Summary
유럽 장 어 성숙 및 정자 cryopreservation 프로토콜 지난 수 년에 걸쳐 개선 되었습니다. 이 문서는 성숙과 메탄올 cryoprotectant로 유도 대 한 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)을 사용 하 여 사용할 수 있는 최상의 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
지난 년 동안 여러 연구 그룹 개발 및 유럽 장 어 처리 및 성숙에 대 한 새로운 프로토콜의 개선에 노력 하고있다. 로 서 아직, 인간 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)의 주간 주사 치료, 몇 주 동안 높은-품질의 높은 볼륨 생산의 단지 5-6 주 후 남성 maturate를 입증 해야 합니다. 또한, 정자 cryopreservation 프로토콜 다른 extender를 사용 하 여, cryoprotectants 및 냉각 시간을 녹고 있다 이전 설명 유럽 장 어에 대 한. 여기, 우리가 보여줍니다 수정 또는 cryopreservation, Tanaka´s 익스텐더 솔루션 직접 사용 될 수 있다 솔루션 및 희석의 다른 종류의 사용을 불필요 한 만들기. 또한, 메탄올의 사용은 cryoprotectant로 만드는이 프로토콜 사용 하기 쉬운 메탄올은 낮은 독성과 정자를 활성화 하지 않습니다. 정자는 cryoprotectant 추가 직후 cryopreserved 필요 하지 않습니다 그리고 그것은 오래 되 고 해 동 후 사용할 수 있습니다. 또한, 정자 운동 성은 비록 그것이 신선한 정자 보다 낮은 녹고 후 여전히 높다입니다. 이 작품의 목표 처리, 성숙 및 정자 cryopreservation 유럽 장 어에 대 한 가장 사용할 수 있는 프로토콜을 표시 하는 것입니다.
Introduction
지난 25 년 동안 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 유럽 해 안에 도착의 수는 꾸준히 90 1,2,3감소. 오염, 감염, overfishing, 서식 지 파괴 등이 급격 한 하락을 설명 하는 몇 가지 요인이 있다. 이 모든 중요 한 멸종 위기 4자연 보존 (IUCN) 목록은 국제 연합에 유럽 장 어의 포함에 지도 하는이 종에 깊은 영향을 했다. 따라서, 기술 및 포로에 복제에 대 한 프로토콜의 개발은 필요 합니다.
포로에서 유럽 장 어의 성숙 호르몬 치료 5,,67 에 의해 이루어집니다 하지만 남녀 모두에서 gametes의 생산 8동기화 할 어렵습니다. 새로운 안 드로 겐 임 플 란 트의 개발 oogenesis 뱀장어 9,에 있는 가속을 보이고 있다 하더라도10, 여성에서 마지막 성숙의 타이밍은 여전히 매우 변수 하 고 11를 제어 하기 어려운. 따라서, 기술의 정자 12,,1314 및 cryopreservation 단기 저장 복제 관리, 생식 체 동기화 불필요 한 8를 만들기 위해 필요 하다.
유럽 장 어 정자의 cryopreservation 2003 15,16이후 개발 되었습니다. 몇몇 연구원은 성공적인 프로토콜 cryoprotectants 16,17,18,,1920디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 또는 메탄올을 사용 하 여 설계 되었습니다. 두 프로토콜 성공적으로 사용 되었습니다, 하지만 해 동된 정자 DMSO와 cryopreserved의 얻은 세포 생존 능력에 메탄올 20,21보다 낮은 것입니다. 또한, 장 정자 DMSO와 접촉을 활성화 하 고 더 지루한 정자 조작 19필요 하, 그러므로 메탄올 DMSO 보다 유럽 장 어 정자에 대 한 더 적합 한 cryoprotectant 이다.
여기, 아래 최적의 처리 및 유럽 장 어의 호르몬 치료에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이것 이외에,이 종에서 정자 품질 평가 대 한 프로토콜은 cryoprotectant로 메탄올을 사용 하 여 최고의 유럽 장 어 정자 cryopreservation 프로토콜도 설명 됩니다.
