Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מודל טוב ללמוד תחבורה עצב, תאיים. . הנה, אני מתארת פרוטוקול ויוו הקלטה וניתוח התחבורה עצב, intraflagellar C. elegans.
Abstract
עצב תחבורה ותעבורה intraflagellar: (אי) חיוניים עבור מורפוגנזה האקסון ואת cilia ותפקוד. קינזין superfamily חלבונים דינאין המנועים המולקולריים המסדירים anterograde ותעבורה רטרוגרדית, בהתאמה בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מנועים אלה להשתמש microtubule רשתות מסילות. Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא אורגניזם מודל חזק ללמוד תחבורה עצב ו: אי ויוו. כאן, אתאר פרוטוקול להתבונן תחבורה עצב,: אי חי C. elegans. ניתן לאבחן מטען מועבר על-ידי תיוג חלבונים מטענים באמצעות חלבונים פלורסנט כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). C. elegans הוא שקוף, יכול לבוא לידי ביטוי מתויג GFP מטען החלבונים תאים מסוימים תחת תאים ספציפיים היזמים. תולעים חיים ניתן לתקן באמצעות גרגרי על 10% agarose ג'ל מבלי להרוג או מאלחש את התולעים. בתנאים אלה, תנועת המטען יכול להיות ישירות שנצפו אקסונים ו cilia החיים C. elegans ללא ניתוח. בשיטה זו ניתן ליישם את ההתבוננות בכל מולקולה מטען תאים על-ידי שינוי החלבונים היעד ו/או את התאים שהם באים לידי ביטוי. חלבונים הבסיסיות ביותר כגון המנועים המולקולריים, מתאם חלבונים המעורבים: אי ולהזמנת עצב נשמרים C. elegans. בהשוואה לאורגניזמים אחרים מודל, מוטציות יכול להיות שהושג ומתוחזק בקלות רבה יותר C. elegans. שילוב של שיטה זו עם מוטציות C. elegans שונים יכול להבהיר את המנגנונים המולקולריים תחבורה עצב,: אי.
Introduction
תא חי הדמיה הוא כלי חיוני עבור ניתוח התחבורה תאיים. בביולוגיה דופאמינרגיים, ניתוחים של תחבורה עצב תאים חיים הדמיה חיוניים להבנת תפקוד ואת מורפוגנזה עצביים1. פגמים תחבורה עצב ביסוד הפרעות ניווניות מספר2. קינזין superfamily חלבונים ו דינאין נושאים תעבורה עצב anterogradely והן retrogradely, בהתאמה1,2.
Cilia הם עוד תא הסלולר שבה microtubule רשת ומכונות לסחר בבני אדם הם מפותח מאוד3. מכונות סינתזת חלבון הוא לא מקומי ב- cilia, מה שאומר חלבונים ciliary חייב להיות מועבר מן הציטופלסמה אל העצות cilia. קינזין cilia ספציפיים דינאין, קראו קינזין-2 ו- cytoplasmic דינאין-2, בהתאמה, להעביר את הרכיבים של cilia4, תופעה הנקראת intraflagellar תחבורה: (אי)5. ירידת ערך של: אי גורמת קשת של מחלות שנקרא ciliopathies6. לפיכך, ניתוח של המנגנון: אי על ידי הדמיה תא חי נדרש להבין מנגנונים בסיסיים של היווצרות ciliary ו פתוגנזה.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מודל טוב ללמוד תחבורה עצב ו: אי-7,-8,-9. להתבונן: אי, Chlamydomonas כבר בשימוש נרחב כמו אורגניזם מודל5,6. כמו Chlamydomonas הוא אורגניזם חד־תאיות, קשרי הגומלין בין: אי עם ההזדקנות, תפקוד התנהגות יהיה קשה לנתח. בנוסף, טכניקות גנטיים חיוניים כגון CRISPR/Cas9 לא הוחלו על Chlamydomonas. מודל עילאיים, כגון עכברים דרוזופילה, הפרעה תחבורה עצב,: אי לעיתים קרובות גורמת פנוטיפים קטלני משום תחבורה עצב,: אי חיוניים עבור מורפוגנזה והומאוסטזיס של חיות 10, 11. במקרה של עכברים, תרבית תאים, תרביות תאים בדרך כלל צורך להתבונן תחבורה עצב,: אי, אשר דורש מיומנויות רבות זמן רב12,13. בנוסף, הרבה חשוב בהקשר פיזיולוגיים עלול ללכת לאיבוד בתוך תאים בתרבית, שורות תאים. . כי מערכת העצבים אינה חיונית להישרדותו של התולעים, C. elegans מוטציות תחבורה עצב או: אי אילו הם שיבשו אינן קרובות קטלני7,9,14. תחבורה עצב,: אי ישירות נראים ויוו ללא ניתוח כי C. elegans הוא שקוף, ולכן קל להתבונן סמני מתויג GFP.
