Summary
Este protocolo descreve um método para determinar a proteína meia-vida em vida única células aderentes, usando pulso rotulagem e imagem latente de lapso de tempo de fluorescência de proteínas da fusão SNAP-marca.
Abstract
As proteínas estão em um estado dinâmico da síntese e degradação e sua meia-vida podem ser ajustada sob várias circunstâncias. No entanto, mais comumente usados abordagens para determinar ou Half-Life da proteína são limitados para as médias de população de células lisadas ou exigem o uso de inibidores da síntese de proteínas. Este protocolo descreve um método para medir a proteína meia-vida em vida única células aderentes, usando proteínas da fusão SNAP-etiqueta em combinação com microscopia de fluorescência lapso de tempo. Qualquer proteína de interesse fundido a um SNAP-tag pode ser ligados covalentemente por uma tintura fluorescente, de célula permeável que está acoplada a um derivado de benzylguanine, e a decadência da população rotulada de proteína pode ser monitorizada após a lavagem do corante residual. Célula subsequente acompanhamento e quantificação da intensidade da fluorescência integrado sobre resultados de tempo em uma curva de decaimento exponencial para cada célula rastreada, permitindo a determinação de taxas de degradação de proteínas em células únicas pelo encaixe de curva. Este método fornece uma estimativa para a heterogeneidade das meias-vidas em uma população de células cultivadas, que não podem ser facilmente avaliados por outros métodos. A abordagem apresentada aqui é aplicável a qualquer tipo de culturas de células aderentes de expressar uma proteína de interesse fundido a um SNAP-tag. Aqui usamos as células-tronco embrionárias (ES) do mouse cultivadas em placas de cultura de células E-caderina-revestido para ilustrar como único degradação celular, taxas de proteínas com uma ampla gama de meia-vida podem ser determinadas.
Introduction
É sabido que as proteínas celulares passam por extenso volume de negócios, com taxas de síntese e degradação, sendo específicas para cada proteína e sujeitas a regulação fisiológica. Tradicionalmente, taxas de degradação de proteínas são medidos usando métodos em massa, tais como análise de perseguição de pulso radioactivos, ou envolvendo inibidores da síntese de proteínas tais como cicloheximida1. Mais recentemente, isótopo estável, etiquetando com aminoácidos na cultura de pilha (SILAC) em combinação com a espectrometria de massa foi estabelecido para quantificar o volume de negócios de proteína em uma escala global2. No entanto, esses métodos são limitados por uma média de população, e informações sobre a variabilidade de célula para célula, portanto, estão perdidas. Além disso, mudanças transientes na degradação de proteínas que são sincronizadas através de população celular não podem ser identificadas.
Alternativamente, proteína de meia-vida também pode ser determinado por abordagens baseadas em fluorescência, que muitas vezes têm a vantagem de fornecer resolução de célula única. Por exemplo, uma proteína fluorescente verde photoactivatable (paGFP) tem sido usada para determinar o Oct4 Half-Life no início3embriões de mamíferos. Um outro método para monitorar a degradação de proteínas em células vivas é o uso de uma marca de SNAP em combinação com a imagem de lapso de tempo de fluorescência. A SNAP-tag é uma versão mutante da enzima O reparo DNA6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) que reage especificamente com benzylguanine derivados de (BG), que podem ser acoplados ao sondas moleculares4,5, 6. portanto, qualquer proteína de fusão SNAP-etiqueta pode ser irreversivelmente rotulada com um corante fluorescente, de permeável célula. Rotulagem de pulso de uma proteína de interesse fundido a marca do SNAP, seguida de esmaecimento do corante residual, permite para monitorar a degradação da população rotulada de proteína e, portanto, para a determinação de Half-Life da proteína. SNAP-etiquetas tem sido utilizados com sucesso para a rotulagem de pulso-perseguição de proteínas e para a determinação da proteína meias-vidas em aderente celulares cultura e na vivo5,7,8,9. Uma grande variedade de substratos SNAP-marca cobrindo comumente usado de espectros fluorescentes são comercialmente disponíveis, permitindo a seleção do corante ideal para cada aplicação específica. Assim, SNAP-marcas também podem ser usadas para a imagem latente multicolor em combinação com outras proteínas da fusão fluorescente ou corantes. Corantes célula-impermeável são adequados para a rotulagem das proteínas de membrana-amarrados, Considerando que a célula-permeável corantes são aplicáveis para o monitoramento de proteínas intracelulares e membrana-limite. Além disso, alguns dos tais sondas não exibem quase nenhuma fluorescência basal e apenas começam a emitir um sinal fluorescente forte sobre vinculação a um SNAP-marca10.
