Summary
이 프로토콜에서는 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포, 펄스 라벨 및 스냅인 태그 융해 단백질의 형광 시간 경과 이미징 사용 하 여 결정 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
단백질 합성의 동적 상태에 있고 저하 및 그들의 반감기는 다양 한 상황에서 조정 될 수 있다. 그러나, 가장 일반적으로 사용 되 접근 단백질 반감기는 결정 하기 위해 인구 평균 lysed 세포에서 제한 하거나 단백질 합성 억제제의 사용을 필요로. 이 프로토콜 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포에 형광 현미경 검사 시간 경과 함께에서 스냅인 태그 융해 단백질을 사용 하 여 측정 하는 방법을 설명 합니다. 스냅인 태그를 융합 하는 관심사의 어떤 단백질 covalently에 바인딩될 수 있는 결합 된 형광, 세포 투과성 염료에 의해 benzylguanine 파생, 그리고 잔여 염료의 세척 후 레이블이 단백질 인구의 감퇴를 모니터링할 수 있습니다. 이후 셀 추적 그리고 통합된 형광 강도 곡선 기준으로 단일 세포에서 단백질 저하 속도 결정 하기 위한 수 있도록 추적 된 각 셀에 대 한 지 수 감퇴 곡선에서 시간 결과 정량화. 이 메서드는 다른 방법으로 쉽게 평가 될 수 없는 경작된 한 세포의 인구에 반감기의이 대 한 견적을 제공 합니다. 여기에 제시 된 접근 스냅인 태그를 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 하는 교양된 부착 세포의 모든 종류에 적용 됩니다. 여기 전자 cadherin 코팅 세포 배양 배지에서 자란 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 사용 하 여 단백질의 반감기의 광범위 한 범위와 속도 확인할 수 있습니다 어떻게 단일 셀 저하를 설명 하기 위해.
Introduction
그것은 잘 알려진 세포질 단백질 합성 및 분해 속도 특정 각 단백질에 대 한 및 생리 적 규정이 적용 되 고 광범위 한 회전율, 받 다. 전통적으로, 단백질 저하 속도 측정 된 방사성 펄스 체이스 분석 같은 대량 방법을 사용 하 여 또는 cycloheximide1단백질 합성 억제제와 관련 된 되었습니다. 더 최근에, 안정 동위 원소 질량 분석 함께에서 세포 배양 (SILAC) 아미노산으로 세계적인 규모2단백질 회전율 계량에 설립 되었습니다. 그러나, 이러한 방법은 인구 평균에 의해 제한 되 고 셀 다양성에 대 한 정보 손실 따라서 됩니다. 또한, 세포 인구에서 동기화 되는 단백질 저하의 과도 변화를 확인할 수 수 없습니다.
또는, 단백질 반감기 또한 종종 단일 셀 해상도 제공 하는 이점을 있는 형광-기반 접근에 의해 결정 수 있습니다. 예를 들어 photoactivatable 녹색 형광 단백질 (paGFP) 초기 포유류 배아3Oct4 반감기를 결정 하기 위해 사용 되었습니다. 살아있는 세포에서 단백질 부패를 감시 하는 또 다른 방법은 형광 시간 경과 영상에와 함께 스냅인 태그의 사용 이다. 스냅-태그는 DNA 수리 효소 O6-alkylguanine를 DNA-alkyltransferase (AGT) 특별히 benzylguanine와 반응 분자 프로브4,5, 로 결합 될 수 있다 (BG) 파생 하의 돌연변이 체 버전 6. 따라서, 모든 스냅인 태그 융해 단백질 수 irreversibly 표시 형광, 세포 투과성 염료와. 펄스 잔여 염료의 희미하게 다음 스냅인 태그에 융합 하는 관심사의 단백질의 라벨 표시 단백질 인구의 저하를 모니터링 및 따라서 단백질 반감기를 결정 수 있습니다. 스냅-태그 펄스 체이스 단백질의 라벨에 대 한 성공적으로 사용 된 고 단백질을 결정 하기 위한 점착에 반감기 셀 문화 그리고 vivo에서5,7,,89. 일반적으로 사용 되 포함 하는 스냅인 태그 기판의 큰 다양 한 형광 스펙트럼 상업적으로, 각 특정 응용 프로그램에 대 한 최적의 염료의 선택 사용 사용할 수 있습니다. 따라서, 스냅-태그 다른 형광 성 융해 단백질 또는 염료와 함께 멀티 컬러 이미징에 대 한 또한 사용할 수 있습니다. 셀 스며들 지 않는 염료는 세포 투과성 염료는 세포내, 막 바인딩 단백질을 모니터링에 적용 하는 반면 단백질 막 곁의 라벨 적합 합니다. 또한, 일부 이러한 프로브 거의 없는 기저 형광을 전시 하 고만 스냅인 태그10바인딩 시 강한 형광 신호를 방출 시작 합니다.
