Summary
В рукописи мы описывают использование на основе дрожжей флуоресценции репортер проба для выявления клеточных компонентов, участвующих в торговле и убивать процессы цитотоксических Субблок рицин токсинному завод (RTA).
Abstract
Бактерий и растений A / B токсинов эксплуатировать природные людьми путей в эукариотических клеток для достижения их внутриклеточного ориентация в цитозоле и в конечном итоге убить. Такие A / B токсинов обычно состоят из ферментативно активной Asubunit (например, рицин токсинному (RTA)) и один или несколько ячеек, привязки Bsubunit(s), которые отвечают за токсин, привязки к определенным клеток поверхности рецепторы. Наши текущие знания о том, как A / B токсины способны эффективно опьяняющий клетки помогли ученым понять основных клеточных механизмов, как эндоцитоза и внутриклеточных белков, сортировка в высших эукариотических клеток. С медицинской точки зрения это также важно для выявления маршрутов оборота основных токсин найти решения адекватного лечения для пациентов или в конечном итоге разработать терапевтические токсин основанные применения для терапии рака.
С Анализ генома общесистемной A / B токсин, торговля в клетках млекопитающих является сложным, длительным и дорогостоящим, несколько исследований на A / B токсин транспорта выполнены в организме модель дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Несмотря на то что менее сложной, основных клеточных процессов в дрожжей и высших эукариотических клеток похожи и очень часто результаты, полученные в дрожжи могут быть переданы млекопитающих ситуации.
Здесь мы описываем быстрый и простой в использовании репортер пробирного анализа внутриклеточных торговли РТС в дрожжи. Существенным преимуществом нового анализа является возможность исследовать не только RTA ретро транслокации от эндоплазменный ретикулум (ER) в цитозоль, но скорее эндоцитоза и ретроградным токсин транспорт от плазматической мембраны в ER. Assay делает использование плазмида репортер, который позволяет косвенные измерения токсичности РТС через флуоресценции выбросов зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) после перевода в естественных условиях . Так как RTA эффективно предотвращает начало биосинтеза белка, 28S рРНК депуринизации, этот assay позволяет идентифицировать принимающей ячейки белков участвующих в внутриклеточного транспорта РТС через обнаружение изменений в флуоресценции выбросов.
Introduction
Пациентов, страдающих от инфекций, токсин, бактерий представляют серьезные медицинские и финансовое бремя для каждой социальной системы здравоохранения, в частности, поскольку по-прежнему во многом отсутствуют эффективные лечебные процедуры. Для разработки новых терапевтических стратегий, механизмов комплекса интоксикации медицински соответствующие A / B токсинов, таких как холера токсин, Сига токсин или рицин необходимо полностью понимать на молекулярном уровне на основе романа мощный анализов, которые должны быть реализованы.
В последние годы, несколько исследований попытались проанализировать A / B токсин транспорт в дрожжей и mammalian клеток с помощью длительных и дорогостоящих методов, таких как радиоактивного токсина маркировки1,2 , а также на основе малых интерферирующих РНК скрининг подходы к3. В некоторых случаях токсин людьми был визуализирован в естественных условиях по микроскопии флуоресцирования после химических и/или генетических сцепления отдельных токсин субблоков с флуорофоров, квантовые точки либо флуоресцентные белки4,5. К сожалению таких изменений часто приводят к неактивной и/или измененных природных свойств токсины. Другой элегантный способ ответить косвенно широкий спектр научных вопросов является использование репортер систем на основе ферментов, таких как lacZ, Люцифераза, или флуоресцентные белки (например GFP или Discosoma sp. красный флуоресцирующий белок () dsRed)).
В этой рукописи простой протокол описан, который идентифицирует клеточных компонентов, необходимых для внутриклеточного транспорта внеклеточно прикладной РТС в S. cerevisiae. Таким образом флуоресценции репортер плазмида, содержащие сигнал N-терминальный ER-импорта, следуют GFP выступает в качестве датчика биосинтез белка, который косвенно меры ингибирование перевод RTA-опосредованной белка GFP флуоресценции выбросов после в естественных условиях перевод6. В случае, что RTA эндоцитоз или внутриклеточных торговли отрицательно (или положительное) влияет в мутанта удаления конкретной дрожжей, по сравнению с одичал тип это может быть обнаружена через увеличение (или уменьшение) в GFP флуоресценции выбросов6.
