Summary
Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en de teelt van volwassen ratten ventriculaire cardiomyocytes (ARVC). Geïsoleerde ARVC kan worden gebruikt voor de teelt van korte en lange termijn. De isolatie en de teelt van ARVC kunnen spelen een sleutelrol bij de ontwikkeling van nieuwe behandeling regimes voor hartziekten.
Abstract
In een intact hart invloed op aangrenzende cellen volwassen cardiomyocytes. Met de methode van isolatie en teelt van volwassen cardiomyocytes is een nauwkeurig onderzoek van het gedrag van deze cellen onder specifieke behandelingen en omgevingen mogelijk. Dit manuscript presenteert een protocol voor succesvolle isolatie en teelt van volwassen ratten ventriculaire cardiomyocytes (ARVC).
De rat wordt opgeofferd door cervicale dislocatie onder diepe verdoving. Vervolgens het hart wordt geëxtraheerd en de aorta wordt blootgelegd. Perfusie op het Langendorff perfusie systeem met calcium uitputting en collagenase behandeling wordt vervolgens uitgevoerd. Daarna, ventriculaire weefsel krijgt gehakt, opnieuw verspreid, en gefilterd, gevolgd door drie centrifugeren stappen met geleidelijke toevoeging van CaCl2 totdat fysiologische calcium concentratie wordt bereikt. ARVC zijn vergulde op cel cultuur gerechten. Na het vernieuwen van het kweekmedium cel, mag ARVC worden verbouwd tot maximaal zes dagen zonder het kweekmedium serum-bevattende. Isolatie van ARVC is een calcium-gevoelige proces. Kleine veranderingen in de concentratie van intracellulair calcium leiden tot een afname van de kwaliteit en de levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen.
Vers geïsoleerd ARVC zijn staaf vormige. In de eerste dagen van de teelt van verliezen ze de staafvormig morfologie en formulier pseudopodia-achtige structuren (spreiding). Tijdens deze morfologische formatie degraderen ARVC aanvankelijk hun contractiele elementen, gevolgd door een Reformatie door middel van actine stress vezels en DOVO sarcomerogenesis. Na een week van teelt, meeste ARVC Toon een wijdverbreide verschijning met een duidelijk waarneembare kruis strepen. Dit proces is gevoelig voor de concentratie van intracellulair calcium, zoals behandeling met ionomycin verspreiden verzwakt. Belangrijke markeringen in dit proces van de - en re - differentiation zijn β-myosin zware ketting (β-MHC), oncostatin M (OSM), en swiprosin-1 (EFHD2). Recente studies hebben gesuggereerd dat cardiale re - en de - differentiation onder cultuuromstandigheden voorkomende functies gezien in vivo tijdens het remodelleren van de cardiale nabootst. Daarom, isolatie en teelt van ARVC spelen een sleutelrol in het begrip van de biologie van cardiomyocytes.
Introduction
Werken als een elektrische syncytium op basis van cel-cel contacten tussen myocytes volwassen cardiomyocytes in vivo . Bovendien, worden zij beïnvloed door aangrenzende cellen zoals cardiale fibroblasten, endotheliale cellen en neuronen ontstekingscellen1. Om te bestuderen van de mogelijkheid van cardiomyocytes aan te passen hun intracellulaire organisatie gewijzigd beladingstoestanden, zoals gezien tijdens de hypertrofie van het hart, die een eerste stap leidt tot hartfalen, de isolatie en de teelt van volwassen ventriculaire ratten cardiomyocytes (ARVC) is nodig2,3,4. Historisch, waren cardiomyocytes eerst geïsoleerd uit embryonale chick harten5,6. Een paar jaar later, werd de eerste isolatie van terminaal gedifferentieerde cardiomyocytes beschreven met behulp van calcium uitputting7. Echter is deze volwassen cardiomyocytes waren niet calcium tolerant en kan daarom niet worden gebruikt voor functionele testen. Ten slotte, in 1976 een nieuw protocol ingeschakeld Powell en Twist te onderzoeken van volwassen ventriculaire cardiomyocytes onder fysiologische omstandigheden8. Als een eerste stap geïsoleerd ze volwassen cardiomyocytes onder lage calcium concentraties en daarna verhoogd calcium aan fysiologische concentraties in een stapsgewijze procedure. Vandaag meeste protocollen voor het isoleren en de teelt van volwassen cardiomyocytes werk met dit protocol calcium en collagenase gebruiken voor de enzymatische vertering van de dichte cel contacten1.
