Summary
Протоколы для созревания и спермы криоконсервация угорь улучшились за последние годы. Эта статья описывает наилучший протокол с помощью хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) для стимулирования созревания и метанола как криопротектора.
Abstract
В последние годы работали несколько исследовательских групп по разработке и совершенствованию новых протоколов для обработки угорь и созревания. Тем не менее, по состоянию на еженедельных инъекций хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) оказались вызревают мужчины после всего 5-6 недель лечения, производить большие объемы высокого качества спермы в течение нескольких недель. Кроме того, протоколы криоконсервирования спермы, используя различные наполнители, криопротекторов и охлаждения и оттаивания раз были ранее описаны для угорь. Здесь мы покажем, что Tanaka´s расширитель решение может непосредственно использоваться для оплодотворения или для криоконсервирования, что делает ненужным использование различных типов решений и разведения. Кроме того использование метанола как криопротектора делает этот протокол проста в использовании, как метанол имеет низкую токсичность и не активировать сперму. Спермы не нужно быть криоконсервированных сразу же после добавления криопротектора, и он может использоваться после будучи размороженным. Кроме того сперматозоидов по-прежнему высока после оттаивания, хотя это меньше, чем в свежей спермы. Цель этой работы заключается в том, чтобы показать лучшие доступные протокол для угорь обработку, созревания и криоконсервации спермы.
Introduction
За последние 25 лет количество европейских угорь (Ангилья Ангилья), прибывающие на европейском побережье неуклонно сократились на 90% 1,2,3. Существует несколько факторов, которые объясняют это резкое падение включая загрязнение, инфекции, перелова и Хабитат разрушения. Все это имеет огромное влияние на этот вид, приводит к включению угорь на Международного союза охраны природы (МСОП) списка как критические опасности 4. Следовательно необходимы развитие методов и протоколов для размножения в неволе.
Созревания угорь в плену достигается гормональное лечение 5,6,7 , но производство гамет у обоих полов очень сложно синхронизировать 8. Даже несмотря на то, что показал, что развитие новых имплантатов андрогенов ускорить женских угрей 9,10, сроков окончательного созревания самок по-прежнему высоко переменная и трудно контролировать 11. Таким образом кратковременного хранения спермы 12,13,14 и криоконсервацию методы необходимы для воспроизводства управления, что делает гамет синхронизацию ненужных 8.
Криоконсервация спермы угорь был разработан с 2003 года 15,16. Несколько исследователей разработан успешных протоколы, используя диметилсульфоксида (ДМСО) или метанола как криопротекторы 16,,1718,19,20. Хотя оба протокола были успешно использованы, полученные клетки жизнеспособность талой сперму замораживают с ДМСО ниже, чем с метанолом в 20,21. Кроме того угорь спермы активируется на контакт с ДМСО и требует более утомительным спермы манипуляции 19, поэтому метанола является более подходящим криопротектора для спермы угорь чем ДМСО.
Здесь протокол для оптимальной обработки и гормонального лечения угорь будут описаны ниже. Помимо этого лучший европейский угорь спермы криоконсервация протокол с использованием метанола как криопротектора и протокол для оценки качества спермы в этот вид также будет описано.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для работы с угорь, указанных в настоящем протоколе были одобрены Комитет этики животных экспериментов на университетской политехнического де Валенсия, после испанского законы и правила, регулирующие эксперименты и процедуры на живых животных.
1. рыба техническое обслуживание
- Принести угорь Европейский исследовательский центр и положил их в 200 Л аквариумов с системой рециркуляции. Используйте термостаты и охладители для поддержания постоянной 20 ° C температуры.
- Сохранить рыбу в условиях темноты, чтобы избежать стресса22 и без еды во время эксперимента.
- Сохранить рыбу в пресной воде в течение первых 3 дней. Затем измените 1/3 воды и залейте морской воды каждый день, до достижения соленость 37.0 ± 0,3 г/л.
2. гормональное лечение
Примечание: Гормональное лечение состоит из еженедельных инъекций хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) на протяжении всей продолжительности эксперимента (9 недель).