Este protocolo descreve como medir as taxas de degradação de proteínas diferentes de interesse em células únicas usando um SNAP-tag. Aqui podemos aplicar esse método para as células-tronco embrionárias (ES) do mouse cultivadas na E-caderina, mas deve ser possível usá-lo com qualquer tipo de células cultivadas aderentes. Mostramos que pulso rotulagem de proteínas da fusão SNAP-marca seguidas por imagens de lapso de tempo de fluorescência permite determinar as única célula meias-vidas de várias proteínas de interesse e fornece uma estimativa para a variabilidade de célula para célula de meias-vidas em um população de células cultivadas.
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Protocol
Nota: Neste estudo, foi usada a linha da célula E14 ES. No entanto, este protocolo é directamente aplicável a qualquer outra linha de células de rato ES expressar uma proteína de interesse fundido a um SNAP-tag, marcando a proteína endógena ou usando superexpressão. Para os exemplos mostrados na seção de resultados, foram utilizadas linhas de células de fusão SNAP-tag doxiciclina-inducible (SNAP-marca fundiu-se para as seguintes proteínas: Nanog, Oct4, Srsf11, ou para o mOrange2 de proteínas fluorescentes e sfGFP e colocar sob o controle de um doxiciclina-inducible promotor. Veja11 para obter mais informações sobre o plasmídeo utilizado para a geração das linhas de célula doxiciclina-inducible SNAP-marca fusão). O sistema de doxiciclina-inducible pode ser particularmente útil, pois permite controlar rigidamente o tempo e na intensidade da expressão da proteína de interesse. C-terminal de posicionamento de marca do SNAP é recomendado, como mudar o N-terminal sequência de aminoácidos é mais susceptível de modificar o Half-Life da proteína alvo (N-fim regra12).
1. E-caderina revestimento e propagação de células
- Gere uma linha de celular ES expressar uma proteína de interesse fundido ao SNAP-marca4.
- Pratos de cultura de célula casaco 100 mm com 4 mL de gelatina de 0,1% (diluída em solução salina tamponada fosfato (PBS) sem Ca2 +/ mg2 +) por 1 h. Retire a gelatina e deixem secos por 1 h. uso imediatamente ou armazenam os pratos revestidos por até 2 meses.
- Crescer a linhagem de células de interesse em meio de cultura celular ES (Glasgow mínimo essencial médio, suplementado com 10% ES qualificado célula fetal de soro bovino, piruvato de sódio 2 mM, 1% não aminoácidos essenciais, 1% penicilina/estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 100 µM 2- Mercaptoetanol, fator inibitório de leucemia (LIF), 3 µM CHIR99021 e 0,8 µM PD184352) em pratos de gelatina-revestido a 37 ° C e 5% CO2 por 2 dias até atingir uma confluência de 10-20 células de Mio por prato.
Nota: Aqui, LIF foi produzido por transfection transiente de células de 293T HEK, seguido pela coleta de sobrenadante e filtragem. Cada lote de LIF foi testado por seu potencial para manter a pluripotência, mas concentrações não foram determinadas. No entanto, LIF recombinante também está disponível comercialmente e a concentração comumente utilizada para cultura de células de rato ES é de 1000 unidades/mL13. - Revestir uma placa de 96 poços adequada para imagens com 30 µ l de rato recombinante da proteína de Quimera de E-caderina Fc (E-cad-Fc) por alvéolo (5 ng / µ l, diluído em PBS com Ca2 +/ mg2 +. Use concentrações estoque de 100 ng / µ l, armazenado a-80 ° C). Evite pipetagem extensa, como E-cad-Fc é muito frágil. Incube a 37 ° C por 1,5 h.