이 프로토콜 스냅인 태그를 사용 하 여 단일 셀에 대 한 관심의 다른 단백질의 저하 속도 측정 하는 방법을 설명 합니다. 여기 우리가 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 E cadherin에 교양된이 방법 적용 하지만 모든 부착 교양된 셀 종류 사용 가능 해야 한다. 우리 표시 펄스 라벨 형광 시간 경과 영상 다음 스냅인 태그 융해 단백질의 관심의 다양 한 단백질의 단일 셀 반감기를 결정 하기 위한 허용에 반감기의 셀 다양성에 대 한 견적을 제공 한다는 경작된 한 세포의 인구입니다.
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Protocol
참고:이 연구에서 E14 ES 세포 라인 사용 되었다. 그러나,이 프로토콜 어떤 다른 마우스 ES 세포 라인 생 단백질을 태그 하거나 overexpression를 사용 하 여 스냅인 태그에 융합 하는 관심사의 단백질을 표현에 직접 적용 됩니다. Doxycycline 유도할 수 있는 스냅인 태그 퓨전 셀 라인 사용한 결과 섹션에 표시 된 예제에 대 한 (다음 단백질을 융합 하는 스냅-태그: Nanog, Oct4, Srsf11, 또는 형광 단백질 mOrange2 및 sfGFP, 및의 통제에 넣어 한 doxycycline 유도할 수 있는 발기인. 참조 대 한 자세한 내용은11 doxycycline 유도할 수 있는 스냅인 태그 퓨전 셀 라인의 생성에 사용 되는 플라스 미드에). Doxycycline 유도할 수 있는 시스템은 특히 유용할 수 있습니다, 그것은 밀접 하 게 제어 하는 타이밍 및 관심사의 단백질의 식의 강도 대 한 수로. 스냅-태그의 C-터미널 위치는 것이 좋습니다, 그리고 N 맨끝 변경 아미노산 시퀀스는 대상 단백질 (N-엔드 규칙12)의 반감기를 변경할 가능성이 더.
1. E-cadherin 코팅 및 셀 시드
- 스냅인 태그4를 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 하는 ES 세포 라인을 생성 합니다.
- 코트 100 mm 셀 문화 요리 4 mL의 0.1% 젤라틴 (Ca2 +/Mg2 +없이 버퍼링 인산 염 분 (PBS)에 희석) 1 헤에 대 한 젤라틴을 제거 및 1 h. 사용에 대 한 건조 즉시 하거나 최대 2 개월까지 코팅된 접시를 저장.
- ES 세포 배양 매체 (글래스고 최소 필수 보통 10 %ES 세포 자격 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 나트륨 pyruvate, 1% 비 본질적인 아미노산, 1% 페니실린/스, 2 mM L-글루타민, 100 µ M 2-보충의 셀 라인을 성장 mercaptoethanol, 백혈병 금지 요인 (LIF), 3 µ M CHIR99021 및 0.8 µ M PD184352) 젤라틴 코팅 요리 접시 당 10-20 미 오 셀의 합류를 도달할 때까지 2 일 동안 37 ° C, 5% CO2 .
참고: 여기, LIF HEK 293T 세포, 표면에 뜨는 수집 및 필터링의 과도 transfection에 의해 제작 되었다. LIF의 각 배치 pluripotency를 유지 하기 위해 그것의 잠재력에 대 한 테스트를 했다 하지만 농도 결정 하지 했다. 그러나, 재조합 형 LIF 또한 상업적으로 사용할 수 있으며 마우스 ES 세포 배양에 대 한 일반적으로 사용 되는 농도 1000 단위/mL13. - 96 잘 접시 재조합 마우스의 30 µ L로 잘 (5 ng / µ L, 캘리포니아2 +/Mg2 +PBS에 희석 당 전자 cadherin Fc 키메라 단백질 (E-cad-Fc) 이미징에 대 한 적합 한 코트. 사용 하 여 재고 농도 100 ng / µ L,-80 ° C에 저장). 전자 cad Fc은 매우 깨지기 쉬운 광범위 한 pipetting 하지 마십시오. 1.5 h 37 ° C에서 품 어.
