Summary
线虫线虫(线虫) 是研究轴突和细胞内转运的良好模型。在这里, 我描述了一个协议的在体内记录和分析轴突和 intraflagellar 运输在C. 线虫。
Abstract
轴突运输和 intraflagellar 转运 (IFT) 是轴索和纤毛形态发生和功能的关键。驱动超家族蛋白和蛋白是分别调节顺和逆行转运的分子马达。这些马达使用微管网络作为路轨。线虫线虫(线虫) 是研究轴突转运和 IFT的一个强有力的模型有机体。在这里, 我描述了一个协议, 以观察轴突运输和 IFT 在生活中的C. 线虫。运输货物可以通过使用荧光蛋白 (如绿色荧光蛋白 (GFP)) 标记货物蛋白质来可视化。C. 线虫是透明的, 而 GFP 标记的货物蛋白可以在特定细胞的细胞特异促进剂下表达。活蠕虫可以通过微10% 琼脂糖凝胶固定, 而不会杀死或麻醉蠕虫。在这种情况下, 货物的运动可以直接观察到的轴突和纤毛的生活线虫没有解剖。这种方法可用于观察任何细胞的任何货物分子通过修改目标蛋白和/或他们所表达的细胞。大多数基本的蛋白质, 如分子马达和适配器蛋白, 参与轴突运输和 IFT 是保存在C. 线虫。与其他模型生物体相比, 突变体可以在C. 线虫中更容易获得和维护。将此方法与各种C. 线虫突变体结合, 可以阐明轴突转运和 IFT 的分子机制。
Introduction
活细胞成像是分析细胞内转运的重要工具。在神经元细胞生物学中, 用活细胞成像分析轴突转运是了解神经元功能和形态发生1的必要条件。轴突运输缺陷的基础上几个神经退行性疾病2。驱动超家族蛋白和蛋白进行轴突转运 anterogradely 和逆行, 分别为1,2。
纤毛是另一个细胞室, 其中微管网络和贩卖机械是高度发达的3。蛋白质合成机械没有在纤毛中定位, 这意味着纤毛蛋白必须从细胞质输送到纤毛的尖端。纤毛特异性驱动和蛋白, 分别称为 kinesin-2 和细胞质 dynein-2, 运输的成分纤毛4, 在一个现象称为 intraflagellar 运输 (IFT)5。IFT 的损害导致一系列疾病称为 ciliopathies6。因此, 需要对 IFT 机制进行活体细胞成像分析, 以了解纤毛形成的基本机制和发病机理。
线虫线虫(线虫) 是研究轴突传输和 IFT7、8、9的好模型。为了观察 IFT,衣藻已被广泛用作模型生物体56。由于衣藻是一个单细胞生物体, IFT 与衰老、神经元功能和行为的关系将难以分析。此外, 诸如 CRISPR/Cas9 等基本遗传技术尚未应用到衣藻。在高模型生物体中, 如小鼠和果蝇, 轴突转运和 IFT 的中断经常导致致命的表型, 因为轴突转运和 IFT 对动物的形态发生和稳态至关重要10, 11。在小鼠的情况下, 细胞培养和转染一般需要观察轴突运输和 IFT, 这需要很多技能和大量的时间12,13。此外, 许多重要的生理环境可能会失去在培养细胞和细胞系。因为神经系统对于蠕虫的生存来说不是必需的, 所以轴突运输或 IFT 被破坏的线虫突变体通常不是致命的7、9、14。轴突运输和 IFT 可以直接观察在体内没有解剖, 因为C. 线虫是透明的, 因此很容易观察 GFP 标记标记。
有几种协议可以固定C. 线虫, 例如使用微流体设备15、带有麻醉的琼脂糖垫16或微17。麻醉的纳入可能抑制神经元的贩运事件15。微流控装置方法的一个明显的缺点是, 准备一台流控装置并不总是容易的。相反, 用琼脂糖垫和微固定是一种方便和简单的方法来执行时间推移成像在C. 线虫。在这里, 我描述这个基本的协议, 以固定的线虫和可视化轴突运输和 IFT在体内在线虫.与其他方法相比, 这里所描述的方法不需要特殊设备, 而且更便宜、更容易执行。
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Protocol
1. 样品制备
- 使用转基因方法生成转基因的 线虫的兴趣 18 。或者, 从 线虫 遗传学中心获得合适的菌株 (CGC)。为了可视化突触囊泡前体的轴突转运, 请使用转基因线 wyIs251 [ Pmig-13::gfp::rab-3 ] 7 。要观察 IFT, 获得转基因线 mnIs17 [ osm-6::gfp ] 19 。这些菌株在本协议中使用.