Пока все методы анализа RTA транспорт в дрожжевых клеток были ограничены ER-цитозоль ретро транслокации процесс RTA. В такой системе искусственного РТС, содержащие сигнал импорта ER выражается от индуцибельной промоутер, что приводит к фенотипу суицидальные1,7. Хотя ячейку привязки B-Субблок рицин в экспериментальной установки, описанных в этой рукописи также отсутствует и, таким образом, не представляют собой полностью естественный ситуации рицин holotoxin интоксикации8, токсин транспорт из плазмы мембраны через аппарат Гольджи к ER можно тесно имитировать с этот роман assay. Интересно, что предварительные результаты, полученные в ходе экспериментального исследования указывают, что людьми пути, используемые RTA показывают поразительное сходство с опьянением маршрут рицин holotoxin.
В целом описан метод может использоваться для определения конкретной роли отдельных клеточных белков в RTA эндоцитоза и оборота дрожжей. Кроме того эта экспериментальная установка может легко адаптируется к другим рибосома инактивации токсинов производятся и от различных дрожжей и бактерий видов, таких как zymocin или сига токсин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Обзор общего рабочего процесса, экспериментальный изображен на рисунке 1.
Предупреждение: RTA высоко токсичен для людей. Требуется безопасность лаборатории разрешение S2 (биобезопасности уровня 2 эквивалент). Пожалуйста, носите перчатки в течение всего эксперимента.
1. гетерологичных выражение его меткой РТС в Escherichia coli
- Преобразование клеток кишечной палочки с выражение плазмида pET24-RTA(его) 6 или пустой вектор pET24a(+) с помощью стандартных электропорации протоколы9,10. Ячейки, содержащие пустые плазмида служат отрицательного контроля.
- После выбора положительных клонов на канамицин содержащих пластины фунтов (100 мкг/мл) прививать клетки, содержащие выражение плазмида RTA или пустой вектор в 5 мл LBКан среднего (LB средний 100 мкг/мл канамицин) и Инкубируйте на 37 ° C и 220 rpm за 24 ч.
- Дополнение 1 L LBКан средних с 5 мл перед культурой и инкубации клеток при 37 ° C и 220 об/мин, до тех пор, пока клетки достигли ОД600 0.8-1.0 (примерно 3-4 h). После этого уменьшить температуру культуры до 28 ° C и подготовить 1 M изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) раствор в H2O.
- Побудить RTA выражением E. coli , добавив IPTG до конечной концентрации 1 мм.
- После 3.5 h на 28 ° C и 220 rpm, урожай клетки центрифугированием на 10000 x g и 4 ° C на 10 мин, помыть лепешка два раза с 5 мл буфера привязки (500 мм NaCl, имидазола 10 мм и 20 мм х2PO4 pH = 7,4) на 10 000 x g и 4 ° C на 10 мин и Ресуспензируйте Пелле в 5 мл связывание буфера.
Примечание: Протокол может быть приостановлена на данном этапе, и клетки могут храниться при температуре 80 ° C в течение нескольких дней.
2. Очистка его меткой РТС через аффинной хроматографии
- Sonicate клетки на льду, используя следующий протокол: 15 s пульс (20 мкм), 30 s паузы. Повторите этот шаг пять раз.
- Центрифуга клеток lysate на 21 000 x g и 4 ° C на 15 мин и фильтровать супернатанта, используя систему фильтров стерильный шприц (размер пор 0.2 мкм).
Примечание: Гранулы клетки успешно sonicated образцов Показать прозрачные границы. - Использовать систему автоматизированной очистки с 5 мл Ni2 +-на основе сходства столбец для того чтобы очистить его меткой RTA фракция от стерильной фильтрации E. coli супернатант. В общем используйте элюции скорость 1 мл/мин и охладить весь очистки системы для предотвращения привязки неэффективным токсин и потеря активности токсин.
Примечание: В таблице 1перечислены параметры для эффективной очистки RTA. Смотрите также Беккер и др. для дальнейшей информации,9.- Вкратце сбалансировать столбце сходства с 20 мл буфера привязки удалить буфер хранения. Примените стерильной фильтрации супернатант на столбец сходства с помощью шприца.