참고: 현미경에 따라 다른 형식은 사용할 수 있습니다. - 전자 cad Fc를 발음 하 고 캘리포니아2 +/Mg2 +, PBS의 100 µ L로 한 번 씻어 미리 따뜻하게 ES 세포 배양 매체의 100 µ L를 추가 합니다.
- 없이 Ca2 +/Mg2 +PBS의 5 mL와 관심사의 세포를 씻어. 발음 하 고 0.25% Trypsin EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 4 분 동안 품 어 ES 세포 배양 매체의 4 개 mL를 추가, resuspend 그리고 4 분 Aspirate는 상쾌한 1000 x g에서 스핀 다운 신선한 ES 세포 배양 매체의 2 mL에 펠 릿을 resuspend.
참고: 없이 Ca2 +/Mg2 + PBS 한다 사용할 수 세척 trypsinization 전에 세포에 세포 접착에 필요한 캘리포니아2 + 이온을 제거 하기 위해. 반면, 전자 cad Fc 희석 및 코팅 (1.4 단계), PBS를 사용 하 여 Ca2 +/Mg2 +, 전자 cad Fc를 ES 세포의 접착 이후 코팅된 요리는 캘리포니아2 +-종속14. - ES 세포 배양 매체 및 횟수, 세 실 (0.1 m m 깊이의 챔버에 대 한 부하 10 µ L)를 사용 하 여 1 ml resuspended 셀 1시 10분 희석.
- 전자 cad Fc에서 시드 30000 셀/cm2 이미징 플레이트 코팅. ES 세포 배양 매체에 잘 당 최대 200 µ L 채우십시오. Doxycycline 유도할 수 있는 셀 라인, doxycycline의 적절 한 복용량으로 유도 (복용량과 사전에 유도의 타이밍 최적화. 여기에 사용 되는 셀 라인 치료 했다 500 ng/mL doxycycline 이미징 하기 전에 24 시간으로). 37 ° C, 5% CO2 incubate 고 라벨 및 셀 시드 후 24 h를 이미징 펄스와 함께 진행 합니다.
2. 펄스 스냅인 태그 라벨
참고: 단백질 부패 실험에 대 한 그것은 적절 한 스냅 염료 농도 사용 하 여 중요 한입니다. 농도, 시간 경과의 시작 부분에 밝은 신호를 충분히 높은 해야로 형광 시간이 지남에 저하 됩니다. 그러나, 너무 높은 염료 농도 사용 하 여 세척 후에 매체에 또는 셀에 남아 잔류 염료를 발생할 수 있습니다. 무료 염료 수 이후에 바인딩할 새로 생산된 스냅인 태그 분자 감퇴 곡선 왜곡 됩니다 동영상의 과정을 통해. 관찰 된 형광 신호는 해당 단백질 식 수준 뿐만 아니라 염료, 사용, 셀 라인의 속성에 따라 달라 집니다. 따라서, 테스트 다른 희석, 희석 제조업체가 라이브 셀 이미징에 대 한 제안에서 시작 하 여 염료 농도 최적화 하기 위해 결정적 이다. 이 연구를 위해 빨강 형광 기판 사용 되었다. 12의 최적 농도 nM doxycycline 유도할 수 있는 overexpression 셀 라인에 대 한 결정 했다.
- 미리 데워 진된 ES 세포 배양 매체에 적절 한 농도에 스냅 염료 희석. 부드럽게 96 잘 접시에 시드 이전 세포에서 매체를 제거 하는 피 펫을 사용 하 고 잘 당 희석된 스냅 염료의 50 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 피 펫과 희석된 염료를 발음 하 고 미리 데워 공영 (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +)의 200 µ L 3 x를 씻어. ES 세포 배양 매체의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어
- 이전 세 단계를 두 번 더 반복 합니다.