注: 无论是外阵列, 基因组整合, 甚至 GFP 基因作品。要减少背景信号, 请使用特定于细胞的启动子, 而不是泛神经启动子.
注意: 蠕虫的维护在其他协议 20 中有说明。在线虫生长培养基 (NGM) 板 (1.7% (w/v) 琼脂糖上, 在 Escherischia 大肠杆菌 OP50 饲养者的草坪上维持菌株. 50mM 氯化钠, 0.25% (含钒) 蛋白胨, 1 毫米 CaCl 2 , 5 毫克/毫升胆固醇, 25 mm, 2 PO 4 , 1 mm MgSO 4 在 60 mm 直径的塑料碟上) 在20和 #176; C. - 在20和 #176 中生长蠕虫; C 在 NGM 板上, 到蠕虫的任何生命周期阶段.
注意: 在任何阶段都可以观察轴突运输和 IFT。晚 L4 对年轻成人是一个很好的积极控制, 因为多个出版物使用了这些阶段和可视化的贩运活动 14 , 21 , 22 , 23 .
2。10% 琼脂糖的制备
注意: 许多供应商提供类似的产品, 如琼脂、琼脂粉和琼脂糖。使用电泳级琼脂糖 (凝胶强度和 #62; 1200 克/厘米 2 )。廉价的琼脂粉不起作用, 因为产生的凝胶不够坚固, 无法固定蠕虫.
- 在玻璃管 (1.5 cm x 10.5 厘米) 的4毫升蒸馏水 (DW) 中混合0.4 克琼脂糖。在玻璃管上盖上盖子以避免蒸发.
- 将玻璃管放在95和 #176 上; C 热块90分钟。此外, 准备另一玻璃管 (1.5 厘米 x 10.5 厘米) 填充 DW, 并保持在95和 #176; c. 在95和 #176 中放置一个巴斯德吸管; c DW ( 图 1 a )。在琼脂糖管中会出现很多小气泡, 溶液混浊。离开它, 直到解决方案变得清晰。然后, 移混合, 直到琼脂糖溶液变得均匀.
注: 微波不能用于制备10% 琼脂糖溶液时, 由 DW 和琼脂糖。微波导致的小气泡阻止了琼脂糖的融化。然而, 固化10% 琼脂糖凝胶可以很容易地融化再次使用微波。含有10% 琼脂糖凝胶的玻璃管可以提前准备, 储存在4和 #176; C 至少6月。如果这样做, 在需要时用微波炉熔化库存, 并从本协议的步骤3开始.
注: 琼脂糖在95和 #176 时逐渐失去凝固的能力; C 长时间或反复凝固和熔化后。如果发生这种情况, 准备新的10% 琼脂糖.
3。琼脂糖垫的制备
- 使用在步骤2.2 中准备的预热的巴斯德吸管, 在 76 x 22 mm 幻灯片上放置2滴10% 琼脂糖.
- 快速覆盖第二个 76 x 22 mm 2 在琼脂糖滴凝固之前滑动, 如图 1 B 所示, 然后向下推第二张幻灯片以拼合琼脂糖溶液。厚度应为 0.5-1 mm.
- 快速冲洗移95和 #176 的巴斯德吸管; C DW 向上和向下直到琼脂糖溶液被洗掉。否则, 吸管会被琼脂糖凝胶堵塞。将吸管放在95和 #176; C DW.
- 等待1分钟。琼脂糖垫形成并且变得多云。然后, 手动滑动幻灯片 ( 图 1 C ).
4。安装蠕虫
注意: 即使是少量的蠕虫运动也会阻碍良好的观察。左旋咪唑传统上用于防止在琼脂糖垫 24 , 25 上的蠕虫移动。然而, 左旋咪唑在 C. 线虫 中抑制神经元受体, 因此可能影响神经元中的贩运事件 15 。使用聚苯乙烯微描述存在一个好的替代 17 .
- 在装有可镜像透视的立体声显微镜下, 将30转基因蠕虫转移到一个新的 NGM 板上, 用铂丝镐来表示不带细菌的适当标记.
注: 白金线镐是由铂丝和巴斯德吸管 (5 英寸), 铂金丝的尖端被夷为平地。在 Wormbook (http://www.wormbook.org) 中描述了铂丝采摘和处理这些蠕虫的准备工作. - 离开盘子1分钟. 细菌会自动从蠕虫的表面移除, 因为蠕虫在无细菌的 NGM 琼脂糖凝胶上移动.
