Summary
Aqui, apresentamos a ligadura parcial biliar como modelo cirúrgico de lesão hepática e regeneração em roedores.
Abstract
Em roedores, ligadura do colédoco completa (cBDL) do ducto biliar comum é uma técnica cirúrgica estabelecida para estudar a proliferação de colestase e ducto biliar obstrutiva. No entanto, as experiências a longo prazo podem levar a aumento da morbidade e mortalidade. Em cepas do mouse selecione com doença hepática subjacente, uma comparação significativa pode ser feita mesmo com ligadura de um único lóbulo do fígado, que pode reduzir as despesas e perdas de animais. Aqui, descrevemos a ligadura parcial de ducto biliar (pBDL) no rato, no qual é ligado somente à esquerda hepático ducto biliar, causando obstrução biliar no lobo esquerdo, mas não os lóbulos remanescentes. Com cuidado técnica microcirúrgica, experimentos de pBDL podem ser rentáveis, desde que o lobo unligated serve como um controle interno para os lóbulos ligados, quando submetidos às mesmas condições no mesmo animal. Ao contrário da cBDL, um grupo de controle de operação separado não é necessário. pBDL é altamente útil diretamente comparar localizada contra efeitos sistêmicos de colestase e outros componentes da bile retida. pBDL também pode ser reaproveitado como um novo método para investigar os mecanismos relacionados a medicamentos e a migração celular.
Introduction
Modelos cirúrgicos da lesão hepática aguda e reparação, tais como hepatectomy parcial ou ligadura do ducto biliar comum (cBDL), têm sido utilizados há décadas em roedores para estudar a regeneração hepática e Patobiológico1,2. Em cBDL, é ligado o ducto biliar comum (que drena todas bile produzida no fígado), resultando em colestase obstrutiva, inflamação e fibrose nas primeiras 2-3 semanas após a cirurgia, com eventual progressão para cirrose3. Proliferação do ducto biliar, transdiferenciação celular e indução de células progenitoras de fígado residente são também características da cBDL4,5. Embora cBDL elucida mecanismos específicos de cholangiopathy obstrutiva, que são bem caracterizados com resultados reprodutíveis em ratos do selvagem-tipo e nessas cepas com fígados normal6,7,8, o procedimento pode ser tecnicamente exigente em alguns modelos de rato transgénico, doenças do fígado, que exigem mais animais do que o previsto devido à maior morbidade e mortalidade de obstrução biliar, ao longo do tempo. Esta técnica é também benéfica para estudar doença de ratos transgénicos com subjacentes fígado, que não pode tolerar senão o stress das experiências de curso prolongado após cBDL.
pBDL pode fornecer uma alternativa razoável para ajudar a superar alguns desses desafios. Estudos de pBDL inicial em ratos do selvagem-tipo visa distinguir localmente atuante e sistêmicos de mediadores da inflamação9. De pBDL, confluência biliar principal de direita e esquerdas hepáticas biliares acima o ducto biliar comum com cuidado é visualizada no hilo, e apenas esquerdo hepático ducto biliar é ligado para gerar uma colestase obstrutiva localizada. pBDL oferece várias vantagens para cBDL. De pBDL, unligated lóbulo direito serve como um controle interno forma idêntica correspondente para o lobo esquerdo ligado, sujeitado para os mesmos efeitos sistêmicos, tais como o estado nutricional ou fatores de circulação. Embora mediadores pró-inflamatórios sistêmicos estavam presentes, Osawa et al observou menos fibrose e necrose dos lóbulos unligated, mas aumento de células inflamatórias e expressão de crescimento fator-β transformador do lóbulo ligados9.
Mais recentemente, foi redefinido para estudar efeitos parenquimatosos hepáticas da bile retida10pBDL. Usando o mesmo animal para controle interno (unligated "sham") e grupos experimentais, pBDL metades efetivamente o número de animais necessários por experiência, que por sua vez, é mais rentável. Os ratos toleram os efeitos de pBDL muito melhor, para que o tempo ideal de curso experimentar (≥2 semanas) podem ser alcançadas no lóbulo ligado. Mais importante ainda, pBDL pode distinguir efeitos directos de colestase da colestase obstrutiva e retidos componentes da bile no lóbulo ligado, em comparação com o lobo de unligated controle. Em geral, pBDL é um método atrativo para estudar efeitos específicos do lóbulo da colestase localizada no fígado.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes éticas do Comité de uso da Universidade de Pittsburgh e institucional Cuidado Animal.
