Summary
Vi præsenterer her, en protokol til isolering og dyrkning af voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC). Isolerede ARVC kan bruges til kort- og langsigtede dyrkning. Isolering og dyrkning af ARVC kan spille en central rolle i udviklingen af nye behandlingsregimer for hjerte sygdomme.
Abstract
I en intakt hjerte påvirke tilstødende celler voksne cardiomyocytes. Med metoden til isolering og dyrkning af voksen cardiomyocytes er en nøjagtig undersøgelse af funktionaliteten af disse celler under specifikke behandlinger og miljøer muligt. Dette manuskript præsenterer en protokol for vellykket isolering og dyrkning af voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC).
Rotten er ofret af cervikal dislokation under dyb anæstesi. Derefter, hjertet er udvundet og aorta er afdækket. Efterfølgende, er perfusion på Langendorff perfusion system med calcium udtynding og collagenase behandling udført. Bagefter, ventrikulær væv bliver hakket, recirkuleret, og filtreret, efterfulgt af tre centrifugering trin med gradvis tilføjelse af CaCl2 indtil fysiologiske calcium koncentrationen er nået. ARVC er belagt på celle kultur retter. Efter forfriskende cellekulturmedium, kan ARVC være dyrket i op til seks dage uden at ændre næringssubstratet serum-holdige. Isolering af ARVC er en følsom proces, calcium. Små ændringer i den intracellulære calcium koncentration forårsage et fald i kvaliteten og levedygtigheden af de isolerede celler.
Frisk isoleret ARVC er stang formet. Inden for de første dage af dyrkningen mister de de stavformet morfologi og form pseudopodia-lignende strukturer (spredning). Under denne morfologiske dannelse ARVC oprindeligt forringe deres kontraktile elementer efterfulgt af en reformation gennem actin stress fibre og de novo sarcomerogenesis. Efter en uge med dyrkning, de fleste ARVC viser en udbredt udseende med en klart påviselig cross striation. Denne proces er følsomme over for intracellulære calcium koncentration, som behandling med ionomycin dæmper spredning. Vigtige markører i denne proces af de - og re - differentiation er β-myosin heavy chain (β-MHC), oncostatin Mikkelsen (OSM) og swiprosin-1 (EFHD2). Nylige undersøgelser har antydet, at hjertets re og deaktivere differentiation optræder under kultur efterligner funktioner set i vivo under hjerte remodellering. Derfor, isolering og dyrkning af ARVC spiller en central rolle i forståelsen af cardiomyocytes biologi.
Introduction
Voksen cardiomyocytes i vivo arbejde som en elektrisk syncytium baseret på celle-celle kontakter mellem myocytes. Derudover er de påvirket af tilstødende celler som hjerte fibroblaster, endothelial celler, neuroner og inflammatoriske celler1. For at studere cardiomyocytes evne til at tilpasse deres intracellulære organisation til ændret belastningsforhold, som set under Hjertehypertrofi, som er et indledende skridt fører til hjertesvigt, isolering og dyrkning af voksen ventrikulær rotte cardiomyocytes (ARVC) er nødvendigt2,3,4. Historisk, blev cardiomyocytes først isoleret fra embryonale chick hjerter5,6. Et par år senere, blev den første isolation af terminalt differentieret cardiomyocytes beskrevet ved hjælp af calcium udtynding7. Men disse voksen cardiomyocytes var ikke calcium tolerant og kunne derfor ikke bruges til funktionelle assays. Endelig, i 1976 en ny protokol aktiveret Powell og Twist at undersøge voksen ventrikulær cardiomyocytes under fysiologiske forhold8. Som et første skridt isoleres de voksne cardiomyocytes under lavt calcium koncentrationer og derefter øget calcium til fysiologiske koncentrationer i en trinvis procedure. I dag, de fleste protokoller til isolering og dyrkning af voksen cardiomyocytes arbejde med denne protokol, calcium og bruge collagenase for enzymatisk fordøjelsen af tætte celle-celle kontakter1.