- 将 0.5-1.0 和 #181; 将 2.6% 100 nm 直径的聚苯乙烯微在水中放在琼脂垫上 ( 图 1 D )。将10-20 蠕虫从无菌 NGM 板转移到微。使用铂线拾取来除去和传播蠕虫, 以避免蠕虫体的重叠 ( 图 1 E ).
- 应用 22 x 40 mm 2 片 ( 图 1 F )。轻轻推, 以消除气泡, 但避免粉碎蠕虫。该示例现在已准备好进行成像.
注: 由于不进行麻醉, 蠕虫只由琼脂垫、聚苯乙烯微和片 17 产生的摩擦力来固定。饲养细菌的存在和/或过多的溶液会使摩擦力减弱.
注意: 不同大小的片 ( 例如 , 22 x 22 mm 2 , 18 x 18 mm 2 ) 工作。然而, 更大的片可以防止浸入水或油从物镜泄漏到样品期间的观察.
5。观察
注意: 对于每个显微镜系统和照相机, 适当的成像参数 (激光功率、增益、分、 等 ) 将有所不同。在这里, 一个 widefield 显微镜配备了旋转磁盘共焦扫描仪和数字 CCD 相机使用.
- 将舞台温度控制设置为20和 #176; c, 或将室温调整为20和 #176; c.
- 将样本幻灯片放在显微镜阶段。使用 100x (数值孔径 = 1.3 或更好) 物镜.
- 查找 图 2 A (用于 wyIs251 和轴突传输) 或 图 2 B (用于 mnIs17 和 IFT) 作为正控制的区域.可以分析其他区域以及 22 .
- 设置参数 (CCD 增益 = 200, 分 = 1 或 2, 激光功率在 488 nm = 1.0-1.3 兆瓦)。执行4帧/秒的时间间隔记录, 最多1分钟将文件保存为多-TIFF 格式.
注意: 如果 GFP 信号消失, 很难继续观察 GFP::RAB-3 或 OSM-6::GFP 三十年代, 激光功率太强。在这种情况下, 减少激光功率。反之, 如果没有记录水泡运动, 激光功率太弱。在这种情况下, 增加激光功率. - 观察不同的蠕虫并重复5.3 和5.4。观察可以持续多达20分钟, 但每个蠕虫应该只记录一次, 以避免影响 photo 损坏.
注意: 蠕虫已被观察至少20分钟没有明显的缺陷 7 , 27 , 28 。更长的观察也许是可能的, 但避风港和 #39; 没有被测试。神经元死亡的一个明显的迹象是神经元形态的变化, 如突起肿胀。由于弱 GFP 信号可以看到在轴突和树突在两个 wyIs251 和 mnIs17 , 突起形态学可以很容易地检查只看在轴突或树突。神经元形态学在 图 2 中显示. - 生成影片文件.
- 使用斐济软件打开多 TIFF 文件。转到文件和 #62; 打开然后选择在步骤5.4 中保存的多 TIFF 文件.
注: 斐济可下载 jttps://斐济。图像 J 和插件也可以用来生成 kymographs。如果这样做, 请按照所选插件的相关说明进行操作. #160; - 单击 #34; 矩形选择和 #34; 按钮 ( 图 3 , 箭头), 并通过绘制矩形来选择感兴趣的区域使用计算机鼠标 ( 图 3 a 中的黄色矩形)。转到图像和 #62; 堆栈和 #62; 工具和 #62; 使 Substacks 并选择影片中包含的切片编号。生成 substack.
- 通过单击并转到图像和 #62 来激活 substack 窗口; 调整和 #62; 亮度/对比度。一个调整亮度和对比度的窗口出现了。在窗口中, 将顶部 (最小) 向右滑动, 使背景信号消失, 第二个顶栏 (最大) 向左, 以便在背景下可以看到移动的泡和颗粒.
- 转到图像和 #62; 堆栈和 #62; 时间压模。由于影片在步骤5.4 的4帧/秒录制, 时间间隔为0.25 秒。因此, 类型和 #34; 0.25 和 #34; 间隔.
- 从 "文件" 菜单 (影片1和 2) 中选择 "保存为" 和 "#62", 然后生成影片文件.
注意: 通过使用适当的插件, 您可以将文件保存为其他格式, 如和 #34; mpeg4 和 #34; 或 #34; #34; 文件.
- 使用斐济软件打开多 TIFF 文件。转到文件和 #62; 打开然后选择在步骤5.4 中保存的多 TIFF 文件.
- 生成 kymographs.
- 再次使用斐济软件打开原始影片文件, 并重复步骤5.6.2 和5.6.3 以调整亮度和对比度.