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Protocol
이 프로토콜에서 설명 하는 유럽 장 어와 함께 작업 하기 위한 모든 절차는 위원회의 윤리의 동물 실험 Universitat Politècnica de València, 스페인 법률 및 규정 제어 실험에 의해 승인 및 살아있는 동물에 절차입니다.
1. 물고기 유지 보수
- 연구 시설에 유럽 뱀장어를 가져오고 재순환 시스템 200 L 수족관에 넣어. 20 ° C에서 일정 한 온도 유지 하기 위해 온도 쿨러를 사용 합니다.
- 실험 기간 동안 물고기 음식와 스트레스22 를 피하기 위해 어두운 조건에서 유지.
- 첫 3 일 동안 신선한 물에서 물고기를 유지. 다음 물 1/3을 변경 하 고 해 수 37.0 ±의 염 분을 도달할 때까지 매일 리필 0.3 g/l.
2. 호르몬 치료
참고: 호르몬 치료는 실험의 전체 기간 (9 주)을 통해 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)의 주간 주사의 구성 되어 있습니다.
- 1 IU / µ L의 농도에서 미리 hCG 호르몬 호르몬 생리 식 염 수에 희석 하 여 준비 (0.9 %NaCl).
참고: 호르몬 보존 될 수 있습니다-18 ° c.에 1 주일 이상에 대 한이 농도에 희석 - Anesthetize 물고기, 시스템 물 5 l 40 L 유연한 물통을 준비 합니다.
- 250 mL 플라스 크에 300mg benzocaine 70% 에탄올 100ml에 희석.
- 양동이에 희석된 benzocaine를 부 어 (최종 농도 0.36 m m)와 적절히 섞어. 이것은 60 mg/l.의 최종 benzocaine 농도 대 한
- Benzocaine와 물으로, 물고기를 개별적으로 전송 하 고는 benzocaine 적용 됩니다 물고기 제대로 마 취 될 때까지 몇 초를 기다립니다.
참고: 물고기 취 것인지 물고기 부정사 자리에 놓고 그것은 여전히 그 자리에에서 유지 하는 확인 하십시오.
- 호르몬 관리, 무게 물고기 고 물고기, 1.5 mL 플라스틱 튜브에서의 1.5 IU/g의 복용량에 hCG 호르몬을 준비.
- 플라스틱 튜브에서 hCG 호르몬을 1 mL 주사기를 채우십시오.
- 복 지역에서 신중 하 게 호르몬을 주입, 부정사 위치와 도움 또는 주사기 마 취 물고기를 놓습니다.
- 물고기는 수족관에 반환 하 고 완전히 복구 될 때까지 그것을 모니터링 합니다.
참고: 호르몬 관리는 실험 내내 매주 실시 하는. 일반적으로, 유럽 뱀장어는 호르몬 치료의 6-7 주 후 spermating를 시작합니다.
3. 정자 샘플링
- 최고의 품질 샘플을 얻기 위해 호르몬 관리6,23후 정자 24 h를 추출 합니다.
- 2.2 단계에 설명 된 대로 benzocaine와 물고기를 anesthetize.
- 부정사 위치에 마 취 물고기를 배치, 증류수의 물 총으로 성 기 영역을 청소 하 고 종이 수족관에서 해 수와 접촉 하 여 배설물 오염 음부 나 실수로 정자 활성화를 방지 하려면 신중 하 게 건조.
- 물고기의 측면 양쪽에 손가락을 배치, 신중 하 게 누르면 옆으로 가슴 지 느 러 미에서 성 기 영역을 밖으로 정자를 마사지.
- 마사지를 반복 하 여 더 더 정자 생식 기 오프닝에서 나온다.
- 15 mL 플라스틱 튜브 진공 펌프를 사용 하 여 정자를 수집 합니다.