- Подготовьте гормона ХГЧ заранее в концентрации 1 МЕ/мкл путем разбавления гормона в физиологический раствор (0,9% NaCl).
Примечание: Гормон может быть сохранена разбавляют в этой концентрации для более недели при температуре-18 ° C. - Чтобы анестезировать рыбы, подготовьте 40 Л гибкие ведро с 5 Л воды системы.
- В 250 мл флакон разбавляют 300 мг бензокаин в 100 мл 70% этанола.
- Залить разбавленным бензокаин в ведро (конечная концентрация 0,36 мм) и смешайте правильно. Это для окончательного бензокаин концентрации 60 мг/л.
- Передача рыбы, индивидуально, в воду с бензокаин и подождите несколько секунд, пока бензокаин вступает в силу и рыба должным образом под наркозом.
Примечание: Чтобы подтвердить, что рыба наркоз, поместите рыбу в лежачем положении и проверьте, что он остается до сих пор в этом положении.
- Чтобы администрировать гормон, весят рыбы и подготовить гормона ХГЧ в дозе 1,5 ед/г рыбы, в 1,5 мл пластиковую трубку.
- Залейте 1 мл шприц гормона ХГЧ от пластиковой трубки.
- Место наркотизированных рыбы в лежачем положении и с помощь или шприц, придать гормон тщательно в внутрибрюшинного области.
- Возвращение рыб в аквариумах и контролировать его до тех пор, пока полностью выздоровел.
Примечание: Гормональные администрация должна проводиться каждую неделю на протяжении всего эксперимента. Как правило Европейский угорь запустить spermating после 6-7 недель гормонального лечения.
3. спермы выборки
- Чтобы получить лучшие качества образцов, экстракт спермы 24 ч после гормональных администрации6,23.
- Анестезировать рыбы с бензокаин, как описано в шаге 2.2.
- Место наркотизированных рыбы в лежачем положении, чистый гениталий с тонкой струей дистиллированной воды и тщательно высушите с бумагой, чтобы избежать загрязнения фекалиями в области половых органов или случайного спермы активации путем контакта с морской водой из аквариумов.
- Размещение пальцев на обеих боковых сторонах рыбы, Массаж тщательно нажав боково от грудные плавники в области половых органов может заставить спермы из.
- Повторите массажа, до тех пор, пока не больше спермы выходит из половых открытия.
- Сбор спермы в 15 мл пластиковых трубок с помощью вакуумного насоса.
- Развести 1:10 извлечения спермы в модифицированных Tanaka´s расширитель решение24 (137 мм NaCl, 76,2 мм NaHCO3, в дистиллированной воде) при температуре 4 °.
Примечание: Спермы в решении расширителя должен поддерживаться на 4 ºC.
4. Оценка качества спермы
- Подготовка искусственных морской13 (в мм: 354,7 NaCl, MgCl2 52,4, CaCl2 9,9, Na2т4 28,2, KCl 9.4, в дистиллированной воде) с 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) (w:v), скорректировать рН 8.2, осмотического давления до 1100 мОсм/кг и поддерживать он на 4 ° c для предотвращения роста бактерий.
- Откройте программное обеспечение для анализа спермы, компьютерный (CASA) и выберите модуль рыбы спермы.
- Щелкните Свойства , чтобы открыть программу настройки системы программного обеспечения. Там задайте параметры захвата на 60 изображений в секунду. Выберите отрицательный фазы Оптика, маклер камеры и 10 X масштаба.
- Анализ значения, выберите на рыб как видов и области частиц меньше 20 мкм2и больше чем 2 мкм2 .
- На скорости параметров значение медленно когда клетки перемещаться между 10 и 45 мкм/s, установите средний при перемещении между 45 и 100 мкм/s и установить для быстрого , когда движется быстрее, чем 100 мкм/s.
Примечание: Сперматозоиды с скорость медленнее, чем 10 мкм/s были рассмотрены сперматозоидов. - Выберите значения прогрессивного как 80% прямолинейности (STR) и сохраните свойства.
