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Developmental Biology

अनुयाई सेल कल्चर में समय-चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन ह्रास दरों की एकल-कोशिका ठहराव

Published: February 4, 2018 doi: 10.3791/56604
Automatic Translation
1, 1
1UPSUTER, Institute of Bioengineering (IBI), School of Life Sciences, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विधि प्रोटीन आधा निर्धारित करने के लिए एक जीवित अनुयाई कोशिकाओं में रहता है, नाड़ी लेबलिंग और स्नैप-टैग फ्यूजन प्रोटीन के प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग का उपयोग कर ।

Abstract

प्रोटीन संश्लेषण और क्षरण की एक गतिशील स्थिति में हैं और उनके आधे जीवन विभिन्न परिस्थितियों के तहत समायोजित किया जा सकता है । हालांकि, सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण प्रोटीन आधा जीवन निर्धारित करने के लिए या तो लीजड कोशिकाओं से जनसंख्या औसत तक ही सीमित है या प्रोटीन संश्लेषण अवरोधकों के उपयोग की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल एक विधि को मापने के लिए प्रोटीन आधा एकल जीवन अनुयाई कोशिकाओं में रहता है, स्नैप-टैग फ्यूजन प्रोटीन के साथ संयोजन में प्रतिदीप्ति समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने का वर्णन करता है । ब्याज की कोई प्रोटीन एक तस्वीर से जुड़े-टैग एक फ्लोरोसेंट, सेल पारगंय डाई कि एक benzylguanine व्युत्पंन के लिए युग्मित है, और लेबल प्रोटीन आबादी के क्षय से बंधे covalently जा सकता है अवशिष्ट डाई के वॉशआउट के बाद निगरानी की जा सकती है । बाद में सेल ट्रैकिंग और ठहराव एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता के समय पर प्रत्येक ट्रैक सेल के लिए एक घातीय क्षय वक्र में परिणाम, वक्र फिटिंग द्वारा एकल कोशिकाओं में प्रोटीन गिरावट दर का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है । यह विधि कल्चरल कोशिकाओं की जनसंख्या में आधे जीवन के विविधता के लिए एक अनुमान प्रदान करती है, जिसे अन्य विधियों द्वारा आसानी से नहीं आंका जा सकता है । दृष्टिकोण यहां प्रस्तुत की संस्कृति अनुयाई एक स्नैप-टैग से जुड़े ब्याज की एक प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के किसी भी प्रकार के लिए लागू है । यहां हम माउस भ्रूण स्टेम का उपयोग करें (ES) E-cadherin-लेपित सेल संस्कृति प्लेटों पर हो कोशिकाओं को वर्णन कैसे आधा जीवन की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ प्रोटीन के एक सेल गिरावट दर निर्धारित किया जा सकता है ।

Introduction

यह सर्वविदित है कि सेलुलर प्रोटीन एक प्रोटीन और शारीरिक विनियमन के अधीन के लिए विशिष्ट किया जा रहा संश्लेषण और गिरावट दरों के साथ, व्यापक कारोबार से गुजरना है । परंपरागत रूप से, प्रोटीन क्षरण दरों ऐसे रेडियोधर्मी पल्स चेस विश्लेषण के रूप में थोक तरीकों, का उपयोग कर मापा गया है, या cycloheximide1के रूप में प्रोटीन संश्लेषण अवरोधों को शामिल. हाल ही में, स्थिर आइसोटोप मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में सेल संस्कृति (SILAC) में अमीनो एसिड के साथ लेबलिंग एक वैश्विक स्तर पर प्रोटीन कारोबार के लिए स्थापित किया गया है2. हालांकि, इन पद्धतियों जनसंख्या औसत द्वारा सीमित हैं, और कक्ष-से-कक्ष परिवर्तनशीलता के बारे में जानकारी इसलिए खो जाती है । इसके अलावा, प्रोटीन क्षरण में परिवर्तनीय परिवर्तन है कि सेल की आबादी के पार अनसिंक्रनाइज़ कर रहे है पहचाना नहीं जा सकता ।

वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन आधा जीवन भी प्रतिदीप्ति आधारित दृष्टिकोण है, जो अक्सर एकल सेल संकल्प प्रदान करने का लाभ है द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक photoactivatable ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (paGFP) के लिए Oct4 आधा जल्दी स्तनधारी भ्रूण में जीवन का निर्धारण किया गया है3। एक अंय विधि रहने वाले कोशिकाओं में प्रोटीन क्षय की निगरानी करने के लिए एक स्नैप-प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग के साथ संयोजन में टैग का उपयोग है । तस्वीर टैग डीएनए की मरंमत एंजाइम ओ6-alkylguanine डीएनए-alkyltransferase (AGT) है कि विशेष रूप से benzylguanine (BG) डेरिवेटिव है, जो आणविक जांच करने के लिए युग्मित किया जा सकता है के साथ प्रतिक्रिया के एक उत्परिवर्ती संस्करण है4,5, 6. इसलिए, किसी भी स्नैप-टैग फ्यूजन प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट, सेल पारगंय डाई के साथ लेबल अचल जा सकता है । पल्स ब्याज की एक प्रोटीन के लेबल स्नैप-टैग से जुड़े, अवशिष्ट डाई के वॉशआउट द्वारा पीछा किया, लेबल प्रोटीन जनसंख्या के क्षरण की निगरानी के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार प्रोटीन आधा जीवन निर्धारित करने के लिए । स्नैप-टैग सफलतापूर्वक प्रोटीन का पीछा लेबलिंग और अनुयाई सेल संस्कृति में प्रोटीन आधा जीवन का निर्धारण करने के लिए और vivo में5,7,8,9के लिए इस्तेमाल किया गया है । स्नैप-टैग के एक विशाल विविधता आमतौर पर फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रा इस्तेमाल को कवर सब्सट्रेट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, प्रत्येक विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए इष्टतम डाई के चयन को सक्षम करने से । इस प्रकार, स्नैप-टैग भी बहुरंगा इमेजिंग के लिए अन्य फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन या रंजक के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है. कोशिका-अभेद्य रंजक झिल्ली-tethered प्रोटीन के लेबल के लिए उपयुक्त हैं, जबकि कोशिका-पारगंय रंजक दोनों intracellular और झिल्ली से बंधे प्रोटीन की निगरानी के लिए लागू कर रहे हैं । इसके अलावा, इन जांच के कुछ लगभग कोई बेसल प्रतिदीप्ति प्रदर्शन और केवल एक तस्वीर के लिए बाध्यकारी पर एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत उत्सर्जन शुरू-10टैग ।