- 4 º C에서 수정된 Tanaka´s 익스텐더 솔루션24 (137 m m NaCl, 76.2 m m NaHCO3, 증류수에)에서 추출한 정자 1시 10분 희석.
참고: extender 솔루션에 정자 4 º C에서 유지 되어야 합니다.
4. 정자 품질 평가
- 인공 해 수13 준비 (mm에서: NaCl 354.7, MgCl2 52.4, CaCl2 9.9, 나2등4 28.2, KCl 9.4, 증류수에) 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (w:v), pH 8.2, osmolality 1100 mOsm/kg를 조정 하 고 유지 그것은 박테리아의 성장을 피하기 위해 4 º C에서.
- 컴퓨터 기반 정자 분석 (카사)에 대 한 소프트웨어를 열고 물고기 정자 모듈을 선택 합니다.
- 소프트웨어의 시스템 설치 프로그램을 열려면 속성 클릭 하십시오. 거기, 초당 60 이미지에서 캡처 옵션을 설정 합니다. 선택 부정적인 단계 광학, Makler 챔버와 10 배 규모.
- 다음 분석 값에 종 및 입자 영역 2 µ m2 보다 크고 20 µ m2보다 작은 물고기 를 선택 합니다.
- 속도 매개 변수를 설정 느린 때 셀 10 그리고 45 µ m/s 사이 이동, 45, 100 µ m/s 사이 이동할 때 보통 으로 설정 빠른 100 µ m/s 보다 빠르게 이동 하는 경우.
참고: 10 µ m/s 보다 느린 속도와 정 충 immotile 간주 됐다. - 직진도 (STR)의 80%로 진보적인 가치를 선택 하 고 속성을 저장 합니다.
- 캡처 필드 (카메라에서 라이브 이미지 창이 열립니다)를 클릭 하십시오.
참고: 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템 현미경, 카메라 및 이미지 분석 소프트웨어에 의해 형성 된다.
- 세 실에 인공 해 수의 4 µ L를 넣어 하 고 정자 솔루션 (정자 익스텐더 솔루션에 희석)의 0.5 µ L를 추가 합니다.
- 이미지에 부정적인 단계에 10 배 확대 현미경 초점. 15 활성화 후 s 클릭 캡처-비디오에서 컴퓨터 기반 정자 분석 소프트웨어에서.
- Cryopreservation 70% 보다 높은 운동 성을 가진 triplicate 선택 샘플에서 모든 샘플을 분석 합니다.
참고: 그것은 매우이 cryopreservation 프로토콜의 성공에 대 한 높은-품질 정자만을 선택 하는 것이 중요입니다.
5. 정자 동결 방법
- 34 cm x 34 cm x 30 cm 및 5 cm 두꺼운 스티로폼 상자에서에서 사전에 액체 질소 (약 2.5 L)를 준비 합니다.
참고: 항상 액체 질소의 4-5 cm 높이의 레벨을 유지 합니다.- 전 정자를 동결 부동 구조 구축. 폴리스 티 렌 (20 cm x 5 cm)의 2 개를 사용 하 여, 2 플라스틱 튜브와 함께 그들을 바인딩할 하 고 액체 질소에 구조를 놓습니다. 이 구조는 표면 (그림 1)에 3 cm의 대략적인 높이에 액체 질소를 통해 플 로트 해야 합니다.
그림 1 . 미리 이상의 액체 질소 냉동에 사용 되는 부동 구조 그리기 도식. 구조는 낮은 밀도 20 cm x 4 cm x 5의 스티로폼의 두 부분으로 구성 됩니다 cm 14 c m의 플라스틱 튜브와 연결. 빨 대는 액체 질소에 3 cm에 플라스틱 튜브를 통해 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 정자, 익스텐더 솔루션 및 메탄올 1의 비율로 혼합 하 여 cryopreservation 솔루션 준비: 8:1 1.5 mL 플라스틱에서 튜브, 부드럽게 저 어.
- 피 펫의 도움으로 500 µ L 빨 대에 cryopreservation 솔루션의 480 µ L을 추가 하 고 필요 하다 면, 클레이 모델링 한 끝을 폐쇄 하 여 표시 합니다.