- Нажмите на Захват поле (будет открыто окно с живой изображения от камеры).
Примечание: Система анализа спермы, компьютерный формируется микроскопом, камеры и программное обеспечение для анализа изображения.
- О Счетной палате положил 4 мкл искусственной морской воды и 0,5 мкл раствора спермы (спермы, разбавленный раствор расширителя).
- Резкость изображения с микроскопа при 10-кратном негативные этапе. 15 секунд после активации, нажмите на захват - от видео в спермы, компьютерный анализ программного обеспечения.
- Анализировать каждый образец в трех экземплярах и выберите образцы с моторики выше 70% для криоконсервации.
Примечание: Очень важно выбрать только высокого качества спермы для успеха данного протокола криоконсервирования.
5. сперма замораживания метод
- Подготовьте заранее жидкого азота (примерно 2,5 Л) в 34 x 34 см x 30 см и 5 см толщиной пенополистирола коробки.
Примечание: Поддерживать уровень жидкого азота из 4-5 см Высота во все времена.- Построить структуру плавающей предварительно заморозить сперму. Использовать 2 частей полистирола (20 см х 5 см), связать их с 2 пластиковых трубок и место структуры в жидком азоте. Эта структура должна плавать над жидкого азота на высоте приблизительно 3 см над поверхностью (рис. 1).
Рисунок 1 . Схематический рисунок плавающей структура, используемая для предварительно замораживание в жидком азоте. Структура состоит из двух частей низкой плотности пенополистирола 20 см х 4 см х 5 см, связанных с пластиковой трубы 14 см. Соломинки помещаются над пластиковых труб на 3 см над жидкого азота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Приготовляют раствор Криоконсервирование путем смешивания спермы, расширитель решение и метанола в соотношении 1:8:1 в 1,5 мл пластиковых труб и размешать осторожно.
- С помощью пипетки 480 мкл раствора криоконсервирования в 500 мкл соломинки и если необходимо, пометьте их, закрыв один конец с Пластилин.
- Положите соломы на плавающие устройства на высоте 3 см над жидкого азота на 3 мин. Затем место соломы в жидкий азот.
- После 10-15 мин передача соломинки в бак для хранения жидкого азота, используя длинный пинцет и держать их погружают в жидкий азот во все времена. Здесь сперма может храниться бессрочно.
6. размораживание метод
- Подготовить пенополистирола коробки с жидким азотом, как описано в шаге 5.1 и подготовить на водяной бане, используя 3 Л стакан с водопроводной водой в 40 ºC.
- Передача соломка с замороженной спермы из резервуара для хранения в поле пенополистирола с жидким азотом, используя длинные щипцами.
- Положите каждый соломы в водяной бане при 40 ° c для 13 s.
- Залейте спермы в 1,5 мл пластиковых труб путем разрезания закрытые концы соломы с ножницами.
- Анализ с использованием спермы компьютерного анализа системы, как описано в шаге 4.1 подвижности сперматозоидов.
- Держите 100 мкл спермы для анализа жизнеспособности сперматозоидов с проточный цитометр.
7. проточной цитометрии
- Использование флуоресцентных комплект, содержащий пропидий йодидом (PI), которая является красный флуоресцентные соединений, что пятна ядер мертвых клеток и мембраны permeant ядерных флуоресцентные соединение, что зеленые пятна ядер живых клеток.
- Подготовьте Зеленый флуоресцентный окрашивание раствора путем разбавления его от Стоковый раствор (1 мм) 1:10 на Tanaka´s носителе для рабочего раствора 100 мкм.
- Не разбавить раствор Пи. Стоковый раствор — на 2,4 мм.
- Для каждого образца, взять 50 мкл свежие или талой спермы и добавить 0,5 мкл зеленый люминесцентной пятнать рабочего раствора (конечная концентрация 1 мкм) и 2 мкл раствора PI (конечная концентрация 100 мкм).
- Проинкубируйте образцы, содержащие красители (PI и Зеленый флуоресцентный окрашивание) в темноте за 5 мин.