Nota: Dependendo do microscópio, outros formatos podem ser usados. - Aspire o E-cad-Fc, lave uma vez com 100 µ l de PBS com Ca2 +/ mg2 +e adicionar 100 µ l de meio de cultura de células ES previamente aquecido.
- Lavam-se as células de interesse com 5 mL de PBS sem Ca2 +/ mg2 +. Aspire e adicionar 2 mL de EDTA-tripsina 0,25%. Incubar durante 4 min a 37 ° C. Adicionar 4 mL de meio de cultura celular ES, resuspenda e spin para baixo a 1000 x g, durante 4 min. Aspire o sobrenadante e resuspenda o pellet em 2 mL de meio de cultura celular ES fresco.
Nota: PBS sem Ca2 +/ mg2 + deve ser usado para as células antes tripsinização de lavagem para remover Ca2 + íons, que são necessários para a adesão celular. Em contraste, para a diluição E-cad-Fc e revestimento (etapa 1.4), use o PBS com Ca2 +/ mg2 +, desde a adesão de células ES de E-cad-Fc pratos revestidos é Ca2 +-dependente14. - Dilua a ressuspensão células 01:10 em 1 mL de meio de cultura celular ES e contagem, utilizando uma câmara de contagem (carga 10 µ l para uma câmara de 0,1 mm de profundidade).
- Semente de 30.000 células/cm2 no E-cad-Fc revestido placa de imagem. Encha até 200 µ l por alvéolo com meio de cultura celular ES. Para linhas de célula doxiciclina-inducible, induzir com uma dose apropriada de doxiciclina (otimizar dose e temporização da indução com antecedência. As linhas celulares usadas aqui foram tratadas com doxiciclina de ng/mL 500 24 h antes de imagem). Incubar a 37 ° C e 5% de CO2 e prossiga com o pulso, rotulagem e imagem 24h após a semeadura da célula.
2. pulso rotulagem da SNAP-tag
Nota: Para experimentos de degradação de proteínas é fundamental usar uma adequada concentração de corante SNAP. A concentração deve ser alta o suficiente para produzir um sinal brilhante no início do lapso de tempo, como a fluorescência irá diminuir ao longo do tempo. No entanto, usando concentrações de tintura muito alto pode causar corante residual, sendo deixado no meio ou nas células mesmo após a lavagem. O corante livre posteriormente pode vincular a recém-produzido SNAP-marca moléculas ao longo do filme, que vai distorcer a curva de decaimento. O sinal de fluorescência observado dependerá das propriedades do corante, a linha de celular usado, bem como o nível de expressão da proteína correspondente. Portanto, é fundamental otimizar a concentração de corante, testando diferentes diluições, a partir da diluição sugerida para a imagem latente de célula viva pelo fabricante. Para este estudo, utilizou-se um substrato fluorescente far-red. Uma concentração ideal de 12 nM foi determinada para as linhas de célula de doxiciclina-inducible superexpressão.
- Dilua o corante SNAP na concentração apropriada em meio de cultura de células ES previamente aquecido. Usar uma pipeta para remover suavemente o meio das células previamente semeadas na placa de 96 poços e adicionar 50 μL de tintura SNAP diluída por bem. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
- Aspirar a tintura diluída com uma pipeta e lavar 3x com 200 µ l de PBS pré-aquecido (sem o Ca2 +/ mg2 +). Acrescente 200 µ l de meio de cultura celular ES e incube por 15 min a 37 ° C.
- Repita as etapas anteriores de lavagem mais duas vezes.