Voor een succesvolle teelt is foetaal kalfsserum (FCS) of oncostatin M (OSM) vereist. ARVC uitvoeren een de - en re - differentiation met uitgebreide structurele veranderingen, met inbegrip van de Sarcomeer demontage en Reformatie9,10,11,12 Dit proces gaat gepaard met een nieuwe expressie van genen die foetale-type, zoals β-myosin zware ketting (β-MHC), zoals bekend van hypertrofie, en een vorming van pseudopodia-achtige structuren, een afkorting voor verspreiding4,11, 13. Voorts swiprosin-1 (EFHD2), een nieuw geïdentificeerde eiwit, speelt een belangrijke rol in het proces van re differentiatie van gekweekte ARVC11. Dientengevolge, ARVC in cultuur transformeren in grootschalige, polymorfe cellen, waaruit spontaan weeën na twee tot drie weken in cultuur2,4,14.
Recente ontdekkingen hebben onthuld dat cardiale re - en de - differentiation zoals het gebeurt onder de kweekomstandigheden nabootsers functies gezien in vivo tijdens cardiale remodelleert10,15. Cardiale remodelleren is een belangrijke proces tijdens hartziekten16. Zoals hartziekten nog steeds de belangrijkste doodsoorzaak in de geïndustrialiseerde samenlevingen zijn, een beter begrip van de biologie van volwassen cardiomyocytes is belangrijk (die; 2015). Isolatie en teelt van ARVC kunnen helpen bij het ontwikkelen van nieuwe strategieën en medicijnen voor de behandeling van hartziekten. Met dit manuscript, wordt een protocol voor het isoleren en de teelt van ARVC geleverd. Bovendien, sommige kritieke onderdelen van deze methode zijn gemarkeerd in de sectie discussie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door de ons National Institute of Health (NIH publicatie nr. 85-23, herziene versie van 1996). In het algemeen, mannelijke wistar ratten van 3 tot 4 maanden oud en met een gemiddeld gewicht van 250-350 g worden gebruikt voor dit protocol. Een rat hart is voldoende voor 20 cultuur gerechten (1 mL per schotel; inwendige diameter: 35 mm) met een geschatte celdichtheid van 1.5 x 10 4 cellen/1000 mm 2.
1. voorbereiding van de Media en reagentia
- Creatine-carnitine-taurine medium (midden van de CCT)
Opmerking: midden van de CCT is een complex medium op basis van middellange 199 met de toevoeging van creatine, carnitine en taurine.- Bereiden 1 L medium 199: toevoegen van 3,6 g Hepes toe en meng gedurende 1 uur. Voeg vervolgens 655.5 mg creatine (5 mM), 395.4 mg carnitine (2 mM), en 625.5 mg taurine (5 mM). Carnitine en taurine veranderen pH ten slotte op < 7. Toevoegen om te remmen de groei van alle contaminerende cellen, bijvoorbeeld endotheliale cellen of fibroblasten, 10 µM cytosine β-D-arabinofuranoside aan het medium. Breng de pH met NaOH (2 mM) aan 7.4 en steriele filter het medium. Het gemeenschappelijk douanetarief medium bewaren bij 4 ° C.
- Powell middellange
- voor 1 L Powell medium, los 6.43 g NaCl (110 mM) met 0,19 g KCl (2,5 mM), 0.16 g KH 2 PO 4 (1.2 mM), 0,3 g MgSO 4 7 H 2 O (1.2 mM), 5.96 g Hepes (25 mM), en 1,98 g D (+ )-Glucose monohydraat (10 mM) in Aqua steriel. Breng de pH met NaOH (2 M) aan 7.4 en steriele filter het medium. Winkel Powell medium bij 4 ° C.