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक स्नैप-टैग का उपयोग कर एकल कोशिकाओं में ब्याज की विभिंन प्रोटीन की गिरावट दर को मापने के लिए । यहाँ हम माउस भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं ई-cadherin पर कल्चरित करने के लिए इस विधि लागू करते हैं, लेकिन यह किसी भी अनुयाई कल्चरल सेल प्रकार के साथ उपयोग करने के लिए संभव होना चाहिए. हम बताते हैं कि पल्स लेबलिंग स्नैप-टैग फ्यूजन प्रोटीन के बाद प्रतिदीप्ति समय-चूक इमेजिंग की अनुमति देता है एकल सेल आधे का निर्धारण करने के लिए ब्याज की विभिन्न प्रोटीन के जीवन और सेल के लिए एक अनुमान प्रदान करता है-कोशिका में आधा जीवन की परिवर्तनशीलता कल्चरल कोशिकाओं की जनसंख्या.

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Protocol

नोट: इस अध् ययन में E14 ES सेल लाइन का इस् तेमाल किया गया । हालांकि, इस प्रोटोकॉल सीधे किसी अंय माउस ES सेल लाइन के लिए लागू ब्याज की एक प्रोटीन एक स्नैप-टैग से जुड़े हुए, या तो अंतर्जात प्रोटीन टैगिंग द्वारा या एक्सप्रेस का उपयोग करके व्यक्त कर रहा है । परिणाम अनुभाग में दिखाए गए उदाहरणों के लिए, doxycycline-inducible स्नैप-टैग फ्यूजन सेल लाइनों का इस्तेमाल किया गया (स्नैप-टैग निम्नलिखित प्रोटीन से जुड़े: Nanog, Oct4, Srsf11, या फ्लोरोसेंट प्रोटीन mOrange2 और sfGFP के लिए, और एक के नियंत्रण में डाल doxycycline-inducible प्रवर्तक. doxycycline-inducible स्नैप-टैग फ्यूजन सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया plasmids पर अधिक जानकारी के लिए11 देखें). doxycycline-inducible प्रणाली विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है, क्योंकि यह कसकर समय और ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति की तीव्रता को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है । सी-टर्मिनल स्नैप-टैग की स्थिति की सिफारिश की है, के रूप में एन टर्मिनल एमिनो एसिड अनुक्रम बदलने के लिए लक्ष्य प्रोटीन के आधे जीवन में परिवर्तन की संभावना है (n-अंत नियम12) ।

1. ई-cadherin कोटिंग और सेल सीडिंग

  1. स्नैप-टैग4से जुड़े हुए रुचि के प्रोटीन को व्यक्त करने वाली एक ES सेल लाइन जेनरेट करें ।
  2. कोट १०० ०.१% जिलेटिन की 4 मिलीलीटर के साथ मिमी सेल संस्कृति बर्तन (फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) Ca के बिना2 +/Mg2 +1 एच के लिए) में पतला । जिलेटिन निकालें और 1 घंटे के लिए सूखे चलो तुरंत उपयोग या 2 महीने तक के लिए लेपित व्यंजन की दुकान ।
  3. es सेल संस्कृति माध्यम में ब्याज की सेल लाइन बढ़ो (ग्लासगो ंयूनतम आवश्यक माध्यम, 10% ES सेल के साथ पूरक-योग्य भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, 2 मिमी एल-glutamine, १०० µ एम 2- mercaptoethanol, ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ), 3 µ मीटर CHIR99021 और ०.८ µ मीटर PD184352) पर जिलेटिन लेपित व्यंजन पर ३७ ° c और 5% सह 2 दिनों के लिए2 जब तक पकवान प्रति 10-20 Mio कोशिकाओं का संगम तक पहुंचने ।
    नोट: यहाँ, लिफ HEK 293T कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा उत्पादित किया गया था, supernatant संग्रह और फ़िल्टरिंग के बाद. लिफ के प्रत्येक बैच pluripotency बनाए रखने के लिए अपनी क्षमता के लिए परीक्षण किया गया था, लेकिन सांद्रता निर्धारित नहीं किया गया । हालांकि, संयोजक लिफ भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और एकाग्रता सामांयतः माउस ES सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया है १००० इकाइयों/
  4. कोट एक ९६-खैर प्लेट संयोजक माउस ई के 30 µ एल के साथ इमेजिंग के लिए उपयुक्त-cadherin एफसी कल्पना प्रोटीन (ई सीएडी-एफसी) अच्छी तरह से (5 एनजी/µ एल, के साथ पंजाब में पतला सीए2 +/Mg2 +। १०० एनजी/µ एल के शेयर सांद्रता का प्रयोग करें,-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित) । व्यापक pipetting से बचें, के रूप में ई सीएडी-एफसी बहुत नाजुक है । १.५ एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    नोट: माइक्रोस्कोप पर निर्भर करता है, अन्य प्रारूपों इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. महाप्राण E-सीएडी-एफसी, सीए के साथ १०० µ एल के साथ एक बार धो लें2 +/Mg2 +, और जोड़ें १०० µ एल के पूर्व गर्म ES सेल संस्कृति माध्यम ।
  6. सीए2 +/Mg2 +के बिना पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ ब्याज की कोशिकाओं को धो लें । महाप्राण और Trypsin-EDTA ०.२५% की 2 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए मशीन । es सेल संस्कृति माध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें, reसस्पेंड और 4 मिनट के लिए १००० x g पर नीचे स्पिन महाप्राण supernatant और ताजा ES सेल संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
    ध्यान दें: पंजाब सीए के बिना2 +/Mg2 + trypsinization से पहले कोशिकाओं को धोने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ताकि सीए2 + आयनों, जो सेल आसंजन के लिए आवश्यक है को दूर करने के लिए । इसके विपरीत, ई के लिए-सीएडी-एफसी कमजोर पड़ने और कोटिंग (कदम १.४), ca के साथ पंजाबियों का उपयोग करें2 +/Mg2 +, के बाद से ES कोशिकाओं के आसंजन E-सीएडी-एफसी लेपित व्यंजन है ca2 +-निर्भर14।
  7. ES सेल संस्कृति मध्यम और गिनती के 1 मिलीलीटर में reसस्पैंड कोशिकाओं 1:10 पतला, एक मतगणना कक्ष का उपयोग (०.१ मिमी गहराई के एक चैंबर के लिए 10 µ एल लोड) ।
  8. ई-सीएडी-एफसी लेपित इमेजिंग प्लेट में बीज ३०,००० कोशिकाओं/2 । ES सेल संस्कृति माध्यम के साथ अच्छी तरह से प्रति २०० µ एल तक भरें । doxycycline-inducible सेल लाइनों के लिए, doxycycline की एक उचित खुराक के साथ प्रेरित (खुराक और अग्रिम में प्रेरण के समय का अनुकूलन । यहां इस्तेमाल सेल लाइनों इमेजिंग से पहले ५०० एनजी/एमएल doxycycline 24 एच के साथ इलाज किया गया) । ३७ ° c और 5% CO2 पर मशीन और सेल सीडिंग के बाद पल्स लेबलिंग और इमेजिंग 24 एच के साथ आगे बढ़ें ।