Nota: Lavagem extensa é importante a fim de remover qualquer corante não acoplado. As etapas de lavagem repetida com PBS remover a tintura extracellular residual no meio, Considerando que a incubação do 15 min assegurar robusto rotulagem das proteínas de fusão de SNAP-etiqueta antes de iniciar a experiência de imagem. No entanto, execute as etapas de lavagem pipetando suave e não usar um aspirador automático, como células semeadas na E-cad-Fc tendem a separar-se facilmente. - Adicione 200 µ l de meio de imagem. Para reduzir o fundo de fluorescência, utilize meio livre de vermelho de fenol (suplementado com 10% ES qualificado célula fetal de soro bovino, piruvato de sódio 2 mM, 1% não aminoácidos essenciais, 1% penicilina/estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 100 µM 2-Mercaptoetanol, LIF, 3 µM CHIR99021 e 0,8 µM PD184352).
3. Time-Lapse microscopia
- Use um microscópio apropriado para geração de imagens ao vivo, permitindo que a temperatura controlada e CO2. Defina a temperatura de 37 ° C e o CO2 a 5% antes de usar e permitem equilibrar para 1-2 h.
- Coloque o prato no microscópio e encontrar locais adequados para a imagem latente. Selecione os pontos onde as células são uniformemente distribuídas, mas não muito denso, como isso irá facilitar a análise. Ajuste o número de pontos selecionados para o número de células necessárias para a análise. Neste estudo, foram registrados 3-5 pontos por linha celular.
- Selecione o objetivo. Um objectivo X 20 é apropriado para o tamanho de pilhas do ES.
- Selecione as configurações de iluminação para o canal fluorescente (s) a ser gravado. Ajuste a potência do laser e a exposição de acordo com a intensidade do sinal de fluorescência das células de interesse. Certifique-se de obter um forte sinal inicial, uma vez que irá diminuir ao longo do filme, mas evitar os poderes do laser superior a 30% a fim de minimizar a fototoxicidade e fotobranqueamento. Para este estudo, um filtro de excitação de 632/22 nm (comprimento de onda/bandpass), filtro de emissão de 679/34 nm (comprimento de onda/bandpass), poder do laser do tempo de exposição e 10% de 100 ms foram usados.
- Selecione os intervalos e a duração da experiência do tempo-lapso de imagem. Para proteínas com esperado meia-vida de 2-20 h, escolha tempos de aquisição de 12-24 h com intervalos de tempo de 15 min. Para proteínas do cliente, reduza os intervalos e tempos de aquisição, para aumento de proteínas caudais em conformidade.
- Começa a imagem.
4. processamento e análise de imagem
- Recolha as imagens adquiridas como uma pilha no formato tiff. Para análise e tratamento subsequente, use o software de FIJI15. Se os dados de lapso de tempo não são coletados como uma pilha pelo software do microscópio, abrir todos os quadros da experiência do tempo-lapso no software (ou clicando em arquivo | Abrir... ou arrastar e soltar os arquivos correspondentes à barra de ferramentas) e clique em imagem | Pilhas | Imagens de empilhar.
- Use a função de fundo subtrair para remover o fundo de todas as imagens na pilha. Para isso, clique em processo | Subtrair a fundo. Selecione o raio de bola rolando na janela pop-up. Use um raio que é pelo menos o tamanho das células fotografada. Para aplicar a subtração de fundo para todas as células na pilha, selecione Sim no pilha processo? janela pop-up.
- Selecione uma célula de interesse e desenhar uma região de interesse (ROI) em torno dele usando a barra de ferramentas. Para sinais nucleares, use a seleção Oval primeiro clicando na guia correspondente na barra de ferramentas e depois clicando sobre o núcleo de interesse e ajustando o oval em torno dele. Para sinais citoplasmáticos ou regiões muito densas use a seleção à mão livre para ser capaz de acompanhar de perto os contornos da célula. Evite incluindo regiões muito grandes, de fundo, mesmo que não é necessário seguir os contornos de célula precisamente devido a posterior subtração de todos os pixels do fundo (etapa 4.8-4.9).