- Calciumchloride (CaCl 2)
- bereid een 100 mM CaCl 2-oplossing (50 mL) en bereiden aliquots met 500 µL CaCl 2. Bevriezen aliquots bij -20 ° C.
- Voorbereiding van kweekmedium
- voorbereiden drie cel cultuur mediums: vooraf plating medium, beplating medium, en wassen medium. Midden van de CCT gebruikt als basis voor alle drie mediums (tabel 1). Bereken CCT medium met 1 mL per cultuur schotel. Daarom bereiden 20 mL CCT medium voor 20 cultuur gerechten (inwendige diameter: 35 mm).
- Cel cultuur platen: jas elke cel cultuur plaat (inwendige diameter: 35 mm) met 1 mL pre plating medium. Opslaan van de gecoate platen bij 37 ° C's nachts of voor ten minste 2 uur voordat u.
2. Isolatie van volwassen Cardiomyocytes
- voorbereiding van Langendorff perfusie systeem
- Heat plating medium en wassen middellange tot 37 ° C. een buis van 500 µL CaCl 2 deblokkeren en wegen 25 mg collagenase.
- Flush het systeem perfusie Langendorff met aqua steriele, daarna laat Powell medium circuleren van het systeem gedurende 5 minuten
- Vul het Langendorff perfusie systeem met 80 mL Powell medium zonder om het even welk bubbels en gas het medium met 95% zuurstof lucht.
- Bereiden een buis (50 mL) met 40 mL Powell medium, verwarm het tot 37 ° C, en het gas met 95% zuurstof.
- Bereiden een draad van ongeveer 25 cm lengte voor bevestiging van de verwijderde hart aan de canule.
- Ontvetten van een scheermesje met alcohol (70% van hun volume) en zet het vast aan de chopper. Klem een plastic schijf in de chopper.
- Winning van hart
- Anesthetize van een mannelijke wistar rat met 4% tot 5% Isofluraan en offeren met cervicale dislocatie. Open de buik achter de ribben boog met een abdominale schuintrekken en, met de dezelfde schaar, doorsnijden het middenrif naar de borstholte openen.
- Verwijder het hart, samen met de longen en de thymus, door te snijden boven de zwezerik zeer Cranio in de borstholte. Overbrengen in het materiaal ijskoude zoute oplossing onmiddellijk.
- Verwijder de Long en de thymus van het hart met een ontleden scissor (groot) en door de fixering van het materiaal met een capsule Tang, van de laatste overbrengen naar een nieuwe zoutoplossing.
- Isolatie
- verwijderen van overtollige weefsel, zoals residuen van zwezerik, luchtpijp, vet en bindweefsel uit het hart met behulp van capsule pincet en een ontleden scissor (groot of klein). Ontdekken van de aorta en scheiden het met een ontleden scissor (groot of klein) tussen de eerste en tweede branchial arch.
- Start de druipend van het Langendorff perfusie systeem. Plaats het hart op de canule van het Langendorff perfusie-systeem en het eerst fixeren met een krokodil klem en later met de bereid draad. Spoel het hart, totdat het is gratis voor bloed.
- Los van 25 mg Collagenase in 5-6 mL warme Powell middellange en voeg 12,5 µL CaCl 2 (30 µM).
- Omloop door het bewegen van een glazen trechter, die is verbonden met de Langendorff perfusie systeem, via het druipende hart sluit en de opgeloste collagenase toevoegen aan het systeem van de perfusie. Start de perfusie voor 25 min met de snelheid van een daling van 1 druppel per seconde.
Opmerking: Tijdens de perfusie, het hart zal zwellen en krijgen een wasachtige verschijning. - Stop de perfusie na 25 min en het hart uit het Langendorff perfusie systeem verwijderen. Verwijder de aorta, atria en bindweefsel van het hart en open de rechter en linker ventrikels.