1. básicas técnicas e procedimentos comuns
- Autoclave todo equipamento microcirúrgico antes do uso.
- Para evitar matar o rato pela anestesia, verificar cuidadosamente seu padrão de respiração.
- Órgãos de toque e intestinos o mínimo possível para evitar danificar os órgãos e causando sangramento. Pressione pontos de sangramento com cotonetes de algodão molhado ou esponjas de gaze.
- Use cotonetes de algodão molhado para manipulação suave dos órgãos. Esponjas de gaze molhada, não-tecidos são utilizadas em dois tamanhos, 3.5 × 3,5 cm e 6,0 × 6,0 cm. usam o menorzinho para retrair o fígado inteiro. Use o maior para embrulhar os intestinos pequenos e grandes.
2. pré-operatória preparação
- Use Camundongos c57/b6 do sexo masculino, 8-12 semanas de idade (quando o peso do corpo é aproximadamente 20-35 g) para ligadura parcial de ducto biliar.
- Permitir que os ratos livre acesso à água e comida até a indução da anestesia.
3. parcial biliar ligadura operação
- Anestesia o mouse, colocando o animal em uma câmara de indução com uma mistura de 1,5-2,0% de isoflurano e 1 L/min de oxigênio. Monitore o animal cuidadosamente observando-se a taxa de respiração. Quando a taxa de respiração do animal é uma respiração por segundo, o rato é bem anestesiado. Desde que o reflexo de retirada do membro dianteiro desaparece mais rapidamente, aperte o pé do membro posterior também para confirmar a ausência completa do reflexo de retirada. Os olhos devem ser lubrificados com um agente lubrificante oftálmico para evitar úlceras da córnea. Nota a primeira dose de analgésico pode ser dado pré-operatório para prevenir a estimulação dos receptores de dor.
- Raspar a parede abdominal com máquina de cortar cabelo e coloque o mouse em cima da mesa cirúrgica sob o microscópio cirúrgico. Corrigi todos os membros para a mesa com a fita. Use a inalação de isoflurano para manter o rato sob anestesia geral.
- Ajustar o vaporizador de isoflurano e usar isoflurano 2.0-3.0% para indução.
- Usando cotonetes estéreis, desinfectar a parede abdominal primeiro com 0,3-0,5 mL de iodo-povidona aplicado topicamente, seguido por 70% de etanol. Animal deve ser coberto com um pano estéril.
- Fazer uma longa abdominal incisão do xifoide até o púbis, usando a tesoura e pinça Adson. Depois de fazer a incisão abdominal, reduzir isoflurano 0.8-1.0% para manutenção.
- Expor na cavidade abdominal por meio de um Microafastador. Segure o xifoide com pinça mosquito e retrair-se em direção a cabeça do rato. Fixar a pinça mosquito com argila macia.
- Instilar 1 a 2 mL de aquecida (37 ° C) esterilizado fosfato salino (PBS) na cavidade abdominal para evitar ferir os órgãos abdominais. Segure o intestino delgado com compressas de algodão molhado e retrair-os suavemente em direção a cabeça do rato. Corte os ligamentos entre o intestino delgado e o retroperitônio para evitar ferir o intestino delgado (figura 1A).
- Enrole os intestinos pequenos e grandes com uma gaze molhada, não-tecidos. Coloque-os no lado caudal da cavidade abdominal. Intestinos, envolvidos em gaze estéril podem ser colocados no Campo drapeado estéril para evitar contaminação.
- Gentilmente retrai o fígado inteiro em direção a xifoide usando um pequeno molhado não-tecido de gaze para expor o Hilo hepático e ligamento hepato-duodenal (figura 1B).
- Verificação para confirmar a anatomia do hilo hepático. O ducto biliar comum está localizado no lado ventral da veia portal. Confirme os locais do direito e o ducto biliar hepático esquerdo, que drenam para a confluência biliar principal no hilo hepático.
- Identificar o ducto biliar hepático esquerdo que drena o lobo esquerdo e cercá-lo com uma sutura de nylon 10-0 usando o lado sem corte de uma agulha de sutura (Figura 2A). Evite ferir a superfície hepática, artéria hepática e veia porta.
- Ligate do ducto biliar esquerdo com nylon 10-0. (Figura 2B).