- Adicione a região de interesse para o Gerenciador de ROI clicando Analyze | Ferramentas | Gerente de ROI | Adicionar, ou com a tecla T no teclado.
- Prosseguir para o próximo quadro movendo a guia na janela pilha ou por pressionando shift + < no teclado, em seguida, repita as ações anteriores. Siga a célula de interesse ao longo do filme e adicionar o ROI de cada frame para o Gerenciador de ROI. Salvar o ROI final definido para cada célula controlada clicando mais | Salve... no Gerenciador de ROI.
Nota: Depois de divisões celulares, rastrear as duas células-filhas separadamente e resumir sua intensidade integrada após subtracção de fundo (ver passos 4.6-4.9) a conta para diluição de proteína durante a divisão celular. Salve os conjuntos ROI para as duas células-filhas. - Uma vez que a célula de interesse é controlada durante todo o filme, clique em medida, para obter valores de intensidade média e a área do ROIs. Copie os valores obtidos em um programa de planilha eletrônica e calcular a intensidade integrada cru da célula para cada ponto de tempo da seguinte maneira:
onde quer dizerca intensidade média eáreaCa área do ROI correspondente. - Para estimar o fundo local, adicione um ROI perto da célula de interesse para cada período de tempo. Evite incluindo qualquer sinal de fluorescência celular. Use um ROI circular que é aproximadamente do tamanho de uma célula e mover ou reduzi-lo em conformidade, se necessário, por exemplo, se as células vizinhas a interferir. Proceda como descrito anteriormente, com o celular ROI em conjunto a fim de obter um ROI de fundo definida e copiar os valores de medida de intensidade para a planilha.
- Para obter um valor de correção de fundo para a intensidade integrada da célula, primeiro Calcule a intensidade integrada do plano de fundo para cada ponto de tempo:
onde quer dizerBG é a intensidade média do sinal de fundo e áreaC é a área do ROI circundando a célula. Não utilize a área do plano de fundo ROI, a menos que ambas as áreas têm o mesmo tamanho. - Calcule a intensidade integrada final subtraído de plano de fundo da célula para cada ponto de tempo:
- Para normalizar as curvas de decaimento de célula única, divida o valor de intensidade de cada ponto do tempo pelo valor do primeiro tempo-ponto de intensidade.
Nota: A curva de ajuste (ver passo 4.11) pode também ser executada em cada célula única ou sobre a média da população. Uma normalização é necessária se uma população com base média é calculada para evitar vieses de intensidades de fluorescência diferentes entre as células. A normalização, assim, garante que cada célula contribui com o mesmo peso para a curva de decaimento final. Além disso, a normalização pode ser útil para visualizar os decaimentos única célula independentemente suas intensidades de fluorescência absoluto (ver Figuras 3A-3C). No entanto, se apenas a meia-vida de célula única é determinado e os dados não é uma média, a etapa de normalização pode ser omitida e a curva de ajuste pode ser executada diretamente em dados brutos. - Para a estimativa do Half-Life da proteína, use uma ferramenta de encaixe de curva. Neste estudo, utilizou-se a curva MATLAB, montagem de ferramentas 3.4.1, que está localizado por padrão na seção de aplicativos de interface de usuário do MATLAB. Importar a intensidade da fluorescência e valores de tempo da planilha eletrônica em MATLAB, clicando na guia Importar dados Abra a caixa de ferramentas de encaixe de curva e selecionar os pontos de tempo e dados de decaimento de fluorescência no dados X e Y de dados Tab. Choose Custom equação no encaixe de curva tab e insira a equação para um decaimento exponencial:
onde f é a intensidade da fluorescência em um determinado ponto de tempo, um a intensidade inicial e b a taxa de decaimento. Nas Opções de ajuste... guia, selecione 0 para o limite de um e b. Os valores estimados para a e b aparecerá na janela de resultados. Calcule a meia-vida da seguinte maneira:
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Representative Results
O protocolo descrito fornece uma estimativa da variabilidade de célula para célula em Half-Life para qualquer proteína dada fundida a um SNAP-tag. O uso de recombinante E-caderina-Fc para o revestimento da placa de imagem permite a resolução única célula em células de ES, que, de outra forma, crescem nas colônias. Células individuais podem ser controladas separadamente ao longo do filme ( figura 1A).