- Hak het hart twee keer onder een hoek van 90° (maaibreedte: 0.7 mm; snelheid: 0,15 cm/s). Herhaal dit proces handmatig met twee scalpels voor 10 s weerskanten.
- Breng 12 mL van de perfusie medium in een nieuwe buis (50 mL). De cel drijfmest giet in dit medium en digest cellen voor nog eens vijf minuten bij 37 ° C. Mix de oplossing elke minuut.
- Filtreer de oplossing met het verteerd hart door middel van een nylon gaas (200 µm) in een nieuwe buis (50 mL).
- Centrifugeren van de gefilterde oplossing bij 29 x g gedurende 3 min. negeren het supernatant en 6 mL warme Powell medium met inbegrip van 12,5 µL CaCl 2 (250 µM) naar de cel pellet toe te voegen. Resuspendeer de pellet via glad schudden bewegingen. Centrifugeer nogmaals bij 29 x g gedurende 2 min. negeren het supernatant en voeg 6 mL warme Powell medium gesubstitueerd met 25 µL CaCl 2 (500 µM). Los van de cel pellet via zacht schudden bewegingen en voeg 12 mL warme Powell middellange inclusief 120 µL CaCl 2 (1 mM). Centrifuge voor de derde keer op 16 x g voor 1 min. Opnieuw, verwijder het supernatant.
- De cel pellet mengen met het medium voorverwarmde plating.
- Verwijder pre plating medium uit cultuur platen. Breng 1 mL medium, met inbegrip van de geïsoleerde cardiomyocytes, aan elke cultuur plaat plating. Incubeer verse geïsoleerde cardiomyocytes bij 37 ° C gedurende 1 h.
- Verwijder het medium van de beplating van cultuur platen. Voeg 1 mL wassen middellange tot elke cultuur-plaat en de platen bij 37 ° C tot zes dagen opslaan zonder het wijzigen van het medium.
- Voor het onderzoek naar de invloed van verschillende chemische stoffen en behandelingen op ARVC, eerst vernieuwen plating medium door het wassen van middellange en daarna het toevoegen van verschillende chemische stoffen.
Opmerking: Evaluatie met de lichte microscopie van: met de voorbereiding van elke cel, 150 tot 300 cardiomyocytes per dag moet worden gecontroleerd door de lichte microscopie. Alle getelde cardiomyocytes onderverdelen in groepen volgens hun uiterlijk (bijvoorbeeld " staafvormig ", " ronde neer ", " verspreiding van ", en " ongewone verschijning "). De categorie " verspreiding " omvat alle cardiomyocytes met pseudopodia-achtige structuren. " Ongewone verschijning " omvat alle ARVC met een onregelmatige oppervlakte en geen detecteerbare intact celmembraan.
3. Voorbeeld Experimenten
- fluorescentie/immunofluorescentie kleuring van volwassen cardiomyocytes
- analyseren morfologische en structurele conversies van ARVC tijdens de teelt door confocale laser microscopie. Phalloidin-TRITC gebruiken om te onderzoeken F-actine structuren in " staafvormig ", " ronde neer ", en " verspreiden " ARVC. Uitvoeren kleuring volgens de fabrikant ' s-protocol. Een voorbeeld voor Phalloidin-TRITC vlekken wordt gegeven in referentie Nippert et al. 11. met fluorescentie/immunofluorescentie kleuring, verschillen in de de - en re - differentiation van de contractiele apparatuur in gekweekte volwassen cardiomyocytes tussen experimentele behandelingen (bijvoorbeeld met Swiprosin-1, ionomycin) kunnen worden onderzocht.
- Real-time kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR)
- qRT-PCR om te onderzoeken van wijzigingen in de uitdrukking van mRNA van verschillende genen uit te voeren (bijvoorbeeld OSM, Swiprosin-1, β-MHC) tijdens de teelt van ARVC. Voor voldoende grootte van de steekproef, het gebruik van grotere cultuur gerechten (inwendige diameter: 60 mm) met een volume van 2 mL. ARVC van vijf cultuur gerechten levert één monster. Uitvoeren van isolatie van mRNA en transformatie van cDNA volgens de fabrikant ' s-protocol.