ישנם מספר פרוטוקולים לשתק C. elegans, כגון באמצעות מכשיר microfluidic15, רפידות agarose עם הרדמה16, או גרגרי17. ההכללה של הרדמה עלול לעכב את האירועים סחר נוירונים15. חיסרון ברור של שיטת microfluidic-התקן היא הכנת התקן microfluidic אינה תמיד קלה. במקום זאת, קיבעון על-ידי agarose כריות וגרגרי היא דרך נוחה וקלה לביצוע זמן לשגות הדמיית C. elegans. כאן, אתאר את פרוטוקול בסיסי זה כדי לשתק C. elegans והמחש תחבורה עצב,: אי ויוו ב C. elegans. בהשוואה לשיטות אחרות, השיטה המתוארת כאן אינו מצריך ציוד מיוחד, הרבה יותר זול וקל לביצוע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הדוגמא
- צור הטרנסגניים C. elegans זן עניין באמצעות מתודולוגיות הטרנסגניים 18. לחלופין, להשיג זנים המתאימים של מרכז הגנטיקה Caenorhabditis (CGC). כדי להמחיש תחבורה עצב של שלפוחית סינפטית מבשרי, השתמש את קו הטרנסגניים wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. להתבונן: אי, להשיג את mnIs17 [osm-6::gfp] הטרנסגניים קו 19. זנים אלו נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה.
הערה: גם מערך extrachromosomal, אינטגרציה הגנומי או אפילו GFP טוק-אין עבודות. כדי לצמצם את הרקע אותות, להשתמש היזמים תא ספציפי, ולא היזמים פאן עצבית.
הערה: תחזוקה של תולעים מתואר פרוטוקולים אחרים 20. זנים היו מתוחזקים על המדשאות של החיידק Escherischia OP50 מזין על גידול נמטודות צלחות (NGM) בינונית (1.7% (w/v) agarose, 50 מ מ NaCl, peptone 0.25% (w/v), 1 מ"מ CaCl 2, 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול, 25 מ מ ח' 2 PO 4, 1 מ מ MgSO 4 על מנות פלסטיק קוטר 60 מ"מ) בגיל 20 מעלות צלזיוס - לגדול תולעים ב 20 מעלות צלזיוס על צלחות NGM כדי בכל שלב במחזור החיים של התולעים.
הערה: אחד ניתן להבחין תחבורה עצב והן: אי בכל שלב. L4 מאוחר עד בוגר צעיר הוא פקד חיובי טוב כי פרסומים מרובים להשתמש אלה שלבים ודמיינו סחר אירועים 14 , 21 , 22 , 23.
2. הכנה של 10% Agarose
הערה: ספקי רבים לספק מוצרים דומים כגון אגר אגר אבקות, agarose. השתמש agarose כיתה אלקטרופורזה (ג'ל חוזק > 1200 גרם/ס"מ 2). אבקות אגר זול לא עובדים כי הג'ל שנוצר אינה חזקה מספיק כדי לשתק תולעים.
- Agarose 0.4 גרם מיקס 4 מ"ל מים (DW) שפופרת זכוכית (1.5 ס"מ x 10.5 ס"מ) מזוקקים. לשים מכסה על צינור זכוכית כדי למנוע אידוי.
- שמכניסים את נקז זכוכית על גוש חום 95 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. בנוסף, להכין עוד מבחנה (1.5 ס"מ x 10.5 ס"מ) מלא DW, לשמור את זה 95 מעלות צלזיוס pipet של פסטר הכניס 95 ° C DW ( איור 1 א'). ניתן לראות הרבה בועות קטנות בצינור agarose, הפתרון צריך להיות עכורים. . תשאיר את זה עד הפתרון נעשה ברור ואז לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה עד הפתרון agarose הופך הומוגניות.