2. स्नैप-टैग की पल्स लेबलिंग

नोट: प्रोटीन क्षय प्रयोगों के लिए यह एक पर्याप्त तस्वीर डाई एकाग्रता का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । एकाग्रता समय-चूक की शुरुआत में एक उज्जवल संकेत उपज के लिए पर्याप्त उच्च होना चाहिए, के रूप में प्रतिदीप्ति समय के साथ कम हो जाएगा । हालांकि, भी उच्च डाई सांद्रता का उपयोग अवशिष्ट डाई मध्यम में या कोशिकाओं में भी धोने के बाद छोड़ दिया जा रहा है हो सकता है । नि: शुल्क डाई बाद नए उत्पादन स्नैप-फिल्म के पाठ्यक्रम पर अणुओं टैग, जो क्षय वक्र विकृत होगा के लिए बाध्य हो सकता है । मनाया प्रतिदीप्ति संकेत डाई के गुणों पर निर्भर करेगा, सेल लाइन का इस्तेमाल किया, साथ ही इसी प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्तर । इसलिए, यह अलग कमजोर पड़ने का परीक्षण करके डाई एकाग्रता का अनुकूलन महत्वपूर्ण है, कमजोर पड़ने से शुरू निर्माता द्वारा लाइव सेल इमेजिंग के लिए सुझाव दिया । इस अध्ययन के लिए, एक दूर लाल फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट इस्तेमाल किया गया था । 12 एनएम के एक इष्टतम एकाग्रता doxycycline-inducible एक्सप्रेस सेल लाइनों के लिए निर्धारित किया गया था ।

  1. पूर्व गर्म ES सेल संस्कृति माध्यम में उचित एकाग्रता के लिए स्नैप डाई पतला । एक पिपेट का प्रयोग करें धीरे पहले ९६-अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं से मध्यम निकालने के लिए और अच्छी तरह से प्रति पतला तस्वीर डाई के ५० µ एल जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  2. महाप्राण एक पिपेट के साथ पतला रंग और पूर्व के २०० µ एल के साथ 3x धो-गरम पंजाब (Ca के बिना2 +/Mg2 +) । ES सेल संस्कृति माध्यम के २०० µ एल जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
  3. पिछले धुलाई चरणों को दो बार दोहराएं ।
    नोट: व्यापक धोने के क्रम में किसी भी असीम डाई को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है । पंजाब के साथ दोहराया गया धुलाई कदम मध्यम में अवशिष्ट extracellular डाई को दूर, जबकि 15 मिनट की गर्मी के लिए तस्वीर की मजबूत लेबलिंग-टैग फ्यूजन प्रोटीन इमेजिंग प्रयोग शुरू करने से पहले सुनिश्चित करते हैं । हालांकि, कोमल pipetting द्वारा धोने कदम प्रदर्शन और एक स्वत: aspirator का उपयोग नहीं करते हैं, के रूप में कोशिकाओं ई पर वरीयता प्राप्त सीएडी-एफसी को आसानी से अलग करते हैं ।
  4. इमेजिंग माध्यम के २०० µ एल जोड़ें । प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, phenol लाल मुक्त माध्यम का उपयोग करें (10% ES सेल योग्य भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, 2 मिमी एल-glutamine, १०० µ एम 2-mercaptoethanol, लिफ, 3 µ मीटर के साथ पूरक CHIR99021 व ०.८ µ m PD184352).