- Immunoblot technieken
- voeren westelijke vlekken te onderzoeken van wijzigingen in eiwit expressie (bijvoorbeeld voor Swiprosin-1) tijdens de teelt van ARVC. Gebruik van één cultuur schotel (1 mL) per monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volwassen cardiomyocytes in cultuur: Figuur 1 toont een overzicht van vers geïsoleerde volwassen cardiomyocytes 2 h na de laatste wassen. Ongeveer 75% van alle cardiomyocytes had een staafvormig morfologie. De resterende 25% bleek een ongewone verschijning met een ronde morfologie en geen detecteerbare intact celmembraan (Figuur 1). Aan het einde van de teelt (dag 6), tot 15% van alle cardiomyocytes toonde verspreiden, bleef ongeveer 10% in een ronde morfologie zonder pseudopodia-achtige structuren, en 75% van alle cardiomyocytes gepresenteerd een ongewone verschijning met een onregelmatige oppervlakte en zonder een detecteerbare intact celmembraan (gegevens niet worden weergegeven).
Figuur 1: overzicht van vers geïsoleerde rat cardiomyocytes. De Fractie van vers geïsoleerde cardiomyocytes waaruit bleek een staafvormig morfologie bedroeg gemiddeld 75% van cardiomyocytes. De resterende 25% van de cellen gepresenteerd een ongewone verschijning met een onregelmatige oppervlakte en geen detecteerbare intact celmembraan. Opname werd uitgevoerd door de lichte microscopie van 2 h na het wassen van de vers geïsoleerde cardiomyocytes. De lichte microscopie van 2 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Met de lichte microscopie leek vers geïsoleerde ARVC staaf vormige en ongeveer 100 µm in grootte (figuur 2A). Vers geïsoleerd ARVC dat spontaan contract waren niet calcium tolerant. Alle cellen die rond en zonder een detecteerbare intact celmembraan waren waren beschadigd en niet levensvatbaar (figuur 2A-B). In de volgende dagen verloor de meeste van de staaf vormige ARVC deze morfologie. Cellen heb met een aantoonbaar intact celmembraan afgerond. Deze ARVC levensvatbaar waren. Vanaf dag drie de laatstgenoemde cellen gevormd pseudopodia-achtige structuren. Sommige van deze ARVC gehouden hun afgeronde vormgeving tijdens verspreiden (figuur 2B). Anderen omgezet in flat, polymorfe ARVC (figuur 2B).
Figuur 2: geïsoleerd rat cardiomyocytes. (A) vers geïsoleerde ARVC waren meestal staafvormig. (B) na zes dagen in cultuur, pseudopodia-achtige structuren (spreiding) waren duidelijk waarneembaar in de nu afgeronde ARVC. Sommige ARVC veranderd volledig in een grootschalige morfologie. ARVC met een ongewone verschijning weergegeven een onregelmatig oppervlak en geen detecteerbare intact celmembraan. De lichte microscopie van 10 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Vers geïsoleerd waren ARVC meestal staaf vormige met een duidelijk zichtbare kruis strepen (Figuur 3, dag 0). Veranderingen in de morfologie van de cel werden waargenomen tijdens de volgende dagen in cultuur. Eerst, ARVC verloren al hun contractiele elementen (Figuur 3, dagen 1 en 2). Dit werd gevolgd door een Reformatie, we DOVO sarcomerogenesis. De Reformatie werd voorafgegaan door de vorming van pseudopodia-achtige structuren (spreiding, Figuur 3, dagen 3 tot en met 6). DOVO sarcomerogenesis begon met de verschijning van actine stress vezels (Figuur 3, dag 3). Bovendien, geassembleerd actine bundels verscheen in de perinuclear regio en nieuw gevormd sarcomeres (Figuur 3, dagen 4 en 5). De laatste groeide langs de voorgevormde actine stress vezels in de periferie (Figuur 3, dag 6). Aan het einde van de teeltduur (dag 6a), was een typische kruis strepen van nieuw gemonteerde sarcomeres in de verspreiding ARVC waargenomen.