For en vellykket dyrkning er føtalt kalveserum (FCS) eller oncostatin M (OSM) påkrævet. ARVC udføre en de - og re - differentiation med omfattende strukturelle ændringer herunder sarkomeret demontering og reformationen9,10,11,12. Denne proces er ledsaget af en fornyet udtryk for føtal-type gener, som β-myosin heavy chain (β-MHC), som det kendes fra hypertrofi, og dannelsen af pseudopodia-lignende strukturer, også kaldet sprede4,11, 13. Desuden swiprosin-1 (EFHD2), en nyligt identificerede proteiner, spiller en vigtig rolle ved at re differentiering af dyrkede ARVC11. Som et resultat, omdanne ARVC i kultur udbredt, polymorfe celler, som spontant Vis sammentrækninger efter to til tre uger i kultur2,4,14.
De seneste opdagelser har afsløret, at hjertets re og deaktivere differentiation som det sker kultur betingelser efterligner funktioner set i vivo under hjerte remodeling10,15. Hjerte remodellering er en central proces under hjerte sygdomme16. Som hjerte sygdomme er stadig den vigtigste dødsårsag i de industrialiserede samfund, en bedre forståelse af voksen cardiomyocytes biologi er vigtigt (der; 2015). Isolering og dyrkning af ARVC kan bidrage til at udvikle nye strategier og lægemidler til behandling af hjerte sygdomme. Med dette manuskript, er en protokol til isolering og dyrkning af ARVC leveret. Desuden, nogle vigtige dele af denne metode er fremhævet i afsnittet diskussion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
undersøgelsen er foretaget efter vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr udgivet af os National Institute of Health (NIH publikation nr. 85-23, revideret 1996). I almindelighed, mandlige wistar rotter i alderen 3 til 4 måneder og med en gennemsnitlig vægt på 250-350 g bruges til denne protokol. En rotte hjerte er tilstrækkelig for 20 kultur retter (1 mL pr parabol, indvendig diameter: 35 mm) med en omtrentlig celle tæthed på 1,5 x 10 4 celler/1000 mm 2.
1. forberedelse af medier og reagenser,
- kreatin-carnitin-taurin medium (FTT medium)
Bemærk: FTT medium er et komplekst medie baseret på medium 199 med tilsætning af kreatin, carnitin og taurin.- Forberede 1 L af medium 199: tilføje 3,6 g Hepes og mix for 1 h. Derefter tilsættes 655.5 mg kreatin (5 mM), 395.4 mg carnitin (2 mM) og 625.5 mg taurine (5 mM). Carnitin og taurin ændre pH at < 7. For at hæmme væksten af kontaminerende celler, tilføje fx endotelceller eller fibroblaster, 10 µM cytosin β-D-arabinofuranoside til medium. Justere pH med NaOH (2 mM) til 7,4 og sterile filter medium. Opbevar FTT medium ved 4 ° C.
- Powell medium
- For 1 L Powell medium, opløse 6.43 g NaCl (110 mM) med 0,19 g KCl (2,5 mM), 0.16 g KH 2 PO 4 (1,2 mM), 0,3 g MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), 5.96 g Hepes (25 mM), og 1,98 g D (+ )-Glucose monohydrat (10 mM) i Aqua sterile. Justere pH med NaOH (2 M) til 7,4 og sterile filter medium. Butik Powell medium ved 4 ° C.
- Calciumchlorid (CaCl 2)
- forberede en 100 mM CaCl 2 løsning (50 mL) og forberede delprøver indeholdende 500 µL CaCl 2. Fryse alikvoter ved -20 ° C.
- Forberedelse af dyrkningsmediet
- Forbered tre celle kultur medier: pre plating medium, plating medium og vask medium. Brug FTT medium som grundlag for alle tre medier (tabel 1). Beregne FTT medium med 1 mL per kultur parabol. Derfor forberede 20 kultur retter 20 mL FTT medium (indvendig diameter: 35 mm).
- Celle kultur plader: Coat hver celle kultur plade (indvendig diameter: 35 mm) med 1 mL før plating medium. Gemme de overtrukne plader ved 37 ° C natten over eller mindst 2 h før ved hjælp af.