참고: 광범위 한 세척은 어떤 언바운드 염료를 제거 하기 위해 중요 합니다. PBS 가진 반복된 세척 단계 15 분 외피 강력한 이미징 실험을 시작 하기 전에 스냅인 태그 융해 단백질의 라벨을 확인 하는 반면, 매체에서 잔여 extracellular 염료를 제거 합니다. 그러나, 부드러운 pipetting으로 세척 단계를 수행 하 고 셀 전자 cad Fc에 시드 쉽게 분리 하는 경향이 자동 흡 인기를 사용 하지 마십시오. - 영상 매체의 200 µ L를 추가 합니다. 줄이기 위해 형광 배경, 페 놀 레드 무료 매체를 사용 하 여 (보충 10 %ES 세포 자격 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 나트륨 pyruvate, 1% 비 본질적인 아미노산, 1% 페니실린/스, 2 m m L-글루타민, 100 µ M 2-mercaptoethanol, LIF, 3 µ M CHIR99021 및 0.8 µ M PD184352).
3. 시간 경과 현미경
- 라이브 영상, 제어 온도 CO2를 위해 적당 한 현미경을 사용 합니다. 설정 온도 37 ° C, 5% CO2 를 사용 하 고 1-2 h에 대 한 equilibrate를 허용 하기 전에.
- 접시를 현미경에 놓고 이미징에 대 한 적합 한 장소를 찾을 합니다. 관광 명소 어디 세포는 균등 하 게 분산, 하지만 너무 조밀한,이 분석을 용이 하 게 합니다를 선택 합니다. 분석에 필요한 셀의 수 선택 된 관광 명소의 수를 조정 합니다. 이 연구에서는 셀 라인 당 3-5 관광 명소를 기록 했다.
- 목표를 선택 합니다. 20 X 목표는 ES 세포의 크기에 적합 합니다.
- 기록 형광 채널에 대 한 조명 설정을 선택 합니다. 레이저 파워 및 관심사의 세포에서 형광 신호 강도 따라 노출 조정 합니다. 하지만, 영화의 과정을 통해 감소, phototoxicity 및 photobleaching을 최소화 하기 위해 30% 보다 높은 레이저 능력을 방지 이후 강한 초기 신호를 얻을 수 있는지 확인 합니다. 이 연구, 632/22 여기 필터에 대 한 nm (파장/대역), 679/34의 방출 필터 nm (파장/대역), 100 ms의 10% 및 노출 시간의 레이저 파워를 사용 했다.
- 이미징 간격 및 시간 경과 실험 기간을 선택 합니다. 2-20 h의 예상된 반감기와 단백질에 대 일 분의 시간 간격으로 12-24 h의 수집 시간을 선택 합니다. Shorter-lived 단백질에 대 한 간격 및 수집 시간을 최소로 단백질 증가에 따라 줄일.
- 이미징 시작 합니다.
4. 이미지 처리 및 분석
- 스택 tiff 형식에서으로 얻은 이미지를 수집 합니다. 추가 처리 및 분석에 대 한 피지 소프트웨어15를 사용 합니다. 저속 데이터 현미경 소프트웨어 스택으로 수집 되지 않습니다, 소프트웨어에서 시간 경과 실험의 모든 프레임을 열고 ( 파일 을 클릭 하 여 | 오픈... 또는 드래그 앤 도구 모음에 해당 하는 파일) 이미지 클릭 | 스택 | 이미지 스택입니다.
- Subtract 배경 함수를 사용 하 여 스택의 모든 그림에서 배경을 제거 하. 이렇게 하려면 프로세스 | 배경 빼기. 팝업 창에서 롤링 볼 radius를 선택 합니다. 반지름은 적어도 몇 군데 셀의 크기를 사용 합니다. 배경 빼기 스택의 모든 셀에 적용 하려면 선택 예 에 프로세스 스택? 팝업 창.
- 관심의 셀을 선택 하 고 도구 모음을 사용 하 여 주위 (ROI) 관심 영역을 그립니다. 핵 신호에 대 한 첫 번째 도구 모음에서 해당 탭을 클릭 하 고 다음 클릭 하 여 관심의 핵 조정 주위 타원형 타원형 선택을 사용 합니다. 세포질 신호 또는 매우 조밀한 지역에 대 한 자유형 선택을 사용 하 여 밀접 하 게 셀 윤곽선을 따를 수 있을. 비록 모든 배경 픽셀 (단계 4.8-4.9)의 후속 빼기 때문에 정확 하 게 셀 윤곽선을 따라 하는 데 필요한 배경, 너무 큰 영역을 포함 하지 마십시오.