Figuur 3: fluorescentie kleuring. De de - en re - differentiation van ARVC in cultuur met 20% FCS wordt weergegeven. Vers geïsoleerd werd ARVC met hun typische staaf-vorm (dag 0) ronde door vernederende sarcomeres tijdens de eerste dagen van cultuur (dag 1). Zij verloren al hun contractiele elementen (dag 2) gevolgd door de vorming van pseudopodia-achtige structuren (zich kan verspreiden; 3-5 dagen) en latere reformatie van hun contractiele elementen die aangeeft DOVO sarcomerogenesis (dag 6). Op dag zes in cultuur, kruis strepen was duidelijk aantoonbaar weer (dag-6a). Kleuring met Phalloidin-TRITC volgens protocol van de fabrikant; "pijlen": pseudopodia-achtige structuren (voorbeeld); *: actine bundels in de perinuclear regio (voorbeeldige weergegeven). Delen van dit cijfer worden gepubliceerd11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 geeft de kinetische van het proces van verspreiding tijdens de teelt. De Fractie van ARVC tonen van pseudopodia-achtige structuren op elk moment van onderzoek wordt gegeven als de verspreiding in % (Figuur 4). Verspreidt zich begon rond dag drie en steeg voortdurend tijdens de teelt. 14,7 pseudopodia-achtige structuren bleek % ± 1.39% van alle getelde ARVC na zes dagen in de teelt.
Figuur 4: verspreiding van kinetische toenemen in cardiomyocytes met pseudopodia-achtige structuren genormaliseerd naar alle getelde cardiomyocytes (spreiding in %) tijdens de Zesdaagse van teeltduur (n = 33 cel preparaten). Gegevens worden gepresenteerd zoals betekent ± SEM. Dit cijfer wordt gepubliceerd in11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Effect van ionomycin op de verspreiding van ARVC: De isolatie en de teelt van ARVC is een calcium-gevoelige proces1,8. Behandeling van ARVC met ionomycin (1 µM), waardoor het intracellulair calcium concentratie, veroorzaakt een significante afname van het (p ≤0.01) bij de vorming van pseudopodia-achtige structuren in vergelijking met besturingselementen (Figuur 5). Toen direct vergeleken, 17.19% ± 2,45% van alle getelde ARVC toonde verspreiden onder controlevoorwaarden maar enige 9.87% ± 2,77% van alle getelde ARVC gevormd pseudopodia-achtige structuren in de aanwezigheid van ionomycin (dag 6 van teelt). Ionomycin verlaagd dus verspreiden met 42.58%.
= "jove_content" fo:keep-together.within-pagina = "1" >
Figuur 5: verspreiding van kinetiek onder behandeling met ionomycin. Behandeling met ionomycin (1 µM) op dag 0 veroorzaakt een zeer aanzienlijke vermindering in cel verspreiden in vergelijking met controle. Gegevens worden gepresenteerd zoals betekent ± SEM; n = 4 cel preparaten; Mann-Whitney-U test; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Bovendien steeg ionomycin het percentage van ARVC met een ongewone verschijning in vergelijking met controlevoorwaarden (Figuur 6). Ten dage geteld zes, 71.11 ± 4,65% van alle ARVC behandeld met ionomycin toonde een ongewone verschijning. Echter onder controlevoorwaarden, werden enige 51.35% ± 3,55% van de ARVC gecategoriseerd in deze groep.