3. समय चूक माइक्रोस्कोपी

  1. लाइव इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक खुर्दबीन का प्रयोग करें, तापमान और सह2नियंत्रित की अनुमति । ३७ ° c के लिए तापमान और सह2 को 5% से पहले उपयोग करने के लिए सेट करें और 1-2 h के लिए equilibrate करने की अनुमति दें ।
  2. माइक्रोस्कोप में प्लेट प्लेस और इमेजिंग के लिए उपयुक्त धब्बे पाते हैं । स्पॉट का चयन करें जहां कोशिकाओं को समान रूप से वितरित कर रहे हैं, लेकिन बहुत घने नहीं, के रूप में यह विश्लेषण की सुविधा होगी । चयनित स्थानों की संख्या को विश्लेषण के लिए आवश्यक कक्षों की संख्या में समायोजित करें । इस अध्ययन में सेल लाइन के अनुसार 3-5 स्पॉट रिकॉर्ड किए गए ।
  3. उद्देश्य का चयन करें । ES कोशिकाओं के आकार के लिए एक 20X उद्देश्य उपयुक्त है ।
  4. फ्लोरोसेंट चैनल (ओं) के लिए दीप्ति सेटिंग्स का चयन करने के लिए दर्ज किया जाएगा । ब्याज की कोशिकाओं से प्रतिदीप्ति संकेत की तीव्रता के अनुसार लेजर शक्ति और जोखिम को समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि एक मजबूत प्रारंभिक संकेत प्राप्त करने के लिए, क्योंकि यह फिल्म के पाठ्यक्रम पर कम हो जाएगा, लेकिन लेजर शक्तियों से अधिक 30% से बचने के क्रम में phototoxicity और photobleaching को कम करने के लिए । इस अध्ययन के लिए, 632/22 एनएम के एक उत्तेजना फिल्टर (तरंग दैर्ध्य bandpass), 679/34 एनएम के उत्सर्जन फिल्टर (तरंग दैर्ध्य/bandpass), 10% और १०० ms के जोखिम समय के लेजर शक्ति का इस्तेमाल किया गया ।
  5. इमेजिंग अंतराल और समय-चूक प्रयोग की अवधि का चयन करें । 2-20 एच के आधे जीवन की उंमीद के साथ प्रोटीन के लिए, 15 मिनट के समय अंतराल के साथ 12-24 एच के अधिग्रहण के समय चुनें । कम रहने वाले प्रोटीन के लिए, अंतराल और अधिग्रहण के समय को कम, के लिए लंबे समय तक रहने वाले प्रोटीन तदनुसार वृद्धि ।
  6. इमेजिंग प्रारंभ करें ।

4. छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण

  1. अधिग्रहीत छवियों tiff स्वरूप में एक स्टैक के रूप में एकत्रित करें । आगे की प्रक्रिया और विश्लेषण के लिए, फिजी सॉफ्टवेयर15का उपयोग करें । यदि समय चूक डेटा एक ढेर के रूप में माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर द्वारा एकत्र नहीं है, सॉफ्टवेयर में समय चूक प्रयोग के सभी फ्रेम (या तो फ़ाइल क्लिक करके खोलें । खोलें... या संबंधित फ़ाइलों को उपकरण पट्टी पर खींचें और छोड़े) और छवि क्लिक करें । पोट | चित्र स्टैक करने के लिए।
  2. स्टैक में सभी चित्रों से पृष्ठभूमि को निकालने के लिए पृष्ठभूमि घटाना फ़ंक्शन का उपयोग करें । ऐसा करने के लिए, प्रक्रिया क्लिक करें । पृष्ठभूमि घटाना। पॉप-अप विंडो में रोलिंग बॉल त्रिज्या का चयन करें । एक त्रिज्या का उपयोग करें जो कम से कम कक्षों के आकार को imaged है । स्टैक में सभी कक्षों पर पृष्ठभूमि घटाव लागू करने के लिए, प्रक्रिया स्टैक में हां का चयन करें? पॉप-अप विंडो ।
  3. रुचि के किसी कक्ष का चयन करें और उपकरण पट्टी का उपयोग करके उसके आस-पास ब्याज का क्षेत्र (ROI) बनाएं । नाभिकीय संकेतों के लिए, टूलबार में इसी टैब पर पहले क्लिक करके और फिर ब्याज के नाभिक पर क्लिक करके और उसके चारों ओर अंडाकार को एडजस्ट करके अंडाकार चयन का उपयोग करें । cytoplasmic संकेतों या बहुत घने क्षेत्रों के लिए मुक्तहस्त चयन का उपयोग करने के लिए बारीकी से सेल रूपरेखा का पालन करने में सक्षम हो । पृष्ठभूमि के बहुत बड़े क्षेत्रों सहित से बचें, भले ही यह आवश्यक नहीं है सेल की रूपरेखा का पालन करने के लिए ठीक बाद में सभी पृष्ठभूमि पिक्सेल के बाद घटाव (चरण ४.८-४.९) ।
  4. ब्याज का क्षेत्र जोड़ें पर क्लिक करके रॉय प्रबंधक के लिए विश्लेषण । उपकरण । रॉय प्रबंधक । जोड़ें, या कुंजीपटल पर T दबाकर ।
  5. टैब को स्टैक विंडो में ले जाकर या कुंजीपटल पर shift + < दबाकर अगली फ़्रेम पर जाएं, फिर पिछले क्रियाएं दोहराएं । फिल्म के पाठ्यक्रम में ब्याज की सेल का पालन करें और रॉय प्रबंधक को प्रत्येक फ्रेम के रॉय जोड़ें । अधिक क्लिक करके प्रत्येक ट्रैक किए गए कक्ष के लिए अंतिम ROI सेट सहेजें । रॉय प्रबंधक में सहेजें.. ।
    नोट: सेल डिवीजनों के बाद, दोनों बेटी कोशिकाओं को अलग से ट्रैक और पृष्ठभूमि घटाव के बाद उनके एकीकृत तीव्रता राशि (कदम ४.६-४.९) सेल विभाजन के दौरान प्रोटीन कमजोर पड़ने के लिए खाते में देखें । दोनों बेटी कोशिकाओं के लिए रॉय सेट सहेजें ।
  6. एक बार जब ब्याज की सेल पूरी फिल्म में नज़र आई, तो मापक्लिक करें, माध्य तीव्रता और ROIs के क्षेत्र के लिए मान प्राप्त करने के लिए । एक इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में प्राप्त मूल्यों की प्रतिलिपि बनाएँ और प्रत्येक समय बिंदु के लिए सेल के कच्चे एकीकृत तीव्रता के रूप में इस प्रकार की गणना:
    Equation 1
    कहां मतलब हैगमतलब तीव्रताऔरक्षेत्रसीइसी रॉय के क्षेत्र है ।
  7. स्थानीय पृष्ठभूमि का अनुमान लगाने के लिए, प्रत्येक समय सीमा के लिए ब्याज की सेल के करीब ROI जोड़ें. किसी भी सेलुलर प्रतिदीप्ति संकेत सहित बचो । एक परिपत्र रॉय का प्रयोग करें कि मोटे तौर पर एक सेल के आकार और चाल है या यह सिकुड़ते अगर जरूरत है, उदाहरण के लिए यदि पड़ोसी कोशिकाओं हस्तक्षेप । आगे के रूप में सेलुलर रॉय सेट के लिए एक पृष्ठभूमि रॉय प्राप्त करने के लिए सेट और स्प्रेडशीट के लिए मापा तीव्रता मूल्यों की नकल के साथ पहले वर्णित ।
  8. कक्ष की एकीकृत तीव्रता के लिए एक पृष्ठभूमि-सही मान प्राप्त करने के लिए, पहले प्रत्येक समय-बिंदु के लिए पृष्ठभूमि की एकीकृत तीव्रता की गणना करें:
    Equation 2
    जहां मतलब हैबीजी पृष्ठभूमि संकेत और क्षेत्रसी के मतलब तीव्रता है रॉय के क्षेत्र में सेल घेरना है । पृष्ठभूमि रॉय के क्षेत्र का उपयोग न करें, जब तक दोनों क्षेत्रों में एक ही आकार है ।
  9. प्रत्येक समय बिंदु के लिए कक्ष की अंतिम पृष्ठभूमि-घटाई गई एकीकृत तीव्रता परिकलित करें:
    Equation 3
  10. एक कोशिका क्षय curves को सामान्य करने के लिए, पहली बार बिंदु की तीव्रता मान द्वारा प्रत्येक समय बिंदु की तीव्रता मान विभाजित.
    नोट: वक्र फिटिंग (चरण ४.११ देखें) या तो प्रत्येक एकल कक्ष पर या जनसंख्या औसत पर किया जा सकता है । यदि एक जनसंख्या आधारित औसत की गणना की जाती है ताकि कोशिकाओं के बीच विभिन्न प्रतिदीप्ति तीव्रता से पक्षपात से बचने के लिए एक सामान्यता की आवश्यकता है । सामांयीकरण इस प्रकार सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक कोशिका अंतिम क्षय वक्र के लिए एक ही वजन के साथ योगदान देता है । इसके अलावा, सामान्यता एक कोशिका क्षय अपने निरपेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता के स्वतंत्र रूप से कल्पना करने के लिए उपयोगी हो सकता है ( 3 ए-3सी के आंकड़े देखें). हालांकि, केवल एकल-कक्ष अर्ध-जीवन निर्धारित होते हैं और डेटा औसत नहीं है, तो सामान्यीकरण चरण छोड़ा जा सकता है और वक्र फिटिंग सीधे अपुष्ट डेटा पर किया जा सकता है ।
  11. प्रोटीन आधा जीवन के आकलन के लिए, एक वक्र फिटिंग उपकरण का उपयोग करें । इस अध्ययन में, MATLAB वक्र फिटिंग toolbox 3.4.1 इस्तेमाल किया गया था, जो MATLAB यूजर इंटरफेस के Apps अनुभाग में डिफ़ॉल्ट रूप से स्थित है । डेटा आयात करें टैब पर क्लिक करके MATLAB में इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट से प्रतिदीप्ति तीव्रता और समय मानों को आयात करें । वक्र फिटिंग toolbox खोलें और समय अंक और प्रतिदीप्ति क्षय डेटा का चयन X डेटा और Y में डेटा टैब वक्र फिटिंग टैब में कस्टम समीकरण चुनें और एक घातीय क्षय के लिए समीकरण दर्ज करें:
    Equation 4
    जहां एफ (टी) एक निश्चित समय-बिंदु पर प्रतिदीप्ति तीव्रता है, एक प्रारंभिक तीव्रता और बी क्षय दर । फ़िटकरें टैब में, a और bदोनों की निचली सीमा के लिए 0 का चयन करें । इसके बाद a और b के लिए अनुमानित मान परिणाम विंडो में प्रकट होंगे । आधे जीवन के रूप में इस प्रकार की गणना:
    Equation 5

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल एक स्नैप-टैग से जुड़े किसी भी प्रोटीन के लिए सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता के आधे जीवन में एक अनुमान प्रदान करता है । इमेजिंग प्लेट की कोटिंग के लिए संयोजक ई-cadherin-एफसी का उपयोग ES कोशिकाओं है, जो अंयथा कालोनियों में बढ़ने में एकल सेल संकल्प के लिए अनुमति देता है । एकल कोशिकाओं को फिल्म के पाठ्यक्रम में अलग से ट्रैक किया जा सकता है ( चित्र 1a) ।