- 분석을 클릭 하 여 투자 수익 관리자에 관심 영역을 추가 | 도구 | 투자 수익 관리자 | 추가, 또는 키보드에서 T 를 눌러.
- 스택 창에서 탭을 이동 하 여 또는 shift 키를 누르면 다음 프레임으로 진행 + < 키보드, 다음 이전 작업을 반복. 동영상의 과정을 통해 관심의 셀 따라 고 각 프레임의 ROI ROI 관리자 추가. 최종 투자 수익 더 를 클릭 하 여 추적 된 각 셀에 대 한 설정 저장 | 저장...에 ROI 관리자.
참고: 셀 분할 후 두 딸 셀을 개별적으로 추적 하 고 배경 빼기 후 그들의 통합된 강렬을 합계 (단계 4.6 4.9 참조) 세포 분열 동안 단백질 희석에 대 한 계정. 두 딸 세포에 대 한 투자 수익 집합을 저장 합니다. - 일단 관심의 셀은 영화 내내 추적, 측정, 평균 강도와 ROIs의 영역에 대 한 값을 클릭 합니다. 전자 스프레드시트 프로그램으로 얻은 값을 복사 하 고 각 시간 지점에 대 한 셀의 원시 통합된 강도 다음과 같이 계산.
어디 c의미평균 강도 및지역C해당 투자 수익의 영역. - 로컬 백그라운드를 예상 하려면 각 시간 프레임에 대 한 관심의 셀에 가까운 수익을 추가 합니다. 어떤 세포 형광 신호를 포함 하지 마십시오. 셀의 크기는 대략 원형 ROI를 사용 하 여 이동 하거나 필요한 경우, 예를 들어 인접 셀 간섭 하는 경우 적절 하 게 축소 합니다. 투자 수익 배경 투자 수익을 얻으려면 설정 설정 휴대와 앞에서 설명한 대로 진행 하 고 스프레드시트에 측정된 강도 값을 복사 합니다.
- 셀의 통합 된 강도 대 한 배경 수정 값을 가져오려면 먼저 각 시간 지점에 대 한 백그라운드의 통합된 강도 계산:
배경 신호 및 지역C 의 평균 강도 BG 의미 셀 포위 망 투자 수익의 영역입니다. 두 영역 모두 동일한 크기를 가지 않는 한 ROI, 배경 영역을 사용 하지 마십시오. - 각 시간 지점에 대 한 셀의 마지막 배경 빼고 통합된 강도 계산:
- 정규화 단일 셀 감퇴 곡선, 첫째 시간 점의 강도 값으로 각 시간 점의 강도 값을 나눕니다.
참고: 커브 피팅 (단계 4.11 참조)도 수행할 수 있습니다 각 단일 셀에서 또는 인구 평균에. 기반 인구 평균 셀 사이의 다른 형광 강렬에서 편견을 피하기 위해 계산 하는 경우에 정규화가 필요 합니다. 정규화는 따라서 각 셀 마지막 감퇴 곡선을 같은 무게로 공헌 한다 다는 것을 보장 합니다. 또한, 정상화 ( 그림 3A-3 C참조) 그들의 절대 형광 강렬은 별도로 단일 셀 부패 한다를 시각화 하기 위해 유용할 수 있습니다. 그러나, 경우에 단일 셀 반감기를 결정 하 고 데이터 평균 하지, 정규화 단계를 생략할 수 있다 고 커브 피팅 원시 데이터에서 직접 수행할 수 있습니다. - 단백질 반감기 예측에 대 한 커브 피팅 도구를 사용 합니다. 이 연구의 MATLAB 사용자 인터페이스 애플 리 케이 션 섹션에서 기본적으로 위치한 MATLAB 커브 피팅 도구 상자 3.4.1가 사용 되었다. 형광 강도 가져오기 및 가져오기 데이터 탭에서 클릭 하 여 MATLAB에 전자 스프레드시트에서 시간 값 커브 피팅 도구 상자를 열고 선택한 시간 포인트 및 형광 붕괴 데이터 X 데이터 및 Y 데이터 탭 선택 사용자 정의 방정식 곡선 맞춤 탭을 입력 하는 지 수 감퇴의 공식:
f (t) 주어진 시간 포인트, 형광 강도가 는 초기 강도 및 b 감퇴 속도. 맞는 옵션탭, 0 모두 a 와 b의 낮은 한도 대 한 선택. A 와 b 에 대 한 예상된 값 결과 창에 나타납니다. 다음과 같이 반감기를 계산.