- Промойте колонку с 25-35 мл буфера привязки для удаления unbound протеины из столбца. Выполните шаг Стиральная до поглощения УФ на 280 Нм находится недалеко от начального значения УФ.
- Элюировать привязанных RTA фракция 20-35 мл буфера (имидазол 500 мм, 500 мм NaCl, 20 мм х2PO4, pH = 7.2) и сохранить образец на льду (рисунок 2A и 2B рисунок).
Примечание: Элюции RTA фракции характеризуется увеличением УФ поглощения. Пожалуйста, обратите внимание исключительно собирать эта фракция для предотвращения загрязнения с неспецифическими связанных белков. - Используйте 20 мкл eluted образцов для выполнения Кумасси синим пятнать11 или Вестерн-блот анализ12,13 (необязательно). Используйте начальных против его антител (1:1, 000) и вторичные анти-mouse-IgG-ПХ (1:10, 000) для обнаружения РТС и проверки чистоты образца (рис. 3).
- Опреснения eluted RTA дроби на 5 мл опреснительной столбца и сбалансировать образца в 0,8 М сорбитол.
- Заменить сродство столбца столбец системы очистки опреснительной и впервые сбалансировать столбец с 20 мл сорбитола 0,8 М.
- Примените eluted RTA дроби к столбцу через шприц. Промойте колонку с 100 мл сорбитола 0,8 М и элюировать обессоленной RTA дроби в 15 мл трубку, как только поглощения УФ начинает увеличить (рис. 2 c).
- Хранить eluted RTA дроби при 4 ° C.
Примечание: Непосредственно остановите RTA доля выборки, когда проводимость увеличивается во избежание загрязнения соли. В таблице 1 перечислены параметры для опреснительной процедуры.
- Концентрат eluted RTA дроби на 10000 x g и 4 ° C на 30-180 мин с использованием 10 кДа Усеченная колонна спина в окончательный объем 1-2 мл и хранить образца при температуре 4 ° C для 3-4 недели.
Предупреждение: Не замерзают образца после замораживания приводит к полной потере RTA деятельности. - Определите концентрацию белка, используя набор для определения обычного белка. Концентрация белка должно быть в диапазоне 1-1,5 мг/мл.
Примечание: РТС, как правило, осадок при слишком высокой концентрации протеина (> 5 мг/мл).
3. дрожжи преобразования и удаления клеточной стенки
- Трансформировать одичал тип или отдельных дрожжи удаления мутантов с GFP репортер плазмида pRS315-K28SP- GFP6 с помощью стандартной литий ацетат трансформации методов14. Инкубировать клетки на лейцина отсева (d/o) глюкозы пластины (2% раствор глюкозы, агар 1,5%, 0,5% сульфата аммония, 0,17% дрожжей азота базы (YNB) и 0.087% d/o смесь без лейцина) при 30 ° C на 2-3 дня по критерию позитивных клон.
- Выберите 3 клоны различных дрожжей от каждой плиты и инокуляции клонов в 100 мл лейцина d/o Рафиноза среды (Рафиноза 2%, 0,5% сульфата аммония, 0,17% YNB и 0.087% d/o смесь без лейцина) 220 об/мин и 30 ° C до600 OD = 1.0-2.0 (2-4 x 107 клеток/мл).
Примечание: Рост клеток штаммов удаления различных дрожжей отличается. Монитор ОД600 через спектрофотометром. - Для вычисления значений600 ОД, развести образцы ОД600 = 0,1-0,3 (1:5 до 1:10 разведений) и измерения600 ОД в спектрофотометре. Как ссылка используйте H2O дополнена соответствующее количество лейцина d/o raffionose среды.
- После того, как отделочные шаг 3.5, смешать 4 мкл spheroplasted 50 мл культуры с 496 мкл буфера spheroplasting (примерно 2 × 106 spheroplasts) и центрифуги для 10 мин на 400 x g.
- Ресуспензируйте Пелле в 10 мл H2O дистиллированной, образец вихрь 30 s, и пластины из 10 мкл пример на лейцина d/o глюкозы пластины (2% раствор глюкозы, агар 1,5%, 0,5% сульфата аммония, 0,17% YNB и 0.087% d/o смесь без лейцина).