2. Isolering af voksne Cardiomyocytes
- forberedelse af Langendorff perfusion system
- varme plating medium og vask medium til 37 ° C. Defreeze et rør af 500 µL CaCl 2 og vejer i 25 mg collagenase.
- Skyl Langendorff perfusion system med aqua sterile, bagefter Lad Powell medie cirkulerer system i 5 min.
- Fyld Langendorff perfusion system med 80 mL Powell medium uden nogen luft bobler og gas medium med 95% ilt.
- Udarbejde en tube (50 mL) med 40 mL Powell medium, varme det til 37 ° C og gas det med 95% ilt.
- Udarbejde en tråd af ca. 25 cm i længden til fastgørelse fjernet hjertet at kanylen.
- Affedt et barberblad med alkohol (70% af volumen) og fastgøre den til chopper. Klemme en plastik disk til chopper.
- Udvinding af hjertet
- bedøver en mandlig wistar rotter med 4-5% isofluran og ofre det med livmoderhalskræft dislokation. Åbne abdomen bag costal bue med en abdominal shear, og med den samme saks, skære igennem mellemgulvet til åbne brysthulen.
- Fjerne hjerte, lunge og thymus, ved at skære over thymus meget kranie i brysthulen. Overføre materiale til iskolde saltopløsning straks.
- Fjerne lunge og thymus fra hjertet med et dissekere saks (store) og af fikserer materialet med kapsel pincet, overføre sidstnævnte til en ny saltopløsning.
- Isolation
- fjerne overskydende væv, som restkoncentrationer af thymus, luftrør, fedt og bindevæv fra hjertet ved hjælp af kapsel pincet og en dissekere saks (stor eller lille). Afdække aorta og bryde det med en dissekere saks (stor eller lille) mellem den første og anden branchial arch.
- Start dryppende af Langendorff perfusion system. Placer midt på kanylen af Langendorff perfusion system og fiksere det først med en krokodille klemme og senere med den forberedte tråd. Skyl hjertet, indtil det er blod.
- 25 mg Collagenase i 5-6 mL varm Powell medium opløses og tilføje 12,5 µL CaCl 2 (30 µM).
- Lukke omsætning ved at flytte et glas tragt, der er forbundet med ordningen Langendorff perfusion over dryppende hjerte og tilføje den løst collagenase perfusion system. Start perfusion i 25 min. med en henlægge hastighed på 1 dråbe per sekund.
Bemærk: Under perfusion, hjertet vil svulme op og få en voksagtig udseende. - Stoppe perfusion efter 25 min og fjern hjertet fra Langendorff perfusion system. Fjerne aorta, forkamre og bindevæv fra hjertet og åbne de højre og venstre ventrikler.
- Hakke hjertet to gange i en vinkel på 90° (klippebredde: 0,7 mm; hastighed: 0,15 cm/s). Gentag denne proces manuelt med to skalpeller for 10 s hver side.
- Overføres 12 mL af perfusion medium til en ny tube (50 mL). Hæld celle gylle i dette medium og fordøje celler i en anden 5 minutter ved 37 ° C. Mix løsning hvert minut.
- Filter løsning med fordøjet hjertet gennem en nylon mesh (200 µm) ind i et nyt rør (50 mL).
- Centrifugeres den filtrerede løsning på 29 x g i 3 min. Fjern supernatanten og tilføje 6 mL varm Powell medium herunder 12,5 µL CaCl 2 (250 µM) til celle pellet. Resuspenderes gennem glat rystende bevægelser. Centrifugeres igen ved 29 x g i 2 min. Fjern supernatanten og tilføje 6 mL varm Powell medium substitueret med 25 µL CaCl 2 (500 µM). Opløse den celle pellet gennem blid rystende bevægelser og tilføje 12 mL varm Powell medium herunder 120 µL CaCl 2 (1 mM). Centrifuge for tredje gang på 16 x g i 1 minut. Igen, Fjern supernatanten.
- Mix celle pellet med pre varmede plating medium.
- Fjerne før plating medium fra kultur plader. Der overføres 1 mL plating medium, herunder de isolerede cardiomyocytes, at hver kultur plade. Inkuber frisk isolerede cardiomyocytes ved 37 ° C i 1 h.