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Representative Results
설명된 프로토콜 스냅인 태그 융합 어떤 주어진된 단백질에 대 한 하프 라이프 셀 가변성의 견적을 제공 합니다. 이미징 판의 코팅에 대 한 재조합 형 전자 cadherin Fc를 사용 하 여 단일 셀 해상도 ES 세포는 식민지에서 성장에 대 한 수 있습니다. 단일 셀 영화 ( 그림 1A)의 과정을 통해 개별적으로 추적할 수 있습니다.
각 단일 셀에 대 한 단백질 반감기를 결정 하기 위하여 그것은 약술에 두 딸 세포의 통합된 농도와 시간별 ( 그림 1B), 통합, 배경 빼고 스냅인 태그 형광 신호를 측정 하는 중요 한 사단의 경우입니다. 이 결과는 부패 속도 따라서 반감기 추출 될 수 있다 ( 그림 1C) 피팅 곡선에 의해 각 셀에 대 한 지 수 감퇴 곡선. 중요 한 것은, 평균 감퇴 곡선을 계산 하는 경우 단일 셀 추적 각 셀 셀 사이의 초기 형광 강도 상 상속 차이도 불구 하 고 평균에 동일한 무게는 되도록 첫 번째 프레임을 정규화 해야 합니다.
적절 한 염료 농도 염료의 종류에 따라 셀 라인 사용 하 고 따라서 각 실험에 대 한 최적화 합니다. 이 설명 하기 그림 2 빨강 형광 기판 그림과, doxycycline 유도할 수 있는 스냅인 태그 퓨전 셀 라인에서 테스트 하는 모든 실험을 위해 사용의 다른 농도의 감퇴 곡선을 보여준다. 3 µ M의 초기 염료 농도 제조업체의 지침에 따라 선정 되었다와 1: 3의 직렬 희석 1.4의 농도 도달할 때까지 수행한 nM. 두 개의 높은 농도 대 한 신호 감소 하지 않습니다, 관찰 된 부패는 111 아래 농도 대 한 지 수 nM. 12의 최적 농도 그것 세척, 후 매체에 남아 잔류 염료의 최소한의 금액을 보장 하지만 신호는 분명 관찰 하에 충분히 밝은 염료의 nM 추가 실험을 위해 선택 되었다 doxycycline 유도할 수 있는 다양 한 곡선을 부패 셀 라인입니다.
그림 3A-3 C 쇼 단일 셀 자연 붕괴 및 다른 평균 반감기와 3 단백질을 위해 인구 평균을 포함 하 여 대표 결과:는 pluripotency 관련 된 녹음 방송 요인 Oct4 및 Nanog (평균 반감기 2.9 h) (평균 하프 라이프: 4.8 h), 및 Srsf11 요소는 많은 오래 살 았된 사전 mRNA 처리 (평균 반감기 25.3 h). Boxplots ( 그림 3D) 곡선에 피팅 하 여 단일 셀 감퇴 곡선에서 얻은 반감기와 3 개의 단백질에 대 한 반감기의이 설명 합니다.
그림 1 : 시간 경과 수집 및 분석
A: 셀 펄스 스냅 염료와 표시에 형광의 감퇴를 보여주는 대표적인 이미지의 시리즈. 셀 라인: doxycycline 유도할 수 있는 TRE3G-Oct4-SNAPtag, 500 ng/mL doxycycline 이미징 하기 전에 7 h와 유도.
B: 영화 분석 및 통합 강도 계산입니다. 내가c: 나BG셀의 통합: 통합 나C BG배경의 강도: 강도 통합 배경 수정.
C: 지 수 곡선 피팅 MATLAB에서 수행합니다. 단일 셀 감퇴 추적, 해당 적합 및 부패 매개 변수에 대 한 결과 예측의 예 a와 b. 반감기는 다음과 같이 계산 됩니다: t1/2 = ln (2) /b. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 염료 농도의 최적화.
스냅 염료의 다른 농도로 표시 셀 펄스의 형광 붕괴. 3 µ M에서 시작 하는 염료의 직렬 희석 수행 되었다. 자취는 평균 5 셀 각각의 첫 번째 프레임으로 정규화 하 고 12 헤 셀 라인에 대 한 추적: doxycycline 유도할 수 있는 TRE3G-sfGFP-mOrange2-SNAPtag-해충, 500 ng/mL doxycycline 이미징 하기 전에 24 시간으로 유도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 단일 셀 다른 스냅인 태그 후보 단백질에 대 한 반감기의 변화.