הערה: מיקרוגל לא ניתן להשתמש כדי להכין 10% הפתרון agarose כאשר עשה מ ד ו ו agarose. בועות קטנות הנגרמת על ידי מיקרוגל למנוע agarose נמס. עם זאת, הקרושה 10% agarose ג'ל יכול בקלות להיות מומסת שוב באמצעות מיקרוגל. צינורות זכוכית המכיל 10% agarose ג'ל יכול להיות שהוכנו מבעוד מועד ומאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים. אם כך להמיס את המניות באמצעות מיקרוגל בעת הצורך ולהתחיל שהוזכר בשלב 3 של פרוטוקול זה.
הערה: Agarose מאבד בהדרגה את היכולת לגבש אם מודגרות ב 95 מעלות צלזיוס במשך זמן רב או לאחר התמצקות חוזרות ונשנות, התכה. אם זה קורה, להכין חדש 10% agarose.
3. הכנת משטח Agarose
- שימוש את pipet פסטר ומחוממת מוכן בשלב 2.2, במקום 2 טיפות של 10% agarose על שקופית 76 x 22 מ מ.
- במהירות לכסות עם שקופית 2 76 x 22 מ מ השני לפני הירידה agarose עפור כפי שמוצג באיור 1 B ולדחוף למטה על השקופית השניה כדי לשטח את הפתרון agarose. העובי צריך להיות 0.5-1 מ מ.
- במהירות לרוקן את פיפטה פסטר מאת pipetting 95 ° C DW למעלה ולמטה עד הפתרון agarose נשטף. אחרת, pipet סתומים על ידי ג'ל agarose. להשאיר את עומד פיפטה 95 ° C DW. חכה
- 1 דקות. משטח agarose טפסים והופך להיות מעונן. לאחר מכן, להחליק את השקופיות בנפרד ביד ( איור 1 ג).
4. הרכבה של תולעים
הערה: כמויות קטנות אפילו בתנועת תולעת למנוע בתצפית. Levamisole באופן מסורתי שימש כדי למנוע תנועה תולעת agarose pad 24 , 25. עם זאת, Levamisole מעכב קולטנים עצביים C. elegans, ולכן עשוי להשפיע על האירועים סחר נוירונים 15. באמצעות גרגרי פוליסטירן תיאר אז היא חלופה טובה 17.
- תחת מיקרוסקופ סטריאו מצויד transillumination מראה slidable, העברת ~ 30 תולעים הטרנסגניים לבטא את סמני המתאים כדי NGM החדש צלחת ללא חיידקים באמצעות חוט פלטינה לבחור.
הערה: איסוף חוט פלטינה פלטינה וארץ פסטר פיפטה (5 אינץ '), ונוצר שוטח את קצה החוט פלטינה. הכנת הפיקים תיל פלטינה וטיפול תולעים עם אלה מתוארים את Wormbook (http://www.wormbook.org). - להשאיר את הצלחת עבור מינימלית 1 חיידקים הסרה אוטומטית של המשטחים של תולעים כמו התולעים הלאה NGM agarose ג'ל ללא חיידקים. µL
- לשים 0.5-1.0 ירידה של 2.6% 100 ננומטר קוטר פוליסטירן גרגרי במים על גבי משטח אגר ( איור 1 D). העבר 10-20 תולעים מהצלחת NGM נטולי חיידקים גרגרי. ירידה וכפולה התולעים באמצעות הכבל פלטינה לבחור להימנע חופפים של תולעת גופים ( איור 1 E)-
- להחיל על 22 x 40 מ מ 2 coverslip ( איור 1 F). לחצו בעדינות כדי להסיר בועות אוויר, אך להימנע תולעים מוחצת. המדגם מוכן כעת לדימות.
הערה: מכיוון מנוהלת בלי הרדמה, תולעים קבועים רק על ידי כוח חיכוך שנוצר על ידי משטח אגר, גרגרי פוליסטירן, coverslip 17. הנוכחות של חיידקים מזין ו/או פתרון מידי יגרום את כוח חיכוך חלש יותר.
הערה: עבודה בגדלים שונים coverslips (למשל, 22 x 22 מ מ 2, 18 פרק 18 מ מ 2). עם זאת, coverslips גדול יכול למנוע טבילה במים או שמן מן המטרה העדשה דולפים לתוך דגימות במהלך הצפייה.