- Инкубации клеток для 3 дней при 30 ° C. Подсчитать общее количество колоний выращенные клетки на плите. Для оценки данных, используйте только образцы с эффективностью более чем 98% (всего количества клеток колонии < 40 колоний/плита).
4. GFP репортер Assay измерения в 96-луночных пластины
- Семена из spheroplasts клеток дрожжей, полученный на шаге 3.7 в 96-луночных пластины (200 мкл/хорошо).
- Добавить 70 Рафиноза среднего d/o мкл стабилизированный лейцина, содержащие отрицательный контроль (элюата Ni2 +-сродство очищенный lysate клетки от клеток IPTG-индуцированной E. coli , выражая пустой вектор) или очищенного РТС в конечной концентрации РТС 5 мкм ( соответствует 160 г/Л RTA) в каждой скважине.
- Сразу же добавьте 30 решение галактозы мкл стабилизировалась (галактоза 30%, сорбит 0,8 М) чтобы побудить экспрессия гена GFP и впоследствии начать измерение.
Примечание: Выполнить по крайней мере 3 технических реплицирует за эксперимент и 3 биологических реплицирует на штамм дрожжей. - После окончания подготовки проб (шаги 4.1-4.3) Положите пластину 96-луночных флуоресценции читателя и начать измерение. Используйте фильтр 475/509 Нм, набор необходимых для GFP флуоресценции обнаружения. Выполнения измерений при 30 ° C, 120 об/мин и с трястия диаметром 1 мм над окно времени 20 h (измерения каждые 10 минут).
Примечание: Набор фильтров GFP обычно доступна во всех системах читателя. Температура, время окна, измерения интервалов и концентрация РТС может настраиваться для собственных нужд. Представитель результаты показаны на рисунке 4. - Дополнительно: Используйте дополнительные механизмы внутреннего контроля в области измерения для контроля качества. Подготовьте отрицательный контроль, добавив 30 мкл стабилизированный лейцина d/o Рафиноза среднего вместо 30% галактозу (не GFP индукции). Кроме того 70 мкл раствора G418 0,8 М сорбитол стабилизировалась (300 мкг/мл). Перевод ингибитором белка G418 служит в качестве позитивного управления для ингибирования белка как он предотвращает экспрессия гена GFP в дрожжи.
- Рассчитать относительный GFP флуоресценции в процентах для точки время 20 h по следующему уравнению (см. рис. 4A):
где NC является отрицательный контроль
- Кроме того, определить относительную GFP флуоресценции для каждой точки измерения (в данном случае 10 мин, также смотрите шаг 4.4) с использованием выше уравнения. Как показано на рисунке 4В, создайте граф, промокательной интенсивностью флюоресценции GFP (ось y) с течением времени (ось x).
где NC является отрицательный контроль
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Процесс общего протокола, описанные в этой рукописи показана на рис. 1, примерно обобщение одного шаги для успешной очистки РТС и последующих GFP репортер пробирного эксперимент. Более подробное описание каждого отдельного шага можно найти в протоколе. Рисунок 2 иллюстрирует ожидаемый результат успешной очистки RTA аффинной хроматографии (рисунок 2A) и пустой вектор управления (рис. 2B). Рисунок 2 c показывает представитель результат опреснительной эксперимента, иллюстрирующие идеальное разделение белков пик (синий) и пик этого eluted соли (коричневый). Эффективное очищение RTA представлена в виде окрашенных Кумасси SDS-геля на рисунке 3. Наконец Рисунок 4 приведены некоторые оригинальные результаты, полученные этой простой и надежной основе GFP репортер пробирного метод6. На рисунке 4A показано, что установленные assay репортера GFP способен производить достоверные результаты и схематически изображает плазмида репортер GFP, используемые в данном исследовании. В графе относительная GFP флуоресценции дрожжей spheroplasts условиях RTA-лечение и не лечить сравниваются друг с другом. Как и ожидалось,-индуцированной, а также G418-лечение клетки показывают практически не GFP флуоресценции. В клетках-лечение и отрицательный контроль лечение (пустой вектор) экспрессия гена GFP не влияет и не