आदेश में प्रत्येक एकल कोशिका के लिए प्रोटीन आधा जीवन निर्धारित करने के लिए, यह समय के साथ एकीकृत, पृष्ठभूमि-घटाई स्नैप-टैग प्रतिदीप्ति सिग्नल को मापने के लिए महत्वपूर्ण है ( चित्र 1b), दोनों बेटी कोशिकाओं की एकीकृत तीव्रता को संक्षेप के साथ डिवीजनों के मामले । प्रत्येक कोशिका के लिए एक घातीय क्षय वक्र में यह परिणाम है, जिसमें से क्षय दर और इस तरह आधा जीवन वक्र फिटिंग द्वारा निकाला जा सकता है ( चित्रा 1C) । महत्वपूर्ण बात, अगर एक औसत क्षय वक्र की गणना की है, एक सेल निशान पहले फ्रेम करने के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कोशिका के औसत पर एक ही वजन है, कोशिकाओं के बीच प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता में ख्यात मतभेदों के बावजूद ।

पर्याप्त डाई एकाग्रता डाई और सेल लाइन इस्तेमाल के प्रकार पर निर्भर करता है, और इस प्रकार प्रत्येक प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । यह वर्णन करने के लिए, चित्रा 2 यहाँ दिखाया सभी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया दूर लाल फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट के विभिन्न सांद्रता के क्षय घटता से पता चलता है, एक doxycycline inducible स्नैप-टैग फ्यूजन सेल लाइन पर परीक्षण. 3 µ एम के एक प्रारंभिक डाई एकाग्रता निर्माता के निर्देशों और 1:3 के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने के अनुसार चुना गया था १.४ एनएम के एक एकाग्रता तक पहुंचने तक प्रदर्शन किया गया । दो उच्चतम सांद्रता संकेत कम नहीं करता है के लिए, जबकि मनाया क्षय १११ एनएम नीचे सांद्रता के लिए घातीय है । डाई के 12 एनएम के एक इष्टतम एकाग्रता आगे प्रयोगों के लिए चुना गया था, क्योंकि यह अवशिष्ट डाई धोने के बाद मध्यम में छोड़ दिया की न्यूनतम मात्रा सुनिश्चित की, लेकिन संकेत अभी भी काफी उज्ज्वल doxycycline inducible की एक किस्म के लिए स्पष्ट क्षय घटता का पालन किया गया था कक्ष पंक्तियां ।

आंकड़े 3 ए 3 सी दिखाने के प्रतिनिधि परिणाम, एकल कोशिका क्षय और जनसंख्या औसत सहित, अलग औसत आधा जीवन के साथ ३ प्रोटीन के लिए: pluripotency जुड़े प्रतिलेखन कारकों Nanog (औसत आधा जीवन २.९ ज) और Oct4 (औसत आधा जीवन: ४.८ ज), और अधिक लंबे समय तक रहने वाले पूर्व mRNA प्रोसेसिंग फैक्टर Srsf11 (औसत आधा जीवन २५.३ एच) । boxplots ( चित्रा 3 डी) वक्र फिटिंग द्वारा एकल कोशिका क्षय curves से प्राप्त आधे जीवन का प्रतिनिधित्व करते हैं और तीन प्रोटीन के लिए आधे जीवन के विविधता वर्णन.

Figure 1
चित्र 1 : समय चूक अधिग्रहण और विश्लेषण
एक: प्रतिनिधि छवियों की श्रृंखला स्नैप डाई के साथ लेबल कोशिकाओं नाड़ी में प्रतिदीप्ति के क्षय दिखा. सेल लाइन: doxycycline inducible TRE3G-Oct4-SNAPtag, इमेजिंग से पहले ५०० एनजी/एमएल doxycycline 7 एच के साथ प्रेरित किया ।
ख: फिल्म विश्लेषण और एकीकृत तीव्रता की गणना । मैंसी: सेल के एकीकृत तीव्रता, मैंबीजी: पृष्ठभूमि के एकीकृत तीव्रता, मैंसी-बीजी: पृष्ठभूमि-एकीकृत तीव्रता सही ।
सी: घातीय वक्र फिटिंग MATLAB में प्रदर्शन किया । एक एकल कोशिका क्षय ट्रेस का उदाहरण, इसी फिट और क्षय मानकों के लिए परिणामी अनुमान a और b. आधा जीवन इस प्रकार की गणना है: t1/2 = ln (2)/b। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : डाई एकाग्रता का अनुकूलन.
प्रतिदीप्ति स्नैप डाई के विभिंन सांद्रता के साथ लेबल कोशिकाओं पल्स के क्षय । 3 µ मीटर से शुरू डाई के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन किया गया । निशान 5 प्रत्येक कोशिकाओं के औसत रहे हैं, पहले फ्रेम करने के लिए सामान्यीकृत और 12 ज. सेल लाइन के लिए ट्रैक: doxycycline inducible TRE3G-sfGFP-mOrange2-SNAPtag-कीट, इमेजिंग से पहले ५०० एनजी/एमएल doxycycline 24 एच के साथ प्रेरित किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : अलग स्नैप-टैग उंमीदवार प्रोटीन के लिए आधा जीवन की एकल कोशिका परिवर्तनशीलता ।
A-C: एकल-कक्ष क्षय (हल्का नीला) और जनसंख्या औसत (डार्क ब्लू) for doxycycline inducible Nanog-, Oct4-और Srsf11-स्नैप-टैग फ्यूजन प्रोटीन.
डी: व्यक्तिगत कोशिकाओं के आधे जीवन, जो प्रत्येक एकल सेल के लिए घातीय वक्र फिटिंग द्वारा गणना की गई । boxplots लॉग2 स्केल में प्रदर्शित किए जाते हैं । बक्से interquartile रेंज (IQR) प्रदर्शित करते हैं, काली रेखा औसत इंगित करता है । मूंछें outliers (काले डॉट्स) को छोड़कर न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करती हैं, जिन्हें IQR से 1.5 x से अधिक deviating मूल्यों के रूप में परिभाषित किया जाता है । N = 20 कोशिकाओं प्रत्येक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