5. תצפית
הערה: פרמטרים הדמיה מתאימים (עוצמת הלייזר, רווח, binning, וכו ') יהיה שונה עבור כל מערכת המיקרוסקופ והמצלמה. כאן, משמש מיקרוסקופ widefield מצויד ספינינג דיסק קונפוקלי סורק ומצלמה של מצלמות דיגיטלית.
- להגדיר את בקרת טמפרטורה של השלב 20 ° C, או להתאים את טמפרטורת החדר ל- 20 מעלות צלזיוס
- לשים את השקופית מדגם על הבמה מיקרוסקופ. השתמש 100 x (מפתח נומרי = 1.3 או יותר) המטרה עדשה.
- לחפש את האזורים המצוין איור 2 א (עבור wyIs251 ותחבורה עצב) או איור 2 B (עבור mnIs17 ו: אי) כפקדים חיובי . ניתן לנתח תחומים אחרים כמו טוב 22.
- ערכת פרמטרים (CCD רווח = 200, Binning = 1 או 2, עוצמת הלייזר-488 ננומטר = 1.0-1.3 מגה-וואט). לבצע את זמן ההקלטה לשגות-4 מסגרות/s עבור עד 1 מינימלית שומרות קבצים כמו בתבנית mutli TIFF.
הערה: אם GFP אותות נעלמים וזה קשה להמשיך להתבונן GFP::RAB-3 או OSM-6::GFP ל 30 s, עוצמת הלייזר חזק מדי. במקרה זה, להפחית את עוצמת הלייזר. לעומת זאת, אם אין תנועה vesicular מוקלטת, עוצמת הלייזר הוא חלש מדי. במקרה כזה, להגביר את עוצמת הלייזר. - להתבונן תולעת שונה וחזור 5.3 ו- 5.4. התצפיות יכולים להימשך עד 20 דקות, אבל כל תולעת צריך לצרוב פעם אחת בלבד כדי למנוע את ההשפעות של pנזק מרוכז.
הערה: תולעים נצפו לפחות 20 דקות ללא פגמים משמעותיים 7 , 27 , 28. התבוננות יותר ייתכן אבל הייבן ' t כבר נבדק עדיין. סימן ברור של מוות העצבית היא השינוי של מורפולוגיה עצביים כגון נפיחות neurite. כפי שניתן לראות אותות חלשים GFP אקסונים ו דנדריטים, הן wyIs251 והן mnIs17, מורפולוגיה neurite ניתן לבדוק בקלות על ידי פשוט להסתכל על אקסונים או דנדריטים. מורפולוגיה עצביים מוצגת באיור 2. - ליצור קבצי סרט.
- פתוח TIFF מרובה הקובץ באמצעות תוכנה פיג'י. עבור אל הקובץ > פתח ובחר את קובץ TIFF מרובה שנשמר בשלב 5.4.
הערה: פיג'י ניתן להוריד בכתובת jttps://fiji.sc. התמונה J ו תוספים יכול לשמש גם כדי ליצור kymographs. אם כך בצע את ההוראות הרלוונטיות עבור תוסף שבחרת. - לחץ " בחירה מלבנית " לחצן ( איור 3 , חץ) ובחר תחום העניין על ידי ציור מלבן עם עכבר המחשב (מלבן צהוב איור 3 א). עבור אל התמונה > ערימות > כלי > להפוך Substacks ובחר את מספרי פרוסה כלולים בתוך הסרט. נוצר substack.
- הפעל החלון substack על-ידי לחיצה וללכת תמונה > התאם > בהירות/חדות. מופיע חלון כדי להתאים את הבהירות והניגודיות. בחלון, החלק העליון בר (מינימום) ימינה כך האות רקע נעלם והיא השנייה להתעלות על הבר (מקסימום) שמאלה אז זה נעה שלפוחית חלקיקים ניתן לראות היטב מעל הרקע.
- ללכת תמונה > ערימות > זמן סטמפר. כמו בסרט מוקלטת-4 מסגרות לשנייה בשלב 5.4, מרווח הזמן הוא 0.25 s. לפיכך, הקלד " 0.25 " במרווח.
- לייצר קובץ הסרט על-ידי בחירת שמור > AVI מהתפריט קובץ (הסרט 1 ו- 2).