- Развести образцы в 500 мкл раствора Tanaka´s расширитель и анализировать с проточный цитометр.
- Включите проточный цитометр и создайте новый протокол, содержащий по крайней мере 2 участков: SS журнал журнал против FS и значения параметров FL1 vs FL3.
Примечание: Оба, Зеленый флуоресцентный окрашивания и пропидий йодидом может быть взволнованным с видимыми волны света. При привязке к ДНК, максимум флюоресценции выбросов этих красителей являются 516 Нм и 617 Нм, соответственно.- Отрегулировать напряжение различных лазеров: SS = 199; FS = 199; ЗНАЧЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ FL1 = 377; FL3 = 372
- Настройка приобретения параметры соглашения максимального события = 5000 или 15 s (конечная концентрация образца должна быть около 1 миллион клеток/мл). Прочитайте пример с помощью низкого потока.
- Выберите режим чтения однотрубные фиксированной позиции режима.
- Поместить образец в правильное количество Карусель
- Читайте образец (нажав F9) и сохранить данные, собранные в файл excel (нажатия F7) для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сперма из 18 угрей с сперматозоидов, 70% или выше, был выбран для этого исследования. Результаты показали сокращение всех параметров качества после оттаивания по сравнению с теми из свежей спермы (таблицы 1 и 2). Результаты подвижности (средний ± S.E.M., n = 18) показан выше общей моторики и поступательная подвижность в свежей спермы, чем Общая подвижность и поступательная подвижность в образцах после оттаивания спермы.
Тот же шаблон был найден в анализе быстро сперматозоиды, где представлены ниже соотношение быстро клетки чем свежие образцы деконсервированных образцы. Кроме того сперматозоид скоростей измеряется также были сокращены после оттаивания проб.
Кроме того, результаты показали что жизнеспособность клеток после оттаивания представил сокращение живых сперматозоидов 23 ± 3,1% (средний ± S.E.M., n = 18) от свежих деконсервированных образцов (таблицы 1 и 2).
Рисунок 2 . Подвижность, криволинейная скорость и данных жизнеспособность клеток свежей спермы и талой спермы (после криоконсервирования). Спермы было криоконсервированных за 24 ч до будучи размороженным. Представленные значения являются средства ± S.E.M. спермы из 18 проб. Звездочки показывают существенные различия между образцами талой и свежие (t теста; p < 0,05). Подвижность параметра указывается процент общее количество подвижных сперматозоидов, криволинейная скорость средняя скорость сперматозоидов по криволинейной траектории, а жизнеспособность клеток процент живых сперматозоидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Быстрый + средние клетки1 (%) | 70,7 ± 2,8 | 27,5 ± 2.1* |
| Криволинейная скорость (VCL; мкм/s) | 118.8 ± 2,8 | 101,5 ± 1.8* |
| Прямолинейная скорость (ВУС; мкм/s) | 53.3 ± 1,9 | 45.6 ± 1.3* |
| Средний путь скорость (VAP; мкм/s) | 73,3 ± 2,1 | 62.0 ± 1.3* |
| Победив в Креста частота (Гц) | 27.9 ± 0,3 | 27.1 ± 0,6 |
| Жизнеспособность клеток (% живых клеток) | 97,7 ± 0,3 | 73.8 ± 2.8* |
| 1 Клетки показаны криволинейная скорость выше 40 мкм/сек. | ||
Таблицы 1. Резюме результатов различных параметров, проанализированы с системой анализа компьютерный спермы от образцов свежие и талой. Размороженный образцы были ранее криоконсервированных за 24 ч. Все значения, представленные как средний ± S.E.M. (n = 18). Звездочки показывают существенные различия между образцами талой и свежие (t теста; p < 0,05). Были проанализированы параметры: количество подвижных сперматозоидов, определяется как процент от общего числа подвижных клеток; поступательная подвижность определяется как процент сперматозоидов, которые плавают вперед в основном прямой линии; быстрый и средних клеток, определяется как процент сперматозоидов с средняя криволинейная скорость выше 40 мкм/s; Криволинейная скорость определяется как средняя скорость сперматозоидов через криволинейной траектории; скорость прямой линии определяется как средняя скорость сперматозоидов, измеренная от позиции первого обнаруженного на его последней позиции по прямой линии; средний путь скорость определяется как средняя скорость сперматозоида вдоль его пространственной