- 3 분 액체 질소에 3 cm의 고도에 떠 있는 장치에 빨 대를 넣어. 그런 다음 액체 질소에 빨 대를 놓습니다.
- 10-15 분 후 긴 집게를 사용 하 여 액체 질소 저장 탱크에 빨 대를 전송 하 고 항상 액체 질소에 빠져들 유지 합니다. 여기, 정자는 무기한으로 저장할 수 있습니다.
6. 해 동 방법
- 5.1, 단계에서 설명한 대로 액체 질소로 스티로폼 상자를 준비 하 고 준비 물 목욕 40 º C에서 수돗물 3l 비 커를 사용 하 여.
- 긴 집게를 사용 하 여 액체 질소 저장 탱크 스티로폼 상자에 냉동된 정자를 빨 대 전송.
- 13 40 º C에서 물 목욕으로 각 빨 대를 넣어 s.
- 가 위로 빨 대의 닫힌된 끝을 절단 하 여 1.5 mL 플라스틱 관으로 정자를 붓는 다.
- 4.1 단계에 설명 된 대로 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템을 사용 하 여 정자의 운동 성 분석.
- 교류 cytometer와 정 충의 생존 능력을 분석 하는 정자의 100 µ L를 유지.
7. Cytometry
- Propidium 요오드 화물 (PI), 죽은 세포의 핵을 얼룩 빨간 형광 화합물 이며 녹색 살아있는 세포의 핵 얼룩 막 permeant 핵 형광 성 화합물을 포함 하는 형광 키트를 사용 합니다.
- 100 µ M의 작업 솔루션 Tanaka´s 매체에 재고 솔루션 (1mm) 1시 10분에서 그것을 diluting 하 여 녹색 형광 얼룩 솔루션을 준비 합니다.
- PI 솔루션을 희석 하지 마십시오. 2.4 m m 재고 솔루션이입니다.
- 각 샘플에 대 한 신선한 또는 해 동 정자의 50 µ L 고 작업 솔루션 (최종 농도 1 µ M)를 착 색 하는 녹색 형광의 0.5 µ L을 추가 하 고 PI 솔루션 (최종 농도 100 µ M)의 2 µ L.
- 5 분 동안 어둠 속에서 염료 (PI와 녹색 형광 성 얼룩)를 포함 하는 샘플을 품 어.
- Tanaka´s 익스텐더 솔루션의 500 µ L의 샘플을 희석 하 고 교류 cytometer 분석.
- 교류 cytometer 설정 하 고 적어도 2 음모를 포함 하는 새로운 프로토콜을 만들: SS 대 FS 로그 및 FL1 vs FL3 로그.
참고: 두, 녹색 형광 얼룩이 지 고 propidium 요오드 화물 보이는 파장 빛으로 흥분 수 있습니다. DNA에 바인딩된 경우,이 염료의 최대 형광 방출은 516 및 617 nm, 각각.- 다른 레이저의 전압 조정: SS = 199; FS = 199; FL1 377; = FL3 = 372
- 최대 이벤트 수집 설정 협정 설정 = 5000 또는 15 s (샘플의 최종 농도 약 1 백만 셀/mL의 해야 함). 낮 은 흐름을 사용 하 여 샘플을 읽기.
- 읽기 모드 단일 튜브 고정 위치 모드를선택 합니다.
- 회전 목마의 오른쪽 숫자에 샘플을 넣어
- (F 9를 누르면) 샘플을 읽고 고 추가 분석에 대 한 (f 7을 누르면) excel 파일에 수집 된 데이터를 저장 합니다.
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Representative Results
70% 이상, 정자 운동 성 가진 18 뱀장어에서 정자는이 연구에 대 한 선정 됐다. 결과 신선한 정자 (표 1 및 그림 2)에서 그에 비해 녹고 후 모든 품질 매개 변수에서 감소를 보였다. 운동 성 결과 (± S.E.M., 의미 n = 18) 총 운동 성 및 진보적인 운동 후 해 동 정자 샘플에서 발견 보다 신선한 정자에 더 높은 총 운동 성 및 진보적인 운동 성을 보였다.