- 单击和 #34; 分段行和 #34; ( 图 3 B , 箭头)。使用鼠标, 绘制沿纤毛或轴突 (黄线, 在 图 3 B ) 的分段线.
- 转到分析和 #62; 多 Kymograph 和 #62; 多 Kymograph ( 图 3 C )。将出现 "线条宽度" 窗口 ( 图 3 D )。类型和 #34; 3 和 #34; 在 "线宽" 窗口中, 单击 "确定" ( 图 3 D ).
- Kymograph 窗口已创建。以 TIFF 或 JPEG 格式保存图像.
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Representative Results
DA9 神经元轴突转运
使用wyIs251线, 顺和逆行轴突运输 GFP::RAB-3 可以同时记录在 DA9 运动神经元。DA9 神经元近端轴突的顺和逆行转运的平均速度分别为1.8 和2.6 微米/秒,22。移动的泡的数量是大约0.03 和0.018 每μ m 轴突每 s。因此, 三十年代观察10μ m DA9 轴突使用100x 透镜, 你能发现大约9和5移动的泡在轴突 (图 4和电影 1)。如果没有水泡运动可以观察, 它是可能的激光力量是太微弱的。除了长距离跑外, 还可以记录小泡池的短距离运动 (电影 1)。有些泡在这些泡池停止, 而其他的从那里离解7,23。这些参数可以被监测和用于分析突变表型。
尾神经元的 IFT
纤毛在C. 线虫(图 2B) 中被本地化为树突尖端。mnIs17应变表示 GFP 标记的 OSM-6, 其中一个 IFT 子单元29。OSM-6 是用头和尾神经元19表示的。当许多头纤毛被标记由mnIs17时, 仅二个纤毛在尾巴神经元清楚地被观察。因此, 观察这些纤毛比头纤毛更容易 (参见讨论)。OSM-6::GFP 是弥漫在神经元细胞质, 如发现在轴突, 细胞体, 和枝状突起。然而, 在纤毛中, OSM-6::GFP 被集中于纤毛, 并在运动粒子中被吸收。其长度为6.5 μ m。顺 IFT 是双相8,9。顺 IFT 的速度在纤毛的中间和远端段分别为0.7 和1.3 微米/秒 (图 5和电影 2)。
图 1: 示例准备的演示.(A) 热 DW、巴斯德吸管和10% 琼脂糖在热块上。(B 和 C)琼脂糖垫的制备: 在幻灯片 (B) 之间形成琼脂糖垫。上部幻灯片在琼脂糖垫表单 (C) 之后被移除。(D) 示意图, 演示如何将聚苯乙烯珠解决方案放在琼脂糖垫上。(E) 示意图, 演示如何使用铂金丝镐将蠕虫放入聚苯乙烯珠溶液中。(F) 将片 (22 x 44 mm2) 放在琼脂糖垫上。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 成像区域.(A) DA9 和 VA12 神经元的示意图绘制以及wyIs251的代表图像。在 DA9 神经元中, 腹轴突、合和近端轴突没有成熟的突触。但是突触囊泡前体通过这些轴突区域从细胞体转移到突触。应观察的区域由方框显示。(B) 对神经和 PHB 神经元及其纤毛的示意图绘制。应观察的区域由方框显示。刻度条 = 10 μ m。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 使用斐济软件生成电影和 kymographs.(A) 单击 "矩形选择" 按钮 (箭头), 然后通过绘制矩形 (黄色框) 来生成 substacks, 选择要聚焦的区域。(B) 单击 "分段行" 按钮 (箭头), 并使用鼠标 (黄色线条) 沿纤毛绘制分段线。(C) 选择 "分析"、"多 Kymograph" 和 "多 Kymograph" 来启动插件以生成 kymographs。(S) 输入线宽, 单击 "确定" 并生成 kymographs (图 5和图 7)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 突触性囊泡前体轴突转运的典型 kymograph.在 DA9 神经元的近 asynaptic 区观察到了 GFP::RAB-3 运动, kymograph 在斐济多 kymograph 产生。水平和垂直条形图分别表示长度和时间。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: IFT 的代表 kymograph.OSM-6::GFP 被观察到在临时和 PHB 纤毛和这 kymograph 是由贩卖事件在其中任一其中一个产生。kymograph 是由斐济的多 kymograph 产生的。水平和垂直条形图分别表示长度和时间。请单击此处查看此图的较大版本.
电影 1: 突触囊泡前体轴突转运的代表性电影.在 DA9 神经元的近 asynaptic 区观察到 GFP::RAB-3 运动。GFP::RAB-3 被纳入突触囊泡前体和运输。顺和逆行轴突运输都记录在案。一些水泡停止, 但重新开始。这部电影被记录在4帧/秒, 并在15帧/秒播放. Scale 酒吧 = 5 μ m。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.