הערה: באמצעות תוספים המתאים, באפשרותך לשמור את הקובץ בפורמטים אחרים כגון " mpeg4 " או " mov " קבצים.
- פתוח TIFF מרובה הקובץ באמצעות תוכנה פיג'י. עבור אל הקובץ > פתח ובחר את קובץ TIFF מרובה שנשמר בשלב 5.4.
- צור kymographs.
- לפתוח את הקבצים המקוריים של הסרט באמצעות תוכנה פיג'י שוב וחזור על שלבים 5.6.2 ו 5.6.3 להתאמת הבהירות והניגוד.
- לחץ " מקוטע בקו " ( איור 3 ב, חץ). באמצעות עכבר, צייר קו מקוטע לאורך האקסון (קו צהוב, איור 3 B) או cilia.
- הולכים לנתח > רב Kymograph > רב Kymograph ( איור 3 ג'). מופיע קו רוחב חלון ( איור 3 ד'). סוג " 3 " Linewidth חלון, לחץ על אישור ( איור 3 ד')- חלון kymograph
- נוצר. לשמור את התמונה בתבנית TIFF או JPEG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תחבורה עצב בנוירונים DA9
באמצעות קו wyIs251 , anterograde והן רטרוגרדית עצב התעבורה של GFP::RAB-3 ניתן במקביל להקליט בנוירון מוטורי DA9. המהירות הממוצעת של anterograde ותעבורה רטרוגרדית ב- proximal הגבי הפעולה באקסון של הנוירון DA9 הוא כ 1.8 ו- 2.6 μm/s, בהתאמה22. המספר של שלפוחית בתנועה הוא 0.03 ועל 0.018 לכל μm של האקסון לכל s. לפיכך, עבור אבחנה s 30 של 10 μm של האקסון DA9 באמצעות עדשה 100 x, אפשר למצוא כ 9 ו-5 לגור שלפוחית הפעולה באקסון (איור 4 ו- 1 סרט). אם אין תנועה vesicular יכול להיות שנצפו, זה אפשרי כי עוצמת הלייזר הוא חלש מדי. בנוסף ריצות ארוכות טווח, ניתן קצרת-טווח התנועה של שלפוחית בריכות מוקלט (1 סרטים). כמה שלפוחית עוצרים ובבריכות שלפוחית, בעוד אחרים מביצועם שם7,23. פרמטרים אלה ניתן, יש להשתמש בה כדי לנתח פנוטיפים מוטציה.
: אי בנוירונים זנב
Cilia המותאמות לשפה הקצה של דנדריטים ב- C. elegans (איור 2B). המתח mnIs17 מבטא GFP מתויג OSM-6, אחד של subunits: אי29. OSM-6 מתבטאת בשני ראש וזנב נוירונים19. בעוד cilia ראש רבים מסומנים על-ידי mnIs17, רק שני cilia הם בבירור נצפו נוירון הזנב. לפיכך, התבוננות cilia אלה קל יותר cilia ראש (ראה גם הדיון). OSM-6::GFP הוא מפוזר בציטופלסמה עצביים כגון כי מצאה האקסון, תאי הגוף ועל דנדריט. עם זאת, ב- cilia, OSM-6::GFP מרוכז cilia, שולבו רדיואקטיבי. האורך של cilia פא ו PHB הם בערך 6.5 μm. : אי Anterograde הוא 8,biphasic9. מהירות anterograde: אי היא על 0.7 ו- 1.3 μm/s המקטעים האמצעי של cilia, בהתאמה (איור 5 ו 2 סרט).