наблюдались существенные различия между обоих образцах. В противоположность этому RTA лечение приводит к ожидаемого сокращения флуоресценции GFP, при посредничестве его рибосомы, ингибирующих активность. В рисунке 4Вотображается время кривой GFP RTA-индуцированной флуоресценции ингибирования. Такого рода представления данных содержит дополнительную информацию о сроках экспрессия гена GFP (90 минут после индукции галактозы) и отправной точкой поступательного торможения, RTA (210 мин после нанесения в клетках одичал типа). Задержка в РТС опосредованной флуоресценции снижение скорее отражает поглощение кинетики и внутриклеточного транспорта РТС в цитозоль. Рисунок 4 c иллюстрирует относительный GFP флуоресценции получены мутанты выбранных дрожжей после 20 h RTA-лечение и по сравнению с RTA-лечение и по сравнению с RTA-лечение одичал тип клеток. ERAD компоненты Hrd1p и Der1p были выбраны как подходящие положительные элементы управления потому что уже ранее исследования показали, что оба белка участвуют в ER-цитозоль retrotranslocation РТС в дрожжи1. Таким образом оба мутантов Показать ожидаемый рост в флуоресцировании GFP, по сравнению с одичал тип клеток. В отличие от относительных значениях флуоресценции GFP в Δyos9 и Δnup120 клетки не значительно отличаются. Это уже было описано, что отсутствие контроля качества Лектин ER Yos9p ни отсутствие в ядерной поры белка Nup20p влияют на РТС токсичности и транспорта1. Список конкретных сродство хроматографии и обессоливания параметров можно найти в таблице 1.
Рисунок 1: общий рабочий процесс очищения РТС и на основе GFP репортер пробирного. RTA очистки (слева) начинается с преобразования кишечной палочки с выражение или пустой вектор, следуют культивирования и IPTG-индуцированной RTA выражение. После лизиса клеток и стерильной фильтрации супернатанта очищается через Ni2 + аффинной хроматографии и образец чистоты проверяется через Окрашивание Кумасси или западную помарку. Прежде чем eluted фракций RTA готовы для использования в эксперименте assay репортера GFP, фракции должны быть обессоленной и сосредоточены, и концентрация белков должны быть определены. GFP репортер пробирного эксперимент (справа) начинается с преобразования одичал типа и/или отдельных дрожжи удаления мутантов с построить выражение гена GFP. После выращивания клеточной стенки удаляется Ферментативная обработка позволяют РТС в естественных условиях поглощения. Затем, GFP флуоресценции клеток дрожжей spheroplasts измеряется токсин лечение и не лечить условиях со временем в флуоресценции читателя (475/509 Нм). Наконец относительной GFP флуоресценции определяется с помощью уравнения, показанный в шаге 4.6 и отображается, как показано на рисунке 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель аффинной хроматографии и обессоливания результаты клеток E. coli , содержащие ПЭТ RTA(его) 6 или пустой вектор управления. (A) типичный очистки график пример lysate клетки E. coli выражая RTA(его) 6 от вектора pET24-RTA(его) 6. Синяя кривая представляет УФ поглощения на 280 Нм вызванные ароматических колец аминокислот ГТО, Tyr и Cys и служит показатель белка. Во время загрузки столбца, unbound протеины обнаруживаются в поток через (0-10 мл). После удаления unbound протеины промывкой привязки буфера, Элюирующий буфер концентрация увеличивается от 0 до 100% (красная кривая) и связанные протеины сразу этого eluted из столбца. Пик голубой кривой между 25 и 30 мл представляет часть связанных с тегами его RTA (черный ящик). (B) типичный очистки график E. coli lysate от клеток, выражая пустой вектор управления. Тот же протокол очистки как (A). Как показано в черный ящик, не белки являются этого eluted из столбца в элементе управления негативное. (C) Desalting схема образца(его) 6 pET24-RTA E. coli после очищение сродства. На схеме показано разделение RTA белковые фракции (пик 280 Нм поглощения между 20-30 мл) и соль дроби (увеличение проводимости пик после 30 мл).