Para determinar a meia-vida de proteína para cada célula única, é crucial medir o sinal de fluorescência SNAP-marca integrado, subtraído de fundo ao longo do tempo ( figura 1B), com Resumindo as intensidades integradas de duas células-filhas em caso de divisões. Isso resulta em uma curva de decaimento exponencial para cada célula, da qual a taxa de decaimento e, portanto, a meia-vida podem ser extraídos por curva de montagem ( Figura 1). Importante, se uma curva de decaimento médio é calculada, os vestígios de célula única devem ser normalizados para o primeiro quadro para garantir que cada célula tem o mesmo peso na média, apesar de putativos diferenças na intensidade de fluorescência inicial entre as células.
A concentração do corante adequado depende do tipo de corante e linha celular usado e assim deve ser otimizada para cada experimento. Para ilustrar isso, a Figura 2 mostra as curvas de decaimento de diferentes concentrações do substrato fluorescente far-red usado para todas as experiências mostradas aqui, testadas em uma linhagem de células de fusão do inducible SNAP-marca do doxiciclina. Uma concentração inicial de tintura de 3 µM foi escolhida de acordo com as instruções do fabricante e realizou-se uma diluição serial de 1:3 até atingir uma concentração de 1,4 nM. Para as duas concentrações mais elevadas o sinal não diminui, Considerando que a decadência observada é exponencial para concentrações abaixo 111 nM. Uma concentração ideal de 12 nM de corante foi escolhido para novas experiências, que é garantir quantidades mínimas de corante residual deixada no meio após a lavagem, mas o sinal foi ainda é brilhante o suficiente para observar clara decadência curvas para uma variedade de doxiciclina inducible linha de celular.
Figuras 3A - 3C mostrar resultados representativos, incluindo os decaimentos de célula única e médias da população, para 3 proteínas com semi-vida média diferentes: a pluripotência associado a factores de transcrição Nanog (média Half-Life h 2,9) e Oct4 (média Half-Life: 4,8 h) e o processamento de pre-mRNA viveu muito mais tempo que fator Srsf11 (média Half-Life 25,3 h). Os boxplots ( Figura 3D) representam a meia-vida, obtido a partir das curvas de decaimento única célula por encaixe de curva e ilustrar a heterogeneidade de meias-vidas para as três proteínas.
Figura 1 : Aquisição de lapso de tempo e análise
R: a série de imagens representativas, mostrando o decaimento de fluorescência em células de pulso rotulado com tintura SNAP. Linha de célula: doxiciclina inducible TRE3G-Oct4-SNAPtag, induzida com 500 doxiciclina ng/mL 7 h antes de imagem.
B: filme análise e cálculo de intensidade integrada. Euc: integrado intensidade da célula, euBG: integrado a intensidade do fundo, euC-BG: correção de fundo integrado intensidade.
C: encaixe de curva exponencial realizada em MATLAB. Exemplo de rastreamento de decadência uma única célula, o ajuste correspondente e as estimativas resultantes para os parâmetros de decadência um e b. O Half-Life é calculado da seguinte forma: t1/2 = ln (2) / b. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Otimização da concentração de corante.
Decaimento de fluorescência do pulso de células rotulado com concentrações diferentes de tintura SNAP. Realizou-se uma diluição serial do corante a partir de 3 µM. Os traços são as médias de 5 células cada, normalizada para o primeiro quadro e controladas para 12 h. linha celular: doxiciclina inducible TRE3G-sfGFP-mOrange2-SNAPtag-Praga, induzida com 500 doxiciclina ng/mL 24 h antes de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Única variabilidade celular de meias-vidas para proteínas diferentes candidato SNAP-tag.