같은 패턴은 냉동-해 동 샘플 신선한 샘플 보다 빠른 셀의 낮은 비율을 제시 빠른 정자 세포의 분석에서 발견 되었다. 또한, 정자 세포 속도 측정 후 녹고 샘플에서 또한 감소 되었다.
또한, 결과 3.1 %23 ±의 살아있는 정자 세포에 감소 제시 녹고 후 세포 생존 능력을 보여주었다 (± S.E.M., 의미 n = 18) 냉동-해 동 신선한 샘플 (표 1 및 그림 2)에서.
그림 2 . 운동 성, 곡선 속도 및 신선한 정자와 (cryopreservation) 후 해 동된 정자의 세포 생존 데이터. 정자 해 동 되 고 전에 24 h에 대 한 cryopreserved 이었다. 제시 하는 값은 수단 ± 18 샘플에서 정자의 S.E.M.입니다. 별표 표시 해 동 하 고 신선한 샘플 사이의 중요 한 차이점 (t-검정; p < 0.05). 매개 변수 운동 성 총 운동 정 충, 곡선 속도 곡선 궤적을 따라 정 충의 평균 속도 표시 그리고 세포 생존 능력 살아 정 충의 비율의 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 빠른 + 중간 셀1 (%) | 70.7 ± 2.8 | 27.5 ± 2.1* |
| 곡선 속도 (VCL; µ m/s) | 118.8 ± 2.8 | 101.5 ± 1.8* |
| 직선 속도 (VSL; µ m/s) | 53.3 ± 1.9 | 45.6 ± 1.3* |
| 평균 경로 속도 (VAP; µ m/s) | 73.3 ± 2.1 | 62.0 ± 1.3* |
| 주파수 (Hz) 크로스 치고 | 27.9 ± 0.3 | 27.1 ± 0.6 |
| 세포 생존 능력 (살아있는 세포의 %) | 97.7 ± 0.3 | 73.8 ± 2.8* |
| 1 셀 40 µ m/s 이상의 곡선 속도 보여주는. | ||
표 1입니다. 다른 매개 변수에서 신선 하 고 해 동 샘플 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템으로 분석의 결과의 요약. 해 동된 샘플 24 h에 대 한 cryopreserved 이전 했다. ± S.E.M. 의미를 제시 하는 모든 값 (n = 18). 별표 표시 해 동 하 고 신선한 샘플 사이의 중요 한 차이점 (t-검정; p < 0.05). 분석된 매개 변수 했다: 총 운동 세포;의 백분율로 정의 운동 정 충 진보적인 운동 성 정 충의 백분율로 정의 하는 본질적으로 직선; 앞으로 수영 40 µ m/s; 위의 평균 곡선 속도와 정 충의 백분율로 정의 하는 빠르고 중간 셀 곡선 궤도; 통해 정자의 평균 속도으로 정의 된 곡선 속도 직선 속도 직선; 그것의 마지막 위치를 첫 번째 검색 된 위치에서 측정 하는 정자의 평균 속도로 정의 공간 평균 궤도;에 따라 정자의 평균 속도로 정의 평균 경로 속도 평균 속도는 곡선 정자 머리 궤적의 평균 경로 궤적; 십자가로 정의 교차 주파수 구타 세포 생존 능력 살아 정 충의 비율로 정의입니다.