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель Западной анализ различных выборок до и после очищение сродства. 20 мкл клеток lysate (полос 2-4) или очищенного образца (полосы 5-7) различных вариантов RTA (только неизмененные РТС был использован в этом исследовании) анализируемой SDS-PAGE и Окрашивание Кумасси синий. Переулок 1, лестница белка; переулок 2, неизмененное RTA; переулок 3, РТСHDEL; переулок 4, РТСKDEL; переулок 5, неизмененное RTA; переулок 6, РТСHDEL; переулок 7, РТСKDEL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель результаты assay репортера для удаления мутантов RTA-лечение одичал тип и отдельных дрожжи. (A) относительной GFP флуоресценции одичал типа spheroplasts дрожжи, содержащие репортер плазмида pRS315-K28SP- GFP (справа) под индуцированной (3% галактозы, GFPind.) и не индуцированной (2% Рафиноза, GFPrepr.) условий после 20 h GFP индукции. Относительной GFP флуоресценции также был проанализирован в присутствии RTA (5 мкм), G418 (300 мкг/мл) или отрицательный контроль (НК). Перевод ингибитором белка G418 служит позитивным элементом и предотвращает экспрессия гена GFP в дрожжей. Указаны средние значения и стандартное отклонение (SD). (B) относительные GFP флуоресценции от (A) отображается как время курс более 20 ч. Эта схема обеспечивает дополнительную информацию о сроках GFP выражение и перевод ингибирования RTA; Кривая поведение косвенно отражает кинетика RTA поглощения и внутриклеточного транспорта в цитозоль. (C) представитель результат выбранного дрожжи дефектных мутантов в клеточных белков, которые известны как (Hrd1p и Der1p), или не занимаются RTA торговлей дрожжи1,6(Yos9p и Nup120p). Пунктирная линия представляет пороговое значение, который основан на флуоресценции выбросов, полученные штаммы положительный контроль (объяснения см. в Справочник6). Указаны средние значения и стандартное отклонение (SD). Рисунок был изменен от Беккер и др. 6 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Параметр Маска соответствия chromotography | ||
| Измерения параметров | UV (280 Нм), концентрация Элюирующий буфер, проводимость | |
| Параметры | Переменная/подразделение | Значение |
| Скорость потока | Мл/мин | 1 |
| Максимальная столбец давление | MPa | 0,35 |
| Длина волны | Нм | 280 Нм |
| Привязка буфер | Насос позиции | A |
| Элюирующий буфер | Насос позиции | B |
| Начальная концентрация Элюирующий буфер | % | 0 |
| Системы объем компенсации | mL | 10 |
| Колонка уравновешивания | mL | 20 |
| Пример инъекций над superloop/шприц | mL | Объём lysate клетки |
| Стиральная шаг | mL | 20-35 |
| Элюирующий шаг | mL | 20-35 |
| Элюирующий буфер концентрации во время элюции | % | 100 |
| Межповерочный столбца с 20% EtOH | mL | 50 |
| Обессоливания параметр | ||
| Измерения параметров | UV (280 Нм), проводимость | |
| Параметры | Переменная/подразделение | Значение |
| Скорость потока | Мл/мин | 4 |
| Максимальная столбец давление | MPa | 0,35 |
| Длина волны | Нм | 280 Нм |
| Привязка буфер | Насос позиции | A |
| Элюирующий буфер | Насос позиции | B |
| Начальная концентрация Элюирующий буфер | % | 0 |
| Системы объем компенсации | mL | 10 |
| Колонка уравновешивания | mL | 20 |
| Пример инъекций над superloop/шприц | mL | Объём lysate клетки |
| Обессоливания буфера инъекции (сорбитол 0,8 М) | mL | 100 |
| Межповерочный столбца с 20% EtOH | mL | 50 |
Таблица 1: параметры, используемые для очистки на основе столбцов сродства и обессоливания. Список всех параметров соответствующих столбцов (например, скорость потока, Элюирующий буфер концентрации, уравновешивания и продолжительность стирки шаг) и измеренных параметров (например, проводимости или УФ поглощения).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При выполнении вышеупомянутый Протокол, мы рекомендуем следующие предложения для достижения успешных результатов эксперимента.