- Fjerne plating medium fra kultur plader. Der tilsættes 1 mL vask medium til hver kultur plade og gemme plader ved 37 ° C op til seks dage uden at ændre mediet.
- For at undersøge indflydelsen af forskellige kemikalier og behandlinger på ARVC, først opdatere plating medium ved vask medium og derefter tilføje forskellige kemikalier.
Bemærk: Evaluering med lysmikroskopi: med hver celle forberedelse, 150 til 300 cardiomyocytes bør overvåges pr. dag ved lysmikroskopi. Opdele alle optalte cardiomyocytes i grupper ud fra deres udseende (f.eks. " stang-formede ", " runde ned ", " breder sig ", og " usædvanlige udseende "). Kategorien " spredning " omfatter alle cardiomyocytes med pseudopodia-lignende strukturer. " Usædvanlige udseende " omfatter alle ARVC med en uregelmæssig overflade og ingen påviselige intakt cellemembranen.
3. Eksempel Eksperimenter
- fluorescens/immunofluorescens farvning af voksne cardiomyocytes
- Analyze morfologiske og strukturelle konverteringer af ARVC under dyrkningen af Konfokal laser mikroskopi. Brug Phalloidin-TRITC til at undersøge F-actin strukturer i " stang-formede ", " runde ned ", og " spreder " ARVC. Udføre farvning ifølge producenten ' s protokol. Et eksempel på Phalloidin-TRITC farvning er givet i reference Nippert et al. 11. med fluorescens/immunofluorescens farvning, forskelle i de - og re - differentiation af det kontraktile apparat i dyrkede voksne cardiomyocytes mellem eksperimentelle behandlinger (fx med Swiprosin-1, ionomycin) kan undersøges.
- Real-time kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR)
- udføre qRT-PCR for at undersøge ændringer i mRNA udtrykket af forskellige gener (fx, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) under dyrkningen af ARVC. For tilstrækkelig stikprøvestørrelse, bruge større kultur retter (indvendig diameter: 60 mm) med 2 mL volumen. ARVC af fem kultur retter giver en prøve. Foretage isolation af mRNA og transformation af cDNA ifølge producenten ' s protokol.
- Immunblot teknikker
- udføre Western blotting at undersøge ændringer i protein udtryk (f.eks. for Swiprosin-1) under dyrkningen af ARVC. Bruge én kultur parabol (1 mL) pr. prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksen cardiomyocytes i kultur: Figur 1 viser en oversigt over frisk isolerede voksen cardiomyocytes 2 h efter den sidste vask. Ca. 75% af alle cardiomyocytes havde en stavformet morfologi. De resterende 25% viste en usædvanligt udseende med en runde morfologi og ingen påviselige intakt cellemembranen (figur 1). I slutningen af dyrkning (dag 6), op til 15% af alle cardiomyocytes viste spredning, ca. 10% forblev i en runde morfologi uden pseudopodia-lignende strukturer, og 75% af alle cardiomyocytes præsenteret en usædvanligt udseende med en uregelmæssig overflade og uden en påviselige intakt celle membran (data ikke vist).
Figur 1: oversigt over frisk isolerede rotte cardiomyocytes. Brøkdel af frisk isoleret cardiomyocytes, som viste en stavformet morfologi udgjorde 75% af cardiomyocytes, i gennemsnit. De resterende 25% af celler præsenteret en usædvanligt udseende med en uregelmæssig overflade og ingen påviselige intakt cellemembranen. Optagelsen blev gennemført af lysmikroskopi 2 h efter vask den frisk isoleret cardiomyocytes. Lysmikroskopi 2 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Med lysmikroskopi syntes frisk isolerede ARVC stang formet og omkring 100 µm i størrelse (figur 2A). Frisk isoleret var ARVC, der kontrakt spontant ikke calcium tolerant. Alle celler, der var runde og uden en påviselig intakt cellemembranen blev beskadiget og ikke levedygtige (figur 2A-B). I de følgende dage mistet de fleste af stangen formet ARVC denne morfologi. Celler fik afrundet med en påviselig intakt cellemembranen. Disse ARVC var levedygtige. Start på dag tre sidstnævnte cellerne dannet pseudopodia-lignende strukturer. Nogle af disse ARVC holdt deres afrundede udseende under spredning (figur 2B). Andre omdannet til flad, polymorfe ARVC (figur 2B).
