירות על התוכן RTA בשימוש וזמינותו כתב GFP.
זה חיוני כדי לאחסן RTA מטוהרים ב 4 ° C ולהימנע לקפוא. דוגמאות קפוא להראות פעילות מופחתת של RTA בתא מבוססי XTT מבחני חיוניות על הלה תאים (נתונים לא מוצג). ניתן לשמור דגימות מטוהרים בסביבות 3-4 שבועות לפני הפעילות הביולוגית שלהם פוחתת באופן רציף. בנוסף, ריכוז RTA גבוה (≥5 mg/mL) לאחר ריכוז עמודה ספין הם קריטיים כי RTA מראה נטייה לזרז ב- 0.8 מ' בסורביטול.
החיסרון של השיטה היא העובדה כי RTA היא בדרך כלל לא נלקחה על ידי תאי שמרים ללא פגע. כדי להשיג תוצאות אמינות, דופן התא שמרים צריך ניתן להסיר לחלוטין על ידי טיפול אנזימטי. לכן, זה חיוני כדי לבדוק אם spheroplast יעילות היווצרות של כל זן שמרים בשיטות המתוארות בצעדים 3.4-3.5. במקרה של הכנה spheroplast תת אופטימלית, זמן הדגירה וריכוז האנזים lytic עליו להיות ממוטבים, פיקוח באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב. Overdigestion (היווצרות רפאים) ניתן למנוע על ידי צמצום זמן ריכוז ו/או הדגירה אנזים lytic ואילו בגישה ההפוכה נדרשת במקרה של עיכול לא מספיק. לא להיות כלולים נתונים זנים עם דופן התא לא מספיקות להסרת נתוני ההערכה.
יש גם לציין כי הגדרת הניסוי לא לגמרי לחקות את תהליך טבעי הרעלת ריצין. התא מחייב B יחידה משנית של ריצין (לבסיס) חסר אשר אחראי בדרך כלל מחייב הרעלן יעיל גלקטוז שאריות על פני התא של תאי יונקים15. באופן תיאורטי, ניתן להתגבר מגבלה זו על-ידי ביצוע הניסוי עם ריצין מטוהרים holotoxin המכיל את A ו- B יחידה משנית. למרות זאת, לא ניחנת תאי שמרים גלקטוז שאריות על פני השטח שלהם התא אשר יכול לתווך קשירה של הטנקים8; עובדה זו גם מסביר מדוע תאי שמרים ללא פגע אינם רגישים נגד ריצין. לכן, לא ברור אם הטנקים היו מתנהגים כמרכיב מחייב תא במודל שמרים. מעניין, מחקרים לשעבר כבר הוכיח כי RTA הוא מסוגל להגיע את ציטוזול בתרבית של תאים ללא תא שלה מחייב B יחידה משנית16. כדי להבין תופעה זו, החלטנו להשתמש רק RTA בכיוונון ניסיוני כדי לזהות רכיבים שמרים הסלולר המספקות הרעלן סחר של קרום פלזמה לתוך ציטוזול. באופן מפתיע, המרכיבים המעורבים ב- RTA בבני אדם שמרים להראות דמיון בולט הרכיבים הנדרשים להעברה holotoxin ריצין יעיל בתרבית של תאים6. בהתבסס על תוצאות אלו, זה יכול להיות העריך כי הטנקים ממלאת תפקיד מינורי ריצין תאיים התחבורה מאשר בעבר אמור, חשוב רק המגע הראשוני אל פני השטח בתרבית של תאים.
לעומת זאת, במערכות מבוססות-siRNA בתאים בתרבית של לחלוטין משקפים את המצב הרעלן הטבעי, אך יקרה ועתירת3. יתר על כן, השימוש של מוטציות שמרים מחיקה נושאת היתרון החשוב זה המוטנטים להראות את מדהימה מלאה של החלבון של עניין, ואילו מערכות מבוססות siRNA בדרך כלל להוביל לירידה של רמת חלבון. במקרים מסוימים, רמות החלבון שיורית יכול להיות מספיק עבור הרעלן תחבורה לפיה אין פנוטיפ שונה נצפית, לפיכך, המעורבות של חלבון ספציפי אינה גלויה במערכות מבוססות siRNA.