Для выражения гетерологичных протеина важно не превышать концентрацию IPTG 1 мм. IPTG концентрации > 1 мм подавляют промоутер индуцированной RTA выражения и приведет к снижению урожайности токсин. Кроме того клетки не должно быть культивируемых при температурах выше 28 ° C для предотвращения включения тела формирования, неэффективной и складывающиеся инактивации токсинов. RTA выражение при низкой температуре (например, 20-28 ° C) возможна и также приводит к производства биологических активных токсина. Однако сокращение дополнительных температуры не значительно улучшить RTA деятельность/складные и приводит к снижению урожайности всего токсин, по сравнению с 28 ° C (данные не показаны).
Параметры очистки аффинной хроматографии (Таблица 1) оптимизированы для использования системы автоматизированной очистки с 5 мл Ni2 + близость столбца и должна быть скорректирована с другими столбец домашней или коммерческих систем, если RTA чистоты и урожайности являются оптимальными. В случае субоптимальных RTA чистоты (обозначается появление дополнительных белков в окрашенных Кумасси SDS-гели), увеличение концентрации имидазола привязки буфера обычно уменьшает неспецифических привязки положительно заряженных белков столбец, тем самым увеличивая общий РТС чистоты. В случае субоптимальных RTA урожайности, введение дополнительного озвучивания шаги (4-8 импульсов), дольше инкубации раз (5 h) или большие объемы культуры (> 1 L) может помочь улучшить урожайность токсин. Однако, есть также возможность успешно очистить РТС через счетчик столбцов на основе системы (данные не показаны) если автоматизированная система не доступен в лаборатории.
На этапе опреснительной важно пропустить процедуру отбора проб, как только проводимость начинает расти. Загрязнение с солью, особенно имидазола, влияет на измерение концентрации протеина, что приводит к неточным определения концентрации РТС, которая непосредственно влияет на РТС содержимое, используемое в assay репортера GFP.
Это важно для хранения очищенной RTA при температуре 4 ° C и избежать замораживания. Замороженные примеры показывают снижение активности РТС в ячейке на основе XTT жизнеспособность анализов на НеЬа клетки (данные не показаны). Очищенный образцы могут храниться около 3-4 недель, прежде чем их биологическая активность постоянно уменьшается. Кроме того высокие концентрации ДТП (≥5 мг/мл) после отжима столбец концентрации важны, потому что RTA показывает тенденцию осадок в 0,8 М сорбитол.
Недостатком метода является тот факт, что RTA обычно не занимают нетронутыми дрожжевых клеток. Для достижения надежных результатов, дрожжи клеточной стенки необходимо полностью удалить по ферментативной обработки. Таким образом важно, чтобы проверить эффективность формирования сферопласт каждого штамма дрожжей методы, описанные в шагах 3.4-3.5. В случае подготовки субоптимальных сферопласт время инкубации и концентрации литических ферментов следует оптимизированы и осуществляется через фазово-контрастной микроскопии. Overdigestion (призрак образование) могут быть предотвращены путем снижения концентрации и/или инкубации время литических ферментов в то время как противоположный подход необходим в случае недостаточности переваривания. Данные из штаммов с недостаточным клеточной стенки удаления должны исключаться из оценки данных.
Следует также отметить, что экспериментальной установки не полностью имитируют процесс естественной интоксикации рицин. Ячейка привязки B Субблок рицин (RTB) отсутствует, который обычно отвечает за эффективное токсин привязки галактозы остатков на поверхности клеток, клеток млекопитающих15. Теоретически это ограничение можно преодолеть путем выполнения эксперимента с holotoxin очищенный рицин, содержащих A и B субъединицы. Тем не менее дрожжевые клетки не обладают галактозы остатков на их клеточной поверхности, которая может посредничать привязки RTB8; Этот факт также объясняет, почему нетронутыми дрожжевых клеток не чувствительны против рицин. Таким образом неясно, если RTB будет выступать в качестве ячейку привязки компонента в модели дрожжей. Интересно, что бывший исследования уже продемонстрировал, что РТС удалось достичь цитозоле клеток млекопитающих без его ячейку привязки B Субблок16. Чтобы понять это явление, мы решили использовать только РТС в экспериментальной установки для выявления клеточных компонентов дрожжей, которые облегчают токсин, людьми с плазматической мембраны в цитозоль. Удивительно компоненты, участвующие в РТС, торговлей дрожжей показывают поразительное сходство компонентов, необходимых для эффективного рицин holotoxin транспорта в mammalian клетках6. На основе этих результатов может предположил, что RTB играет незначительную роль в транспорт внутриклеточного рицин, чем ранее предполагалось и важно только для первоначального контакта на поверхности клеток млекопитающих.