Figur 2: isoleret rotte cardiomyocytes. (A) frisk isolerede ARVC var typisk stavformet. (B) efter seks dage i kultur, pseudopodia-lignende strukturer (spredning) var klart påvises i den nu rundet ARVC. Nogle ARVC ændret fuldstændig til en udbredt morfologi. ARVC med et usædvanligt udseende vises en irregulær overflade og ingen påviselige intakt cellemembranen. Lysmikroskopi 10 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Frisk isoleret var ARVC typisk stang formet med en klart synlig tværs striation (figur 3, dag 0). Ændringer i celle morfologi blev observeret i løbet af de følgende dage i kultur. Først, ARVC mistede alle deres kontraktile elementer (figur 3dage 1 og 2). Dette blev efterfulgt af en reformation, implicere de novo sarcomerogenesis. Reformationen var forud for dannelsen af pseudopodia-lignende strukturer (spredning, figur 3, dage 3 til 6). De novo sarcomerogenesis startede med udseendet af actin stress fibre (figur 3, dag 3). Derudover samlet actin bundter dukkede op i regionen perinuclear og dannede nyligt sarcomeres (figur 3dage 4 og 5). Sidstnævnte voksede langs præfabrikerede actin stress fibre i periferien (figur 3, dag 6). I slutningen af perioden dyrkning (dag 6a), en typisk cross striation fra nyligt forsamlede sarcomeres i opslaget blev der observeret ARVC.
Figur 3: fluorescens farvning. De - og re - differentiation af ARVC i kultur med 20% FCS er vist. Frisk isoleret blev ARVC med deres typiske stang form (dag 0) runde af nedværdigende sarcomeres i de første dage af kultur (dag 1). De mistede alle deres kontraktile elementer (dag 2) efterfulgt af dannelsen af pseudopodia-lignende strukturer (udbredelse; Dage 3-5) og efterfølgende reformation af deres kontraktile elementer, der angiver de novo sarcomerogenesis (dag 6). På dag seks i kultur, cross striation var klart påviselige igen (dag 6a). Farvning med Phalloidin-TRITC efter producentens protokol; "pile": pseudopodia-lignende strukturer (eksempel vist); *: actin bundter i regionen perinuclear (eksemplarisk vist). Dele af denne figur er offentliggjort i11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 viser den kinetiske sprede processen under dyrkning. Brøkdel af ARVC viser pseudopodia-lignende strukturer på hver gang i behandlingen er givet som spreder sig i % (figur 4). Spredning begyndte omkring dag tre og steg konstant i forbindelse med dyrkning. 14,7% ± 1,39% af alle optalte ARVC viste pseudopodia-lignende strukturer efter seks dage i dyrkning.
Figur 4: spreder kinetisk stigning i cardiomyocytes med pseudopodia-lignende strukturer normaliseret til alle optalte cardiomyocytes (spredning i %) i løbet af seks dage af dyrkningen tid (n = 33 celle præparater). Data præsenteres som middel ± SEM. Dette tal er udgivet i11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Effekt af ionomycin på spredning af ARVC: Isolering og dyrkning af ARVC er en calcium følsomme proces1,8. Behandling for ARVC med ionomycin (1 µM), hvilket øger intracellulære calcium koncentration, forårsagede en signifikant (p ≤0.01) fald i dannelsen af pseudopodia-lignende strukturer i forhold til kontrol (figur 5). Når man sammenligner direkte, 17.19 ± 2,45% af alle optalte ARVC viste sprede kontrol betingelser, men kun 9.87 ± 2,77% af alle optalte ARVC dannet pseudopodia-lignende strukturer, i overværelse af ionomycin (dag 6 i dyrkning). Således er ionomycin reduceret spredning med 42,58%.