למרות שאינם חיוניים רק שמרים מחיקה זנים שימשו במקור ללמוד6, הרגיש זנים, כמו גם שפע ירד מאת mRNA פרטורבציה (רטיבות) אוסף זנים17 (ביטוי מופחתת רמת ארומטיים חלבונים) מתאימים גם שיטה מסוג זה בעתיד. באופן כללי, התפקיד של חלבונים חיוניים לא יכול להיות חקירה עם assay הזה בגלל חוסר הכדאיות שלהם, ולכן מייצגים מגבלה של מערכת וזמינותו.
עם זאת, וזמינותו הכתב החדש מייצג אסטרטגיית אלגנטי ואלטרנטיבית לשיטות הקיימות, אשר מנסים לנתח RTA תחבורה באורגניזם מודל cerevisiae ס. המחקרים הקיימים בשימוש מונחה פלסמיד מערכות ביטוי של RTA תאיים, מוגבלים לניתוח של רטרו-רוברטסונית מחדר המיון לתוך ציטוזול1,7. יישום מוצלח של היישום RTA חוץ-תאית עכשיו פותח את האפשרות ללמוד לא רק מיון retrotranslocation אלא גם באופן עקיף לניתוח RTA תחבורה מ רה מ למרות את גולג'י לחדר המיון.תפקוד התאים, לוקליזציה של הרוב המכריע של שמרים גנים מתגלה כיום, זמינות במסדי נתונים, החלבונים המועמד מזוהה ניתן ישירות להקצות תאים ספציפיים ו/או להעביר מסלולים.
בסך הכל, השיטה assay הציג הכתב מייצג גישה קל וחזק כדי לזהות המועמד החלבונים המעורבים וגדילת של רעלנים או subunits טוקסין (למשל, RTA) אשר חוסמות חלבון תרגום ויוו. סטיות תקן נמוכה יחסית (1-10%), כמו גם את הפארמצבטית נתונים גבוהה במחקר המקורי מאשר הצהרות אלה. עקב הפורמט צלחת 96-ובכן, הקרנה מהירה של מוטציות שמרים שונים אפשרי תוך יום לאחר טיהור רעלים.
בעתיד, יש האפשרות להשתמש בשיטת להקרנה תפוקה גבוהה של שמרים מחיקת ספריות. בהכיוונון הנוכחי, הריכוז RTA יישומית (5 מיקרומטר) הוא מסוגל להקטין את פלורסצנטיות GFP יחסית ל- 50%. בתנאים אלה, השיטה מציע היתרון לזיהוי מוטציות מחיקה עם שלילי (זריחה GFP מוגבר) ואפקטים חיובי (זריחה GFP מופחתת) ב- RTA תחבורה. עבור הקרנות תפוקה גבוהה, הבדל חזק בין דגימות מטופלים שאינם מטופלים מועיל לפעמים. באמצעות ריכוז גבוה של RTA ו/או הגדלת המרווח מידה (למשל, 48 שעות), בלוק התפתחה דינאמיקה של GFP הביטוי צריך להיות בר השגה.
זה כדי להדגיש כי שיטה זו אינה מוגבלת רק כדי לנתח את התהליך שיכרון של RTA יישומית חוץ-תאית, שמרים, אבל יש גם ההזדמנות כדי לנתח את הייבוא ER של RTA בהבעת RTA באמצעות פלסמיד בגזע כתב GFP (נתונים לא מוצג). יתר על כן, ניתן גם להתאים הגישה ההקרנה ללמוד תחבורה תאיים מסלולים של אחרים ביוסינטזה חלבון עיכוב חלבונים כגון zymocin18 בעתיד. בניגוד מצב טוב מאופיין הריגה של zymocin, יחסית מעט מאוד ידוע על המסלולים לסחר בבני אדם אחראי תחבורה יעילה רעל לתוך ציטוזול19,20. ובכך, zymocin מייצג מועמד אופטימלית עבור מחקרים עתידיים כמו zymocin הוא נלקח באופן טבעי על ידי תאי שמרים. לפיכך, הסרת קיר התא יכול להיות מושמט אשר משפר את הביצועים הכוללים של הכתב GFP וזמינותו (ביחס זמן ועלויות). עם העזרה של assay כתב רב עוצמה זה, זה יהיה ריאלי כדי לנתח את התחבורה תאיים route(s) של zymocin של שמרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
חלקים של מחקר זה היו מתבקשים נתמך על ידי מענק של פתוח (SFB 1027, A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