A-c: 단일 셀 부패 한다 (밝은 파랑)와 아목시실린과 유도할 수 있는 Nanog, Oct4 및 Srsf11-스냅-태그 융합 단백질에 대 한 (진한 파란색)를 평균 한다.
D: 반-각 단일 셀에 대 한 피팅 지 수 곡선에 의해 계산 되었다 개별 셀의 삶. boxplots 로그2 눈금에 표시 됩니다. 상자 표시 interquartile 범위 (IQR), 검은 선 중간을 나타냅니다. 수염 이상 1.5 x는 IQR에서 벗어난 값으로 정의 되는 outliers (검은 점)을 제외 하 고 최소 및 최대 값을 나타냅니다. N = 20 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
가장 중요 한 단계는 아니 잔여 언바운드 염료 남아 매체 또는 셀으로 세척 후 그것을 보장 하기 위해 수도 바인딩할 새로 단백질 부패 모니터링 스냅인 태그를 사용 하 여 생산 실험 및 거기 동안 나중 스냅인 태그 분자 eby 타협 감퇴 곡선입니다. 이것은 한 손으로 모든 설명된 세척 단계를 신중 하 게 수행 하 여 달성 에입니다. 다른 한편으로, 염료 농도 유지 되어야 한다, 가능한 한 낮은 여전히 좋은 신호 대 잡음 비를 얻기 위해 허락 하는 범위에 있는 동안. 그림 2에서 같이 염료 농도 다른 희석을 테스트 하 여 각 실험에 대 한 최적화 되어야 합니다. 우리의 경우, doxycycline 유도할 수 있는 셀 라인 상대적으로 높은 식 레벨, 따라서 낮은 염료 농도 사용 하 여 수 있다.
이 프로토콜 시간 경과 형광 이미징 하 여 단일 셀의 단백질 저하를 계량 하는 일반적인 접근 방식을 설명 합니다 및 프로토콜의 다양 한 측면, 실험 조건 및 해당 목표에 따라 수정할 수 있습니다. 실험입니다. 단백질 저하는 대부분 첫 번째 순서 지 수 감퇴를 따른다. 단백질에 대 한 부패 한다 여기에 맞는의 R2 값은 상당히 높은 표시 (0.95 ~ 0.99) 및 멀티-지 수를 사용 하 여 하지 크게 개선 했습니다 맞는. 그러나, 단일 지 수 맞는에서 얻은 결과 만족 하는 경우 수 있습니다 멀티-지 수를 피팅 고려는 서로 다른 속도와 부패는 여러 레이블이 단백질 부분 모집단의 존재를 함축 할 것입니다. 또한, 우리의 이미지 분석 파이프라인 실현 되 면 세포의 제한 된 숫자는 분석만 상당한 수동 작업이 포함 됩니다. 셀의 높은 숫자에 대 한 자동화 된 접근을 고려해 야 합니다. 다양 한 자동화 도구 세그먼트 및 셀16,17의 더 큰 숫자를 추적할 수 있는 지난 몇 년 동안 개발 되었습니다. 그러나, 세포와 자주 셀 사단의 움직임은 도전과 세그멘테이션 오류가 발생 하는 경향이. 또한, 단백질 부패 한다, 이미징 때 형광 신호가 줄어듭니다 시간이 지남에 세분화에 대 한 임계값의 선택을 더욱 어렵게. 따라서, 추적 도구 시험 되어야 한다 신중 하 게이 프로토콜에 대 한 구현 되 고 전에 세분화 오류 데이터를 상당히 왜곡 수 있습니다. 또한, 다른 배경 빼기 방법을 고려할 수 있습니다, 인수 이미지의 품질에 따라. 여기 우리는 오히려 띄엄띄엄 시드 셀과 균등 하 게 조명된 이미지에 적합은 피지의 롤링 볼 보정을 사용 합니다. 그러나, 이미지 고르지 조명에서 고생을 하는 경우에 특히 더 전문적인된 배경 빼기 방법 적용된18,19수 있습니다.