= "jove_content" fo:keep-together.within-side = "1" >
Figur 5: spredning kinetik under behandling med ionomycin. Behandling med ionomycin (1 µM) på dag 0 forårsaget en meget betydelig reduktion i celle breder sig i forhold til kontrol. Data præsenteres som middel ± SEM; n = 4 celle præparater; Mann-Whitney U test; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Derudover steg ionomycin andelen af ARVC med et usædvanligt udseende i forhold til kontrol betingelser (figur 6). På dag tælles seks, 71.11 ± 4,65% af alle ARVC behandlet med ionomycin viste en usædvanligt udseende. Dog under kontrol betingelser, blev kun 51.35% ± 3.55% af ARVC kategoriseret i denne gruppe.
Figur 6: ARVC med et usundt udseende. Behandling med ionomycin (1 µM) på dag 0 forårsaget en betydelig stigning i antallet af ARVC, som viste en usædvanligt udseende. På dag 6 var forskellen mellem kontrol og ARVC behandlet med ionomycin betydelig. Data præsenteres som middel ± SEM; n = 4 celle præparater; Mann-Whitney U test; * p ≤0.05 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
På dag 3 af dyrkning, under behandling med ionomycin, viste qRT-PCR et fald i mRNA udtryk for β-MHC (p ≤0.01) og OSM, der begge spiller en klar rolle i nedtrapning differentiering af ARVC (figur 7A og C). Swiprosin-1, en markør for fornyet differentiering af ARVC var betydeligt downregulated, også (figur 7B).
Figur 7: De - og re - differentiation af dyrkede ARVC under behandling med ionomycin
(1 µM) på dag 0 forårsaget en nedsat mRNA udtryk af oncostatin M (OSM) og β-MHC, som begge spiller vigtige roller i nedtrapning differentiering af voksen cardiomyocytes. Derudover var mRNA udtryk af Swiprosin-1, en central aktør i ny differentieringen af voksen cardiomyocytes, også faldet med ionomycin behandling. Dag 3 af dyrkning; Data præsenteres som middel ± SEM; n = 30 celle kultur plader pr. gruppe; Mann-Whitney U test; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Før plating medium |
| 20 mL FTT medium |
| 2% vol. Penicillin/Streptomycin (400 μL) |
| 4% vol. FCS (800 μL) |
| Plating medium |
| 20 mL FTT medium |
| 2% vol. Penicillin/Streptomycin (400 μL) |
| Vask medium |
| 20 mL FTT medium |
| 2% vol. Penicillin/Streptomycin (400 μL) |
| Bemærk: 4% Vol. FCS i før plating medium kan erstattes af 1 Vol.-% laminin (0,5 μg/cm2). Derudover til at dyrke cardiomyocytes i flere dage tilføje 20 Vol.-% FCS til vask medium. Gemme plating medium og vask medium af 4-8 ° C indtil brug. |
Tabel 1: medier anvendt til cardiomyocyte isolation
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Funktionsmåden for voksen cardiomyocytes i vivo er påvirket af mange interaktioner med andre celler (f.eks., neuroner, endothelial celler, fibroblaster, inflammatoriske celler) og den elektriske syncytium, som de udgør1. Studerer stress tilpasning af voksen cardiomyocytes udelukkende kræver derfor, at isolering og dyrkning af ARVC. De vigtigste virkninger af afsondrethed og dyrke ARVC er: 1) afbryde dem fra ekstracellulære matrix og cell-celle kontakter; 2) afbryde dem fra kontraktile stimuli; 3) tvinger dem til at tilpasse sig fra en tre-dimensionel væv til to-dimensionelle omgivelser. Disse betingelser ARVC starter de og re differentiation som beskrevet ovenfor og foretage flere tilpasninger, som er også ses under hjerte remodeling i vivo (β-adrenoceptor desensibilisering, gensamling af sarcomeres, osv.) 4. derfor isolationen af voksen cardiomyocytes repræsenterer en gyldig metode til at undersøge disse celler og deres svar på forskellige behandlinger. Disse indsigter kan bruges bagefter for i vivo eksperimenter, som ville støtte i at undgå unødvendige eksperimenter og at reducere antallet af forsøgsdyr. Sikkert, nogle resultater set i vitro vil ikke forekomme i vivo (f.eks., dannelsen af pseudopodia-lignende strukturer). De eksisterende celle-celle-kontakter inden for den elektriske syncytium vil hæmme overdreven vækst under fysiologiske tilstande17. Ikke desto mindre, isolerede og dyrkede ARVC kan bruges til at undersøge funktionaliteten af voksne cardiomyocytes. Første forsøg med nye behandling strategier mod hjerte sygdomme hos mennesker kan desuden udføres med ARVC.