Figuur 6: ARVC met een ongezonde verschijning. Behandeling met ionomycin (1 µM) op dag 0 veroorzaakten een aanzienlijke toename in het aantal ARVC, waaruit bleek een ongewone verschijning. Op dag 6 was het verschil tussen controle en ARVC behandeld met ionomycin aanzienlijk. Gegevens worden gepresenteerd zoals betekent ± SEM; n = 4 cel preparaten; Mann-Whitney-U test; * p ≤0.05 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Op dag 3 van teelt, onder behandeling met ionomycin, bleek qRT-PCR een daling in mRNA uitdrukking van β-MHC (p ≤0.01) en OSM, die beide een verschillende rol bij de ambtshalve differentiatie van ARVC (figuur 7A en C spelen). Swiprosin-1, een marker voor opnieuw differentiatie van ARVC was aanzienlijk werden, ook (figuur 7B).
Figuur 7: De - en re - differentiation van gekweekte ARVC onder behandeling met ionomycin
(1 µM) op dag 0 veroorzaakt een verminderde mRNA uitdrukking van oncostatin M (OSM) en β-MHC, welke beide spelen een sleutelrol bij de ambtshalve differentiatie van volwassen cardiomyocytes. Bovendien, was mRNA uitdrukking van Swiprosin-1, een belangrijke speler in de nieuwe differentiatie van volwassen cardiomyocytes, ook daalden de ionomycin behandeling. Dag 3 van de teelt; Gegevens worden gepresenteerd zoals betekent ± SEM; n = 30 platen van de cultuur van de cel per groep; Mann-Whitney-U test; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Vooraf plating medium |
| 20 mL CCT medium |
| 2% vol. penicilline/streptomycine (400 μL) |
| 4% vol. FCS (800 μL) |
| Beplating medium |
| 20 mL CCT medium |
| 2% vol. penicilline/streptomycine (400 μL) |
| Wassen medium |
| 20 mL CCT medium |
| 2% vol. penicilline/streptomycine (400 μL) |
| Opmerking: 4% Vol. FCS in pre plating medium kan worden vervangen door 1 Vol.-% laminin (0.5 μg/cm2). Bovendien voor het cultiveren van cardiomyocytes voor meerdaagse toevoegen 20 Vol.-% FCS aan het wassen-medium. Bewaren plating medium en wassen medium met 4-8 ° C tot gebruik. |
Tabel 1: Kweekmedia gebruikt voor isolatie van de cardiomyocyte
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gedrag van volwassen cardiomyocytes in vivo wordt beïnvloed door veel interacties met andere cellen (bijvoorbeeld, neuronen, endotheliale cellen, fibroblasten, ontstekingscellen) en de elektrische syncytium die zij vormen1. Bestuderen van stress aanpassing van volwassen cardiomyocytes uitsluitend, vereist daarom het isolement en de teelt van ARVC. De belangrijkste gevolgen van isoleren en het cultiveren van ARVC zijn: 1) verbreekt van extracellulaire matrix en cel-cel contacten; 2) verbreken ze contractiele stimuli; 3) dwingen hen aan te passen van een drie-dimensionale weefsel van twee-dimensionale omgeving. Onder deze omstandigheden, ARVC starten de - en re - differentiation zoals hierboven beschreven en uitvoeren van meerdere aanpassingen, die zijn ook gezien tijdens de cardiale remodelleert in vivo (β-â adrenoceptor desensibilisatie, opnieuw samenstellen van de sarcomeres, enz.) 4. daarom het isolement van volwassen cardiomyocytes vertegenwoordigt een geldige methode om deze cellen en hun reactie op de verschillende behandelingen te onderzoeken. Deze inzichten kunnen daarna voor in vivo experimenten, die zou de steun in het vermijden van geen onnodige experimenten en het verminderen van het aantal proefdieren worden gebruikt. Zeker, sommige bevindingen gezien in vitro zal niet optreden in vivo (bv, de vorming van pseudopodia-achtige structuren). De bestaande cel-cel-contactpersonen binnen het elektrische syncytium zal belemmeren buitensporige groei onder fysiologische omstandigheden17. Niettemin, geïsoleerde en gecultiveerde ARVC kan worden gebruikt om te onderzoeken van het gedrag van volwassen cardiomyocytes. Bovendien kunnen eerste proeven van nieuwe behandelingsstrategieën tegen hartziekten bij mensen met ARVC worden uitgevoerd.