В отличие от систем на основе малых интерферирующих РНК в клетки млекопитающих прекрасно отражают ситуацию естественных токсинов, но являются длительным и дорогостоящим3. Кроме того, использование дрожжей удаления мутантов несет важное преимущество, что мутанты Показать полный нокаут протеина интереса, в то время как на основе малых интерферирующих РНК систем обычно ведут к сокращению уровня белка. В некоторых случаях уровень остаточного протеина может быть достаточно для транспорта токсин которой наблюдается не изменены фенотипа и, таким образом, привлечение конкретных белка не видна в системах на основе малых интерферирующих РНК.
Хотя штаммов удаление только несущественные дрожжей использовались в оригинальные исследования6, температура чувствительных штаммов, а также сократились мРНК возмущений (сырой) коллекции штаммов17 (снижение уровня экспрессии основных изобилия белки) подходят также для такого метода в будущем. В целом, роль основных белков может быть поэтому разбираемся с этот assay из-за их отсутствия жизнеспособности, представляют собой ограничение анализа системы.
Однако новый assay репортера представляет элегантный и альтернативные стратегии для существующих методов, которые пытаются анализировать RTA транспорта в организме модели S. cerevisiae. Существующие исследования использовали внутриклеточных инициативе плазмида RTA выражение и ограничены к анализу ретро транслокации ER в цитозоль1,7. Успешное осуществление внеклеточного приложения RTA теперь открывает возможность не только изучать ER retrotranslocation, но и косвенно анализировать RTA транспорта от вечера хотя Гольджи к ER.Как клеточную функцию и локализация большинства дрожжей сегодня обнаружили гены и имеющейся в базах данных, выявленных кандидат белки могут выделяться непосредственно для конкретных отсеков и/или транспортные пути.
В целом метод assay введено репортер представляет собой простой и надежный подход к выявления кандидата белков, участвующих в торговле внутриклеточных токсинов или токсин подразделения (например, RTA), которые блокируют белка перевод в естественных условиях. Относительно низкий стандартных отклонений (1-10%), а также высокую воспроизводимость в первоначальном исследовании подтверждает эти заявления. Из-за формат 96-луночных пластины быстрый показ различных дрожжей мутантов возможен в течение одного дня после очистки токсинов.
В будущем есть возможность использовать этот метод для высокопроизводительного скрининга дрожжей удаления библиотек. В текущей настройке прикладной RTA концентрация (5 мкм) возможность уменьшения относительной GFP флуоресценции до 50%. В этих условиях метод дает преимущество для идентификации удаления мутантов с отрицательным (увеличение GFP флуоресценции) и положительный (снижение GFP флуоресценции) воздействии на RTA транспорта. Для высокой пропускной способности показы иногда полезно сильнее разницу между образцами очищенных и не лечить. Используя более высокие концентрации ДТП и/или увеличения интервала измерения (например, 48 ч), еще более выраженный блок экспрессия гена GFP должны быть достижимыми.
Это необходимо подчеркнуть, что этот метод не ограничены только анализировать процесс интоксикации внеклеточного прикладной РТС в дрожжи, но есть также возможность анализировать ER импорт RTA, выражая РТС через плазмида в этот штамм репортер GFP (данные не показано). Кроме того скрининг подход также может быть адаптирована для изучения путей внутриклеточного транспорта других биосинтеза белка, ингибирующих белки, например zymocin18 в будущем. В отличие от режима хорошо характеризуется убийство zymocin относительно мало известно о торговле людьми путей, отвечает за эффективное токсин транспорта в цитозоль19,20. Таким образом zymocin представляет оптимальный кандидат для будущих исследований, как zymocin естественно рассмотрен дрожжевых клеток. Таким образом удаление клеточной стенки могут быть опущены, которая повышает общую производительность assay репортера GFP (в отношении времени и расходов). С помощью этой мощной репортер пробирного было бы целесообразно для того чтобы рассечь внутриклеточного транспорта удерживающее zymocin в дрожжей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Части этого исследования были любезно при поддержке гранта от Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