A-c: Decaimentos de célula única (luz azul) e as médias de população (azul escuro) para doxiciclina inducible Nanog, Oct4 e Srsf11-SNAP-tag proteínas da fusão.
D: meia-vida de células individuais, que foram calculadas pela curva exponencial, cabendo para cada célula única. Os boxplots são exibidos na escala de2 log. As caixas de exibir o intervalo interquartil (IQR), a linha preta indica a mediana. Os bigodes representam os valores mínimos e máximos, excluindo os outliers (pontos pretos), que são definidos como valores, desviando-se mais de 1,5 x a partir do IQR. N = 20 células cada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A etapa mais crucial quando usando um SNAP-tag para monitorar a deterioração de proteína é garantir que nenhuma tintura desacoplada residual é deixada no meio ou nas células após a lavagem, caso contrário pode vincular recém produzido moléculas SNAP-marca mais tarde durante o experimento e ther Eby comprometer a curva de decaimento. Isto é por um lado, alcançado realizando cuidadosamente todas as etapas de lavagem descritas. Por outro lado, a concentração de corante deve ser mantida tão baixa quanto possível, estando ainda em uma escala que permite a obtenção de um bom sinal à relação de ruído. Como mostrado na Figura 2, a concentração de corante deve ser otimizada para cada experimento testando diferentes diluições. No nosso caso, as linhas de célula inducible doxiciclina têm níveis de expressão relativamente elevada, permitindo assim usar uma concentração baixa de tintura.
Este protocolo descreve uma abordagem geral para quantificar a degradação de proteínas em células únicas por imagens de fluorescência de lapso de tempo e vários aspectos do protocolo podem ser modificados, dependendo das condições experimentais e o objetivo do correspondente experimento. Degradação proteica principalmente segue um decaimento exponencial de ordem primeiro. Para a proteína se decompõe mostrado aqui, os valores2 R os ajustes foram bastante elevados (0.95-0,99) e usando multi-exponenciais não melhorou significativamente os ajustes. No entanto, se não satisfatórias, os resultados obtidos de ajustes exponenciais simples encaixe multi-exponenciais pode ser considerado, o que implicaria a existência de várias subpopulações de proteína rotulado decaindo com taxas diferentes. Além disso, nosso pipeline de análise de imagem envolve substancial trabalho manual, que só é viável se um número limitado de células é analisado. Para os números mais altos de células, uma abordagem mais automatizada deve ser considerada. Diversas ferramentas automatizadas foram desenvolvidas nos últimos anos, que permitem a segmentação e acompanhamento de um número maior de células16,17. No entanto, o movimento das células e frequentes divisões celulares é desafiadores e propenso a causar erros de segmentação. Além disso, quando a imagem se deteriora de proteína, o sinal de fluorescência irá diminuir ao longo do tempo, dificultando ainda mais a seleção de um limiar de segmentação. Assim, ferramentas de rastreamento deve ser cuidadosamente testado antes de ser implementado para este protocolo, como erros de segmentação podem distorcer os dados consideravelmente. Além disso, um método de subtração de fundo diferentes pode ser considerado, dependendo da qualidade das imagens adquiridas. Aqui usamos a correção de bola rolando de FIJI, que é adequada para imagens uniformemente iluminadas com células bastante escassamente semeadas. No entanto, especialmente se imagens sofrem de iluminação desigual, métodos de subtração de fundo mais especializados podem ser aplicada18,19.