सबसे महत्वपूर्ण कदम जब एक तस्वीर-टैग का उपयोग करने के लिए प्रोटीन क्षय की निगरानी के लिए सुनिश्चित करें कि कोई अवशिष्ट असीम डाई मध्यम में या धोने के बाद कोशिकाओं में छोड़ दिया है, अंयथा यह नए उत्पादित स्नैप-टैग अणुओं के पाठ्यक्रम में बाद में प्रयोग और थेर के लिए बाध्य कर सकता है क्षय वक्र eby समझौता । यह एक तरफ ध्यान से सभी वर्णित धुलाई कदम प्रदर्शन से हासिल की है । दूसरी ओर, डाई एकाग्रता के रूप में संभव के रूप में कम रखा जाना चाहिए, जबकि अभी भी एक सीमा है कि शोर अनुपात के लिए एक अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है में किया जा रहा. के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, डाई एकाग्रता अलग कमजोर पड़ने का परीक्षण करके प्रत्येक प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. हमारे मामले में, doxycycline inducible सेल लाइनों अपेक्षाकृत उच्च अभिव्यक्ति का स्तर है, इस प्रकार एक कम डाई एकाग्रता का उपयोग करने की अनुमति ।

इस प्रोटोकॉल समय-चूक प्रतिदीप्ति इमेजिंग और प्रोटोकॉल के विभिंन पहलुओं के द्वारा एकल कोशिकाओं में प्रोटीन गिरावट यों तो एक सामांय दृष्टिकोण का वर्णन संशोधित किया जा सकता है, प्रयोगात्मक शर्तों और इसी के लक्ष्य पर निरभर है प्रयोग. प्रोटीन गिरावट ज्यादातर एक पहले आदेश घातीय क्षय निंनानुसार है । प्रोटीन क्षय के लिए यहां दिखाया गया है, फिट के आर2 मूल्यों काफी उच्च थे (0.95-0.99) और बहु का उपयोग-घातीय काफी फिट बैठता है सुधार नहीं किया है । हालांकि, अगर एकल घातीय फिट से प्राप्त परिणाम संतोषजनक नहीं हैं, फिटिंग बहु-घातीय माना जा सकता है, जो कई लेबल प्रोटीन उपआबादी के अस्तित्व के विभिंन दरों के साथ चरमरा मतलब होगा । इसके अलावा, हमारी छवि विश्लेषण पाइपलाइन पर्याप्त मैनुअल काम शामिल है, जो केवल संभव है अगर कोशिकाओं की सीमित संख्या का विश्लेषण कर रहे हैं । कोशिकाओं की अधिक संख्या के लिए, एक अधिक स्वचालित दृष्टिकोण पर विचार किया जाना चाहिए । विभिंन स्वचालित उपकरण पिछले वर्षों में विकसित किया गया है, जो विभाजन और कोशिकाओं की बड़ी संख्या16,17पर नज़र रखने के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, कोशिकाओं और लगातार सेल डिवीजनों की आवाजाही चुनौतीपूर्ण और विभाजन त्रुटियों के कारण प्रवण हैं । इसके अलावा, जब इमेजिंग प्रोटीन क्षय, प्रतिदीप्ति संकेत समय के साथ कम हो जाएगा, और भी अधिक मुश्किल फॉल्ट के लिए एक दहलीज का चयन कर रही है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के लिए कार्यांवित किए जाने से पहले ट्रैकिंग उपकरण सावधानीपूर्वक जांचे जाने चाहिए, क्योंकि सेगमेंटेशन त्रुटियां डेटा को काफी विकृत कर सकती हैं । इसके अलावा, एक अलग पृष्ठभूमि घटाव विधि, अधिग्रहीत छवियों की गुणवत्ता के आधार पर माना जा सकता है । यहाँ हम फिजी के रोलिंग बॉल सुधार का उपयोग करते हैं, जो समान रूप से प्रबुद्ध चित्रों के लिए उपयुक्त है बल्कि विरल बीज वाले कक्षों के साथ. हालांकि, खासकर अगर छवियों असमान रोशनी से ग्रस्त हैं, और विशेष पृष्ठभूमि घटाव तरीकों18,19लागू किया जा सकता है ।

हमारे दृष्टिकोण के लिए एक सीमा समय चूक रिकॉर्डिंग है कि विश्लेषण किया जा सकता है की अवधि है । अपेक्षाकृत कम रहने वाले प्रोटीन के लिए, लगभग 12 घंटे का एक अधिग्रहण समय पर्याप्त है । लंबे समय तक रहने वाले प्रोटीन के लिए, उदाहरण के लिए के रूप में Srsf11, एक वक्र फिटिंग 12 ज की एक टाइम रेंज पर प्रदर्शन संभव है । हालांकि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि घातीय फिट कम लंबे समय तक रहने वाले प्रोटीन के लिए सटीक हो सकता है, जिसके लिए अधिग्रहण समय और इमेजिंग अंतराल बढ़ाया जाना चाहिए । यदि तेजी से साइकिल चालन कोशिकाओं छवि, अब अधिग्रहण बार विश्लेषण जटिल होगा, बेटी कोशिकाओं की बढ़ती संख्या के कारण विश्लेषण किया जा रहा है । फिर, इस मामले में, एक अधिक स्वचालित विश्लेषण पाइपलाइन उपयोगी हो सकती है । इसके अलावा, जब स्नैप-टैग फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग प्रोटीन क्षय दर निर्धारित करने के लिए, स्नैप-टैग की संभावना आधा जीवन अंतर्जात प्रोटीन के फेरबदल पर विचार किया जाना चाहिए । सेल लाइनों के मामले में यहां इस्तेमाल हम इस तरह के प्रभाव के लिए कोई सबूत नहीं देखते हैं, के रूप में निर्धारित आधा Oct4 और Nanog के जीवन बारीकी से प्रकाशित मूल्यों3,20,21,22मैच । आगे के लिए बाहर नियम को स्नैप-प्रोटीन गिरावट पर टैग, खासकर जब आधा जीवन पर कोई डेटा उपलब्ध है, एक विकल्प के लिए cycloheximide द्वारा प्रोटीन संश्लेषण ब्लॉक और एक एंटीबॉडी का उपयोग कर अलग समय अंक पर पश्चिमी दाग प्रदर्शन होगा अंतर्जात प्रोटीन को पहचानने, और सीधे टैग अंतर्जात संस्करण के साथ स्नैप-टैग उंमीदवार प्रोटीन के क्षय की तुलना करें ।