Den beskrevne metode til isolering og dyrkning af voksen cardiomyocytes indeholder nogle kritiske punkter. For at opnå vellykkede resultater, skal følgende overvejes.
1. calcium tolerance: historisk, calcium tolerance af voksen cardiomyocytes var en af de mest kritiske faktorer, som fører til en vellykket dyrkning og dyrkning af voksen cardiomyocytes1,7, 8. nu til dags, protokoller er etableret til sikre dyrkning under fysiologiske calcium betingelser1,3. Dette manuskript viser indflydelse af en ændret intracellulære calcium koncentration på kvaliteten af isolerede ARVC. Ionomycin, hvilket øger intracellulære calcium koncentrationer, forårsaget en betydelig nedgang i spredning og en betydelig stigning i antallet af cardiomyocytes med et usædvanligt udseende. Desuden, det forårsagede en downregulation af de vigtigste markører for hjerte de - og re - differentiation: β-MHC, OSM og Swiprosin-1. Derfor hæmmer ændre den intracellulære calcium koncentration under dyrkningen ARVC evne til at tilpasse sig nye miljøer. Selv om nogle ARVC var i stand til at sprede og tilpasse (9.87 ± 2,77% af alle optalte ARVC; Figur 5), en nøjagtig undersøgelse af ARVC under disse forhold er ikke muligt. Derfor, for en præcis isolering og dyrkning af ARVC bør en etableret calcium protokollen anvendes. Derudover bør det sikres, at ingen af de undersøgte behandlinger forstyrre calcium hæmostase af ARVC.
2. collagenase: der findes forskellige batches af collagenase. Hver batch viser forskelle i kvalitet og effektivitet1. Forfatterne anbefaler derfor, bestilling og afprøvning prøver af forskellige partier. Desuden bruges tidspunktet for fordøjelsen og mængden af collagenase af hver ny batch behov skal vurderes særskilt. I overensstemmelse hermed, koncentration og tid med fordøjelsen i protokollen beskrevet kan variere lidt til andre protokoller.
3. tid indtil hjertet perfusion: for at sikre en høj kvalitet af ARVC, tiden mellem udvinding hjertet fra kroppen og starten af perfusion med Langendorff system bør være så kort som muligt. En længere tid forårsager skader på hjertet og resulterer i et større antal ikke-levedygtige ARVC.
Derudover opvarmning perfusion løsning under perfusion og fordøjelse i 5 minutter efter hakning væv er afgørende for at give et godt resultat. For at undgå unødvendig beskadigelse af biologisk væv, skal det håndteres omhyggeligt på all-time point. Desuden, det bør påpeges, at behandling med OSM eller lavere koncentrationer af FCS også aktiverer ARVC-de og re differentiate4,10,18,,19. Men uden disse nærende behandlinger, ARVC degenereret inden for et par dage2.
Afslutningsvis, er isolering og dyrkning af ARVC en følsom analysemetode, der tilbyder en bred vifte af muligheder for at undersøge adfærd af voksen cardiomyocytes udelukkende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De viste resultater er en del af ph.d.-afhandling af Franziska Nippert.
Acknowledgments
Forfatterne takke Nadine Woitasky og Peter Volk for teknisk bistand. Derudover, takke forfatterne fru Claudia Lorenz (medicinsk forfatter, ACCEDIS) for hendes hjælp til at forberede håndskriftet. Dette manuskript blev støttet økonomisk af DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -D. Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , Springer International Publishing AG Switzerland. (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. Fabbro, D., McCormick, F. 290, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P.
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , Garland Science Taylor and Francis Group. New York, NY. (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