Uma limitação à nossa abordagem é a duração das gravações lapso de tempo que pode ser analisado. Para proteínas relativamente curta duração, um tempo de aquisição de cerca de 12 h é suficiente. Para caudais proteínas, como por exemplo Srsf11, é possível realizar um encaixe em um intervalo de tempo de 12 h de curva. No entanto, é importante manter em mente que o fits exponencial pode ser menos preciso para proteínas caudais, para o qual o tempo de aquisição e os intervalos de imagem devem ser aumentados. Se células de ciclagem rápidas estão sendo fotografadas, tempos de aquisição mais irão complicar a análise, devido ao aumento do número de células-filhas para ser analisado. Novamente, neste caso, um pipeline mais automatizado de análise pode ser útil. Além disso, quando usando proteínas da fusão SNAP-etiqueta para determinar as taxas de decomposição de proteínas, a possibilidade da SNAP-tag alterando o Half-Life da proteína endógena deve ser considerada. No caso de linhas celulares usadas aqui não vemos nenhuma evidência para tais efeitos, como o determinado meia-vida de Oct4 e Nanog perto corresponde valores publicados3,20,21,22. A regra mais um efeito da SNAP-tag na degradação de proteínas, especialmente quando não há dados sobre Half-Life são disponíveis, uma opção seria para bloquear a síntese de proteínas cicloheximida e realizar borrões ocidentais em pontos diferentes do tempo usando um anticorpo Reconhecendo a proteína endógena e comparar diretamente a decadência da proteína do candidato SNAP-marcados com a versão endógena não marcada.
Mais dados previamente publicados em Half-Life da proteína baseia-se em experimentos de bioquímica em massa, principalmente de tempo-curso ocidental do borrão experiências mediante inibição da síntese de proteínas por cicloheximida. No entanto, esta abordagem não fornece resolução de célula única, e a sua resolução temporal é baixa devido ao número limitado de pontos de tempo que podem ser tomadas em conta. Em contraste, a nossa abordagem de célula única não requer o uso de inibidores da síntese de proteína e pode identificar a célula a célula variabilidade nas taxas de degradação de proteínas. Também permite identificar potenciais subpopulações de células com meias-vidas diferentes, o que pode ser particularmente interessante para a investigação de proteínas expressas forma heterogénea. Uma vantagem adicional do nosso método é a possibilidade de in silico sincronizar as células e, portanto, monitorar mudanças transientes em Half-Life, por exemplo, ao longo do ciclo celular. No entanto, a tecnologia de SNAP-tag requer a geração de uma linhagem de células de SNAP-tag correspondente, que pode ser a sua grande desvantagem. Importante, nossa abordagem também pode ser aplicada a proteínas endogenamente marcou9. Como mencionado acima, que não observamos qualquer evidência da SNAP-tag alterando o Half-Life da proteína endógena para as proteínas que estudamos, sugerindo que a precisão da abordagem SNAP-marca é na mesma faixa como outros métodos.
O método apresentado aqui será útil para várias aplicações. Mais importante ainda, ele fornece a opção de estudar a variabilidade de célula para célula em meias-vidas para qualquer proteína de fusão SNAP-marca de interesse. Existem várias outras marcas disponíveis (como o clipe marca23 ou o Halo-marca24) cujo princípio de funcionamento é o mesmo. Pulso, rotulagem e lavagem do corante residual conduzirá a uma curva de decaimento, que permite determinar o Half-Life da proteína, enquanto deixando o corante no meio (no caso de um ligante que é não-fluorescente a menos vinculado à marca de) permite que a imagem a longo prazo de uma proteína de interesse. Devido a grande seleção de ligands fluorescentes disponíveis, a SNAP-tag pode assim ser combinada com outras tags ou com várias outras moléculas fluorescente etiquetadas, permitindo a aplicação da técnica em diversos contextos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
No Biomolecular triagem Facility (BSF), EPFL, foram realizados experimentos de microscopia de lapso de tempo. Agradecemos a Marc Delachaux (serviço audiovisual, EPFL) para a produção de vídeo e edição do filme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | - | - | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | - | - | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | - | - | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | - | |
| Microsoft Excel | Microsoft | - |
References
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
- Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
- Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
- Bojkowska, K., et al.
- Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
- Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).
- Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
- Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
- Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).
- Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
- Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
- Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
- Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