सबसे पहले प्रोटीन आधा जीवन पर प्रकाशित डेटा थोक जैव रासायनिक प्रयोगों पर आधारित है, cycloheximide द्वारा प्रोटीन संश्लेषण के निषेध पर मुख्य रूप से समय पाठ्यक्रम पश्चिमी दाग प्रयोगों. हालांकि, यह प्रकिया एकल कक्ष रिज़ॉल्यूशन प्रदान नहीं करता है और इसकी लौकिक रिज़ॉल्यूशन समय की सीमित संख्या के कारण कम है-बिंदुओं को ध्यान में रखा जा सकता है । इसके विपरीत, हमारे एकल सेल दृष्टिकोण प्रोटीन संश्लेषण अवरोधकों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है और प्रोटीन क्षरण दरों में सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता की पहचान कर सकते हैं । यह भी अलग आधा जीवन है, जो विषम रूप से व्यक्त प्रोटीन की जांच के लिए विशेष रूप से दिलचस्प हो सकता है के साथ कोशिकाओं की संभावित उपजनसंख्या की पहचान करने के लिए अनुमति देता है । हमारे विधि का एक और लाभ के लिए silico में संभावना है कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ और इसलिए आधा जीवन में क्षणिक परिवर्तन की निगरानी, सेल चक्र भर में उदाहरण के लिए । हालांकि, स्नैप-टैग तकनीक के अनुरूप स्नैप-टैग की गई सेल लाइन की जनरेशन की आवश्यकता होती है, जो इसकी प्रमुख खामी हो सकती है । महत्वपूर्ण बात, हमारे दृष्टिकोण भी endogenously के लिए लागू किया जा सकता है प्रोटीन9टैग । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है हम तस्वीर के किसी भी सबूत का पालन नहीं टैग-प्रोटीन हम अध्ययन किया है के लिए अंतर्जात प्रोटीन आधा जीवन, सुझाव है कि स्नैप-टैग दृष्टिकोण की सटीकता अंय तरीकों के रूप में एक ही श्रेणी में है ।

यहां प्रस्तुत विधि विभिन्न आवेदनों के लिए उपयोगी होगी । सबसे महत्वपूर्ण बात, यह करने के लिए सेल का अध्ययन करने का विकल्प प्रदान करता है-सेल में परिवर्तनशीलता किसी भी स्नैप-टैग के लिए ब्याज की फ्यूजन प्रोटीन आधा रहता है । कई अन्य टैग उपलब्ध हैं (जैसे क्लिप टैग23 या हेलो-टैग24) जिसका कार्य सिद्धांत समान है । पल्स लेबलिंग और अवशिष्ट डाई की धुलाई एक क्षय वक्र है, जो प्रोटीन आधे जीवन का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है का नेतृत्व करेंगे, जबकि मध्यम में डाई छोड़ने (एक ligand के मामले में है कि गैर-फ्लोरोसेंट है जब तक कि टैग करने के लिए बाध्य) लंबे समय तक सक्षम बनाता है एक प्रोटीन की अवधि इमेजिंग ब्याज की । उपलब्ध फ्लोरोसेंट लाइगैंडों के बड़े चयन के कारण, स्नैप-टैग इस प्रकार अंय टैग के साथ या कई अंय फ्लोरोसेंट लेबल अणुओं के साथ संयुक्त किया जा सकता है, विभिंन संदर्भों में तकनीक लागू करने के लिए अनुमति देता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

समय-चूक माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए, EPFL आणविक जांच सुविधा (बीएसएफ) में प्रदर्शन किया गया । हम वीडियोग्राफी और फिल्म के संपादन के लिए मार्क Delachaux (सेवा Audiovisuel, EPFL) धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest - -
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 353003
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate Corning 353219
Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm Marienfeld-superior 640030
CO2 Incubator Panasonic MCO-170AICUV-PE
Centrifuge 5804 R Eppendorf 5804000528
InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System GE Healthcare Life Sciences 29027886
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Glasgow Minimum Essential Medium Sigma-Aldrich G5154
Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified ThermoFisher 16141-079
Sodium pyruvate solution Sigma-Aldrich 113-24-6
Minimum Essential Medium  Non-Essential Amino Acids ThermoFisher 11140-035
Penicillin-Streptomycin BioConcept 4-01F00H
L-Glutamine 200mM ThermoFisher 25030-024
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 63689-25ML-F
Leukemia Inhibitory factor - - Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. 
CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) Merck Millipore 361559
PD 0325901 Sigma-Aldrich 391210-10-9
Gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Dulbecco's PBS 10x concentrated BioConcept 3-05K00-I
Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ BioConcept 3-05F29-I
Trypsin-EDTA-Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049
Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein R&D systems 748-EC-050
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891
SNAP-Cell 647-SiR New England BioLabs S9102S
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A18967-01
Name Company Catalog Number Comments
Software
FIJI - - Open-source image analysis software
MATLAB R2014a Mathworks -
Microsoft Excel Microsoft -

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३२ प्रोटीन क्षरण स्नैप-टैग एकल कोशिकाओं अनुयाई सेल संस्कृति माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लाइव सेल इमेजिंग पल्स लेबलिंग फ्लोरोसेंट डाई
अनुयाई सेल कल्चर में समय-चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन ह्रास दरों की एकल-कोशिका ठहराव
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Alber, A. B., Suter, D. M.… More

Alber, A. B., Suter, D. M. Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture. J. Vis. Exp. (132), e56604, doi:10.3791/56604 (2018).

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