средней траектории; избиение крест частота определяется как средняя скорость, с которой головы траектории криволинейных спермы пересекает его средний путь траектории; жизнеспособность клеток определяется как процент живых сперматозоидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает полный процесс созревания, обработку и спермы криоконсервация угорь. Описанные здесь условия животноводства являются оптимальными для быстрого созревания и производства больших объемов спермы высокого качества в этом видов 6,7,25. Успех этой криоконсервирования протокола и его возможного использования для оплодотворения после оттаивания сильно зависят от качества свежей спермы 26. Таким образом выделение спермы высокого качества имеет большое значение. Обратите внимание, что оценки качества субъективный спермы зависит от навыков, восприятие и обучение исследователя, который оценивает образцы 5,27,28 и может привести к очень разного качества оценок в зависимости исследователь 29. Таким образом чтобы выбрать лучшие качества образцов для криоконсервирования настоятельно рекомендуется использовать спермы компьютерного анализа.
Результаты после оттаивания спермы качества представленных здесь показали снижение параметров подвижности, скорости и выживание клетки. Это согласуется с доступных библиография, хотя существуют значительные различия между видами 26,30. Например в исследовании с Атлантического лосося (Salmo salar), свежей спермы с моторики 70-95% был заморожен с использованием различных криопротекторов (ДМСО и метанола). Сперматозоидов после оттаивания был значительно ниже, чем в свежих образцов, значениями подвижности в наилучший протокол 8,2%, однако оплодотворение с помощью талой спермы составлял до 42,8%, который представлял 95% управления (свежая сперма) 31. В различные исследования с спермы атлантический палтус (палтус палтус), не значительное снижение подвижности сперматозоидов был найден после криоконсервирования и оплодотворение с помощью талой спермы составлял свыше 95% 32.
В угорь предыдущие исследования также показал снижение подвижности сперматозоидов после криоконсервирования независимо от криопротектора 16,18. Кроме того криоконсервированных спермы от угорь аналогичного качества успешно использовался для оплодотворения 8. В этом исследовании Астуриано et al. в качестве криопротектор ДМСО. Использование ДМСО имеет некоторые недостатки манипуляции, поскольку этот криопротектора активирует спермы и поэтому должны быть немедленно заморожены после добавления ДМСО. Кроме того инсеминация спермой талой должен проводиться сразу же после оттаивания. Снижение рН спермы можно частично решить эту проблему 19, но протокол более тонкий, чем протокол, представленные здесь с метанола как криопротектора.
Несколько исследований показали положительные результаты использования метанола в качестве криопротектора. Например в исследовании, проведенном с японский угорь (Ангилья Айва японская) с помощью весьма аналогичный протокол к представленному здесь, с 10% метанола как криопротектора, авторы успешно оплодотворенные яйца, используя свежие и криоконсервированных спермы. В этом исследовании они получены ставки оплодотворение 17% статистически значимых различий между свежими и криоконсервированных спермы 33.
Протокола, представленные здесь оказалась сохранения достаточного качества спермы после оттаивания и показывают аналогичные характеристики спермы после оттаивания чем протоколы, используя различные наполнители и криопротекторов, но с преимуществами легко предварительной обработки и после криоконсервирования. Очень важно точно следовать охлаждение и оттаивания раз, описанные здесь, а также с использованием высокого качества спермы. В будущих исследованиях оплодотворение испытаний будет испытываться с использованием этого протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта публикация была финансируется Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы под Марии Склодовской-Кюри грантовое соглашение не 642893 (Импрес), Канцелярия стоимость (стоимость действий FA 1205, AQUAGAMETE) и центр передовых научных исследований- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