电影 2: IFT 的代表性电影.在 OSM-6::GFP 和 PHB 纤毛中观察到。OSM-6::GFP 被并入 IFT 复合体, 沿纤毛移动。这部电影被记录在4帧/秒, 并在15帧/秒播放. 刻度条 = 5 μ m。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.
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Discussion
关于现有方法的限制
本文所描述的方法进行了优化, 以观察快速事件, 如轴突运输和 IFT。因此, 固定化比较长的潜伏期更有优先权。虽然我们已经能够观察贩运活动至少20分钟没有明显的摄动, 这种方法可能并不总是适合观察慢事件需要更长的观察, 如轴突伸长和细胞迁移。对于较长的观测, 需要通过减少琼脂糖的百分比 (即, 增加水以避免干燥和减少可能造成损坏的压力) 来优化条件。或者, 上述15以上描述的微流控装置或使用琼脂糖垫和麻醉的固定化蠕虫可能更适合16 , 同时应仔细评估副作用。
协议中的关键步骤
为了得到足够的观察, 标记是至关重要的。标记需要被合并成囊泡或颗粒, 并有足够的亮度。可以使用外数组或集成行。对于 DA9 神经元突触囊泡前体的轴突传输的可视化, wyIs251应变是有用的7,23。jsIs821在某些研究中用于观察 mechanosensory 神经元的轴突转运,26,27。当其他神经元被分析, 突触囊泡蛋白应表达在感兴趣的神经元使用细胞特异促进剂。这些发起人应该足够强大。RAB-3 和 SNB-1 被广泛用于标记突触囊泡前体22,23,26。为了观察 IFT, IFT 络合物的成分应该被标记。作为一个正控制, mnIs17应变是一个很好的选择29。纤毛从8细胞 (ASE, 助理, ASI, amphid, 灰, 问, ADF, 和 ADL) 捆绑在一起, 而纤毛从2细胞 (临和 PHB) 捆绑在尾巴 (phasmid)。由于 OSM-6::GFP 是在mnIs17的所有纤毛神经元中表达的, 因此可能难以在头纤毛中详细分析 IFT。然而, 在尾区, 只有临时的和 PHB 的神经元标记和 IFT 在每个细胞可以很容易地解决。其他 IFT 蛋白标记的荧光蛋白可以用来观察 IFT21,28。如果一个人希望分析大脑神经元, 细胞特异的促进剂将是有用的。虽然头纤毛有不同的形态, 运输事件可以记录29。通过将突变体与这些标记交叉, 可以对轴突转运和 IFT 中的任何基因的功能进行体内分析。可以分析的参数已在以前的工作22,23,26,27中描述。GFP 是最好和最主要的选择。mCherry 和 tdTomato 也可以使用22, 但是, mCherry 比 GFP 更暗。tdTomato 是一个串联二聚体和大于单体荧光蛋白, 这有时影响融合蛋白的动力学30。因此, 在使用 tdTomato 时, 应谨慎地分析和解释结果。mScarlet, 一个明亮的单体红色荧光蛋白, 最近已经开发, 是一个替代选择31。
当旋转圆盘共焦显微镜被广泛用于观察轴突传输和 IFT7,21时, 设备很昂贵, 在某些研究环境中可能难以访问。然而, 这些现象也可以记录和分析, 在线虫使用标准的荧光显微镜, 如果配备高 NA 透镜, 因为c. 线虫是一种小而透明的动物, 易于观察。
未来应用
通过类似的固定化方法在这里描述, IFT 是观察在单分子分辨率在体内32。此外, 还开发了几种超分辨率显微镜。可以直接应用本文所描述的超分辨率显微分析方法。根据我的经验, Airyscan33的快速模式非常适合于分析 IFT。理论上, 一个旋转圆盘超分辨率显微镜 (SDSRM) 将是一个很好的选择, 以及34。最后, 通过结合突变文库和这些新的技术, 这里描述的方法应该是有用的, 以澄清分子机制的轴突运输和 IFT 的在体内。
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Disclosures
作者没有什么要透露的。
Acknowledgments
作者对 Dr. 麻子杉本 (东北大学) 的有益讨论深表谢意。wyIs251是 Dr. 康沈 (斯坦福大学) 的一份慷慨礼物。mnIs17由 CGC 提供, 由 NIH 研究基础设施项目办公室 (P40 OD010440) 出资。这项工作得到了 jsp KAKENHI 赠款 #17H05010 和 #16H06536 和第一三基金会, 脑科学基金会和内基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
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