우리의 접근 한 제한은 시간 경과 기록 분석 될 수 있는 기간입니다. 상대적으로 짧은 단백질에 대 한 약 12 h의 획득 시간 충분 하다. 예를 들면 Srsf11, 최소로 단백질에 대 한 12 h의 시간 범위에 피팅 곡선을 수행 가능 하다. 그러나, 그것은 지 수 맞는를 획득 시간 및 이미징 간격은 증가 되어야 한다 최소로 단백질에 대 한 정확히 있을 다는 것을 명심 하는 것이 중요. 빠른 자전거 셀 몇 군데 되 고는, 긴 수집 시간 분석 딸 세포의 증가 수의 분석, 복잡 하 게 됩니다. 다시 말하지만,이 경우에, 자동화 된 분석 파이프라인 유용할 수 있습니다. 또한, 단백질 감소율을 스냅인 태그 융해 단백질을 사용 하 여 때 스냅-태그 내 생 단백질의 반감기를 변경 가능성 고려 되어야 한다. 여기에 사용 되는 셀 라인의 경우 우리가 이러한 효과 대 한 증거를 참조 하는 Oct4 및 Nanog 결정된 반감기 게시 값3,20,,2122일치로. 스냅-태그의 단백질 저하에는 효과 추가 규칙, 특히 반감기에 데이터를 사용할 수 있는, 하나의 옵션 것 cycloheximide 하 여 단백질 합성을 차단 하 고 항 체를 사용 하 여 다른 시간 지점에서 서쪽 오 점 수행 하 내 생 적인 단백질을 인식 하 고 태그 내 생 버전 스냅 태그 후보 단백질의 부패를 직접 비교.
단백질 반감기에 가장 이전 게시 된 데이터 대량 생화학 실험, cycloheximide에 의해 단백질 합성의 억제에 주로 시간 코스 서쪽 오 점 실험을 기반으로 합니다. 그러나,이 방법은 단일 셀 해상도 제공 하지 않습니다 그리고 그것의 임시 해결책은 고려 될 수 있는 시간 포인트의 제한 된 수의 낮은. 대조적으로, 우리의 단일 셀 접근 단백질 합성 억제제의 사용을 요구 하지 않는다 고 단백질 저하 속도에 셀 변화를 식별할 수 있습니다. 그것은 또한 다른 반감기, 셀의 잠재적인 모집단은 특히 heterogeneously 표현한 단백질의 조사에 대 한 흥미로운 수 있습니다 식별 하는 데 있습니다. 우리의 방법의 더 이점은 이며 철에 가능성 셀 동기화 따라서 하프 라이프, 세포 주기를 통해 예 과도 변화를 모니터링. 그러나, 스냅-태그 기술 그것의 주요 단점이 될 수도 있는 해당 스냅인 태그 셀 라인의 세대가 필요 합니다. 중요 한 것은, 우리의 접근 endogenously 태그 단백질9에 적용할 수 있습니다. 위에서 언급 한 우리가 우리가 공부 하는 단백질에 대 한 내 생 단백질 반감기 변경 스냅인 태그의 어떤 증거를 준수 하지 않는 다른 방법으로 같은 범위에 스냅-태그 접근 방법의 정확도 제안.
여기에 제시 하는 방법은 다양 한 애플리케이션에 유용할 것 이다. 가장 중요 한 것은, 그것은 관심의 모든 스냅인 태그 융합 단백질에 대 한 반감기에 셀 가변성을 공부 옵션을 제공 합니다. 있다 여러 다른 태그 (예: 클립 태그23 또는 헤일로 태그24) 사용할 수 그 작동 원리는 동일. 펄스 라벨 및 잔여 염료의 세척 매체에 염료를 떠나 반면 단백질 반감기를 결정 수 있는 감퇴 곡선으로 이어질 것입니다 (비 형광은 리간드의 경우 하지 않으면 태그에 바인딩된) 단백질의 장기 이미징 가능 관심. 때문에 사용 가능한 형광 ligands의 큰 선택을, 스냅-태그 따라서 결합할 수 있습니다 다른 여러 붙일 레이블된 분자 또는 다른 태그와 다양 한 문맥에 기술을 적용 하기 위한 수 있도록.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
시간 경과 현미경 실험에는 바이오 검사 시설 (BSF), EPFL을 수행 했다. 우리는 videography 및 영화 편집을 위한 마크 Delachaux (서비스 Audiovisuel, EPFL) 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | - | - | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | - | - | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | - | - | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | - | |
| Microsoft Excel | Microsoft | - |
References
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