איור 1 : הפגנה של הכנת המדגם. (א) חם DW, פסטר pipet ו- 10% agarose בבלוק חום. (B ו- C) הכנת agarose רפידות: רכיב pad agarose נוצר בין שקופיות (B). השקופית העליונה מוסרת לאחר טפסים pad agarose (ג). שרטוט מציג פתרון חרוז איך פוליסטירן סכמטי (D) הוא לשים על משטח agarose. שרטוט מציג איך שמים תולעים הפתרון חרוז פוליסטירן באמצעות חוט פלטינה סכמטי (E) לבחור. Coverslip (F) א (22 x 44 מ מ2) הוא לשים על משטח agarose. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : הדמיה באזור. (א) שרטוט סכמטי של נוירונים DA9 ואת VA12 ואת תמונת הנציגה של wyIs251. בנוירונים DA9, האקסון הגחון, commissure ו- proximal האקסון אינו חייב הסינפסות בוגרת. שלפוחית סינפטית מבשרי הם מועברים בגוף התא אל הסינפסות דרך אזורים אלה עצב. האזור להתייחס מוצג באמצעות תיבות. (B) שרטוט סכמטי של נוירונים פא ו PHB ו- cilia שלהם. האזור להתייחס מוצג באמצעות תיבות. סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : דור של סרטים, kymographs באמצעות תוכנה פיג'י. (א) לחץ על הלחצן "בחירה מלבנית" (חץ), בחר את אזור אחד הייתי רוצה להתמקד על ידי ציור מלבן (תיבת צהוב) כדי ליצור substacks. (B) לחץ על לחצן קו מקוטע (חץ) וצייר קו מקוטע לאורך cilia משתמש בעכבר (קו צהוב). (ג) בחר 'נתח', "רב Kymograph" ואת "רב Kymograph" כדי להפעיל את תוסף ליצירת kymographs. (S) linewidth קלט, לחץ על "אישור" ולהפיק kymographs (איור 5 , איור 7). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : Kymograph נציג התחבורה עצב של שלפוחית סינפטית מבשרי. GFP::RAB-3 תנועה נצפית על האזור asynaptic הפרוקסימלית של נוירון DA9, kymograph נוצר עם ריבוי Kymograph של פיג'י. אופקי ואנכי העמודות מייצגות אורך וזמן, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : Kymograph הנציגה של: אי. OSM-6::GFP הוא ציין cilia פא ו PHB, kymograph הזה נוצר מתוך האירוע סחר של אחד מהם. Kymograph נוצר עם ריבוי Kymograph של פיג'י. אופקי ואנכי העמודות מייצגות אורך וזמן, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1: הסרט נציג התחבורה עצב של שלפוחית סינפטית מבשרי. GFP::RAB-3 תנועה נצפית על האזור asynaptic הפרוקסימלית של הנוירון DA9. GFP::RAB-3 שולבו מבשרי שלפוחית סינפטית, מועבר. Anterograde ותעבורה עצב רטרוגרדית נרשמים. שלפוחית יש להפסיק אך מחדש שוב. הסרט הוקלט ב 4 מסגרות לשנייה ומחזות -מסגרות/ס' 15 סרוקle בר = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
סרט 2: סרט נציג של: אי. OSM-6::GFP הוא ציין cilia פא ו PHB. OSM-6::GFP הוא שולב: אי. מורכבים ועובר לאורך cilia. הסרט הוקלט ב 4 מסגרות לשנייה ומחזות בבר סולם מסגרות/ס' 15 = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הגבלה לגבי שיטות קיימות
השיטה המתוארת כאן ממוטבת להתבונן מהר אירועים כגון: אי ולהזמנת עצב. לפיכך, קיבעון יותר תקבל עדיפות גבוהה יותר זמן הדגירה. ואילו היינו מסוגלים להבחין באירועים סחר לפחות 20 דקות ללא ההפרעות משמעותית, שיטה זו ייתכן שלא יתאים תמיד להתבונן איטי אירועים הדורשים תצפיות יותר, כגון אקסון התארכות נדידת תאים. עבור תצפיות יותר זמן, שצריך למטב את התנאים על-ידי הפחתת אחוז agarose (דהיינו, הגדלת המים כדי למנוע ייבוש והפחתת הלחץ הזה פוטנציאל גורמת נזק). לחלופין, המכשיר microfluidic המתואר לעיל15 או קיבעון של תולעים באמצעות רפידות agarose והרדמה עשוי להיות מתאים יותר16 ואילו תופעות לוואי וצריך להעריך בזהירות.
שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול
השגחה נאותה, סמני הם קריטיים. סמנים צריכים להיות משולבים לתוך שלפוחית או חלקיקים, להיות על בהירות מספקת. מערכים extrachromosomal או קווים משולב יכול לשמש. עבור ויזואליזציה של התחבורה עצב של שלפוחית סינפטית מבשרי בנוירונים DA9, המתח wyIs251 הוא שימושי7,23. jsIs821 שימש להתבונן תחבורה עצב בנוירונים mechanosensory כמה מחקרים26,27. כאשר מאבחנים נוירונים אחרים, שלפוחית סינפטית חלבונים צריך לבוא לידי ביטוי גם נוירונים באמצעות תאים ספציפיים היזמים. היזמים אלה צריך להיות חזק מספיק. ראב-3 ו- SNB-1 נמצאים בשימוש נרחב כדי להדביק תווית שלפוחית סינפטית מבשרי22,23,26. להתבונן: אי, מרכיבי: אי. מורכבים יש לתייג. כפקד חיובית, המתח mnIs17 היא בחירה טובה29. Cilia שמקורם 8 תאים (ASE ASG, אסי, ASL, אפר, שאל, מזין מסמכים אוטומטי, אדל) מקובצות יחדיו בראש (amphid) בעוד cilia מתאי 2 (פא ו PHB) יפקחו על ההר (phasmid). כי OSM-6::GFP מתבטאת כל הנוירונים ciliated ב mnIs17, זה עשוי להיות קשה לנתח את: אי. בפירוט cilia ראש. עם זאת, באזור הזנב, רק נוירונים פא ו PHB מסומנות,: אי. בכל תא אפשר בקלות לפתור. לחלבונים אחרים: אי המתויגים באמצעות חלבונים פלורסנט ניתן להתבונן: אי21,28. אם אדם רוצה לנתח את הנוירונים ראש, היזמים תא ספציפי יהיה שימושי. בעוד הראש cilia מורפולוגיות שונות, תחבורה אירועים יכול להיות מוקלט29. על ידי חציית מוטציות עם סמנים אלה, הפונקציות של כל גנים: אי ולהזמנת עצב יכול להיות שנותחה ויוו. הפרמטרים ניתן לנתח תוארו הקודם העבודה22,23,26,27. GFP היא הבחירה הטובה ביותר ואת ראשי. mCherry tdTomato ניתן גם בשימוש22, עם זאת, mCherry מעומעמת יותר מאשר ה-GFP. tdTomato הוא דיימר טנדם יותר מ monomeric חלבונים פלורסנט, אשר לפעמים משפיע על הדינמיקה של פיוז'ן חלבונים30. לכן, התוצאות צריך להיות מנותח, לפרש בזהירות כאשר נעשה שימוש tdTomato. mScarlet, בהירים monomeric אדום פלואורסצנטי חלבון אשר פותחה לאחרונה, היא בחירה חלופיים31.
בזמן ספינינג דיסק מיקרוסקופיה קונפוקלית נעשה שימוש נרחב כדי להתבונן תחבורה עצב ו-7,: אי21, הציוד יקר, עלול להיות קשה לגשת בסביבות מחקר מסוימות. אולם, תופעות אלו יכולים גם להיות מוקלט וניתח ב- C. elegans באמצעות מיקרוסקופים פלורסנט רגיל, אם מצוידים עם עדשות נה גבוהה, כי C. elegans , קטן ושקוף בעלי חיים ופשוט להתבונן.
יישומים עתידיים
בשיטה דומה הנייח המתוארים כאן, נצפתה: אי ברזולוציה מולקולה בודדת ב vivo32. יתר על כן, פותחו מספר סוגים של מיקרוסקופ ברזולוציה-העל. אפשר לייחס ישירות בשיטות המתוארות כאן ניתוח מיקרוסקופי סופר רזולוציה. מניסיוני, מצב מהיר של Airyscan33 עובד טוב מאוד לנתח: אי. באופן תיאורטי, מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה דיסק מסתובב (SDSRM) יהיה בחירה טובה טוב34. לסיכום, על ידי שילוב של ספריות מוטציה, טכניקות חדשות אלה, השיטה המתוארת כאן צריך להיות להבהרת המנגנון המולקולרי תחבורה עצב,: אי ויוו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר אין לחשוף.
Acknowledgments
המחבר עמוקות תודה ד ר Asako סוגימוטו (אוניברסיטת Tohoku) לדיון מועיל שלה. wyIs251 היה מתנה נדיבה של ד ר קאנג שן (אוניברסיטת סטנפורד). mnIs17 סופק על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי גרנט JSPS KAKENHI #17 H 05010 ו- #16 H 06536, תחנת Sankyo קרן, קרן מדעי המוח וקרן נאיטו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B.
- Ishikawa, H., Marshall, W. F.
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S.
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