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Discussion
이 프로토콜 유럽 장 어 성숙, 처리 및 정자 cryopreservation에 대 한 완전 한 프로세스를 설명합니다. 여기에 설명 된 농업 조건 빠른 성숙 및이 종 6,,725에 높은-품질의 높은 볼륨의 생산을 위한 최적의 있습니다. 이 cryopreservation 프로토콜 및 해빙 후 수정에 대 한 그것의 잠재적인 사용의 성공 신선한 정자 26의 품질에 따라 크게 의존. 따라서, 높은-품질의 선택은 매우 중요. 주관적 정자 품질 평가 기술, 지 각 및 샘플 5,,2728 평가 연구원의 훈련에 따라 고 수에 따라 매우 다른 품질 의견 연구원 29 따라서, 컴퓨터 기반 정자 분석의 사용이 좋습니다 cryopreservation에 대 한 최고의 품질 샘플 선택 하.
결과 발표 후 녹고 정자 품질 여기 운동 성, 속도, 및 세포 생존의 매개 변수에서는 감소를 보여주었다. 이것은 거기 존재 하는 종 26,30사이의 큰 변화 하더라도 사용 가능한 참고 문헌 일치 합니다. 예를 들어, 대서양 연어 (salar Salmo) 연구, 70-95%의 운동 성 가진 신선한 정자 다른 cryoprotectants (DMSO와 메탄올)를 사용 하 여 고정 했다. 녹고 후 정자의 운동 성 운동 성 값을 8.2%의 최상의 프로토콜에 신선한 샘플에 비해 크게 낮은 아직 해 동된 정자를 사용 하 여 수정 율은 42.8%, 컨트롤 (신선한 정자) 31의 95%로 높은. 다른 연구에서 대서양 넙치 (Hippoglossus hippoglossus)의 정자로, 정자 운동에 상당한 감소 cryopreservation 후 발견 및 해 동된 정자를 사용 하 여 수정 율은 95% 이상 32.
유럽 장 어에서 이전 연구 또한 감소에서에서 보여주었다 정자 운동 성 후 cryopreservation는 cryoprotectant 별도로 사용 16,18. 또한, 비슷한 품질의 유럽 장 어에서 cryopreserved 정자 수정 8성공적으로 사용 되었습니다. 그 연구에서 Asturiano 그 외 여러분 은 cryoprotectant로 DMSO를 사용. DMSO의 사용이이 cryoprotectant 정자를 활성화 하 고 따라서 DMSO의 추가 시 즉시 냉동 해야 이후 조작 단점도 있다. 또한, 해 동 정자와 수정을 녹고 후 즉시 실시 해야 합니다. 정자 pH의 감소 부분적으로 19의이 문제 해결할 수 있지만 프로토콜은 cryoprotectant로 메탄올와 여기에 제시 된 프로토콜 보다 더 섬세 한.
몇몇 학문은 cryoprotectant로 메탄올을 사용 하 여 긍정적인 결과 나타났습니다. 예를 들어, 여기, 10% 메탄올, cryoprotectant로 제시 하는 것 매우 유사한 프로토콜 사용 하 여 일본 장 어 (앵귈라 japonica)와 함께 실시 한 연구에서 저자 성공적으로 수정 된 계란 신선 하 고 cryopreserved 정자를 사용 하 여. 이 연구에서는 그들은 신선 하 고 cryopreserved 정자 33사이 상당한 차이가 17%의 수정 율을 얻었다.
녹고, 후 충분 한 정자의 품질을 보존 하 고 다른 extender cryoprotectants를 사용 하 여 프로토콜 보다 하지만 쉽게 처리 사전의 장점을 녹고 후 유사한 정자 특성을 표시 하려면 여기에 제시 된 프로토콜 입증 했다 고 후 cryopreservation입니다. 냉각 및 여기서 설명 하는 시간을 해빙으로 양질의 정자를 사용 하 여 정확 하 게 따르도록 매우 중요 하다. 미래 연구, 수정 재판이이 프로토콜을 사용 하 여 테스트 됩니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 게시는 유럽 연합의 수평선 2020 연구에 의해 투자 되었다 및 혁신 프로그램 마리 Sklodowska 퀴리 부여 계약 없음 642893 (감동), 비용 사무실 (비용 액션 FA 1205, AQUAGAMETE), 그리고 우수 연구 센터- 1476-4/2016/FEKUT입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
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