De beschreven methode voor het isoleren en de teelt van volwassen cardiomyocytes bevat een aantal kritische punten. Succesvolle om resultaten te verkrijgen, moeten de volgende producten beschouwd.
1. calcium tolerantie: historisch, de calcium-tolerantie van volwassen cardiomyocytes was één van de meest kritische factoren die leiden tot een succesvolle isolatie en de teelt van volwassen cardiomyocytes1,7, 8. tegenwoordig protocollen zijn vastgesteld om de teelt onder fysiologische calcium voorwaarden1,3. Dit manuscript toont de invloed van de concentratie van een gewijzigde intracellulair calcium op de kwaliteit van geïsoleerde ARVC. Ionomycin, waardoor het intracellulair calcium concentraties, veroorzaakt een significante afname van de verspreiding en een aanzienlijke toename in het aantal cardiomyocytes met een ongewone verschijning. Bovendien, het veroorzaakt een Downregulatie van de belangrijkste merkers voor cardiale de - en re - differentiation: β-MHC, OSM en Swiprosin-1. Daarom belemmert verandert de intracellulaire calcium concentratie tijdens de teelt het vermogen van ARVC aan te passen aan nieuwe omgevingen. Hoewel sommige ARVC konden verspreiden en aan te passen (9.87% ± 2,77% van alle getelde ARVC; Figuur 5), een nauwkeurig onderzoek van ARVC onder deze omstandigheden is niet mogelijk. Dus, voor een nauwkeurige isolatie en de teelt van ARVC een gevestigde calcium-protocol moet worden gebruikt. Bovendien moet worden gezorgd dat geen van de onderzochte behandelingen met de calcium hemostase van ARVC interfereren.
2. collagenase: er zijn verschillende batches instellen van collagenase beschikbaar. Elke partij toont de verschillen in kwaliteit en effectiviteit1. Daarom is de auteurs raden bestellen en het testen van monsters van verschillende batches instellen. De tijd van de spijsvertering en de hoeveelheid van elke nieuwe batch collagenase gebruikte moet bovendien worden apart beoordeeld. Dienovereenkomstig, de concentratie en het tijdstip van de spijsvertering in het protocol beschreven kunnen enigszins afwijken bij andere protocollen.
3. tijd tot perfusie van het hart: om een hoge kwaliteit van ARVC, de tijd tussen extractie van het hart van het lichaam en het begin van de perfusie met het Langendorff systeem moet zo kort mogelijk. Een langdurig veroorzaakt schade aan het hart en resulteert in een groter aantal niet-levensvatbare ARVC.
Bovendien, opwarming van de aarde de oplossing van de perfusie tijdens de perfusie en spijsvertering gedurende 5 minuten na het weefsel hakken essentieel is voor een goed resultaat oplevert. Voorkom onnodige schade van de biologische weefsels, moet het voorzichtig worden omgegaan, op all-time punten. Bovendien moet opgemerkt worden dat de behandeling met OSM of lagere concentraties van FCS inschakelen ook ARVC tot en met de - en re - differentiate4,10,18,19. Echter, zonder deze voedend behandelingen, ARVC gedegenereerde binnen een paar dagen2.
Kortom, is de isolatie en de teelt van ARVC een gevoelige methode die biedt een scala aan mogelijkheden te onderzoeken van het gedrag van volwassen cardiomyocytes uitsluitend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De resultaten die worden weergegeven zijn onderdeel van het proefschrift van Franziska Nippert.
Acknowledgments
De auteurs danken Nadine Woitasky en Peter Volk voor technische bijstand. Bovendien, danken de auteurs mevrouw Claudia Lorenz (medische schrijver, ACCEDIS) voor haar hulp bij de voorbereiding van het manuscript. Dit manuscript werd financieel ondersteund door DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -D. Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , Springer International Publishing AG Switzerland. (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. Fabbro, D., McCormick, F. 290, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P.
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , Garland Science Taylor and Francis Group. New York, NY. (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