- Coloque os intestinos pequenos e grandes na mesma posição que antes da operação, usando cotonetes de algodão molhado.
- Confirmar que não há nenhuma torção intestinal e hemorragia abdominal e, em seguida, feche o músculo e a pele em duas camadas com vicryl 4-0. Sutura trançada (Vicryl) foi usada para fechamento da pele, mas é preferível monofilamento para reduzir a probabilidade de infecção.
Nota: Feche a fáscia por sutura contínua do xifoide ao púbis e fechar a pele por sutura contínua do púbis ao xifoide. - Pare de anestesia depois de fechar a incisão.
4. acompanhamento e tratamento pós-operatório
- Só após a cirurgia, beliscar a pele dorsal do mouse e injetar Buprenex (0,1 mg/kg) e cefazolina (100 mg/kg) por via subcutânea, seguido por Buprenex injeção cada 12 h por 3 dias e cefazolina cada 24 h por 3 dias respectivamente11,12 ,13. Nota a primeira dose de analgésico pode ser dado pré-operatório para prevenir a estimulação dos receptores de dor. Cefazolina e outros antibióticos de peri-operatório são necessários apenas para animais imunitário suprimido, como aqueles usados em estudos de transplante.
Nota: Se a cirurgia é realizada com êxito, o mouse geralmente se recupera dentro de 30 min. actividade dos ratos será quase o mesmo que a condição pré-operatória. - Verifique os ratos diariamente por sinais de aflição.
- Sacrifica os ratos pelo deslocamento cervical sob anestesia geral para adquirir fígados e outras amostras de tecido em pontos de tempo definido (isto é, 7, 14, 21 dias) depois de pBDL.
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Representative Results
Para este experimento típico, pBDL foi realizado em ratos transgénicos triplicados PiZ, que recapitular a doença do fígado humana encontrada na deficiência de alfa-1 antitripsina (A1AT). O rato de PiZ overexpresses um transgene consiste em múltiplos fragmentos genomic do DNA que contêm as regiões codificação do gene humano mutante de A1AT e promotor, em conjunto com os intrões e ~ 2 kilobases de upstream e downstream flanqueiam regiões14, 15. Normal A1AT é uma proteína secretada soro produzida no fígado. A forma mutante do A1AT gera agregados de proteína insolúvel que espontaneamente se acumulam no fígado causando estresse tóxico. Os experimentos utilizaram 3 mês de idade camundongos machos PiZ, que expressam o fenótipo mais grave da doença, quando a agregação da proteína picos de16.
Biochemistries soro fígado foram comparados de pBDL e cBDL PiZ ratos (tabela 1)10. As enzimas hepáticas alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) são biomarcadores de lesão hepatocelular, enquanto bilirrubina total de soro (TSB) mede o grau de colestase. Em geral, ratos submetidos de pBDL não mostrou sinais de lesão hepática grave ou colestase, como seus valores de soro foram semelhantes a base10. É importante observar que ratos com pBDL falha (devido a problemas técnicos, tais como o ducto biliar ou lesões vasculares) irão mostrar valores de soro semelhante aos ratos cBDL, com enzimas hepáticas elevadas significativamente e TSB. Clinicamente, ratos com pBDL falha aparecerão mais icterícia e angustiado, com achados de vazamentos biliares, ascite, peritonite e/ou hematoma e, finalmente, vão precisar ser sacrificado.
Desde que os ratos submetidos de pBDL desenvolvem colestase obstrutiva específicas do lóbulo, não adquirem a vesícula biliar distendida, escura, cheio de bile vista em cBDL. Apenas o lóbulo ligado aparece mais pálido na cor, enquanto os lóbulos unligated manterá sua coloração normal, escura, marrom-avermelhada (Figura 3). Existem diferenças importantes na histologia hepática, bem como, com a proliferação de aumento ducto biliar e fibrose no lóbulo ligado (Figura 4). 10
Tabela 1: Biochemistries representante soro fígado de ligadura parcial de ducto biliar (pBDL) em relação ao completar a ligadura do ducto biliar (cBDL) 10 . Cada ponto de tempo representa 3-4 ratos. Nota PiZ ratos transgénicos são sobre um fundo c57/bl6. Intervalos de referência de laboratório também são dadas entre parênteses. (WT, selvagem-tipo; TSB, bilirrubina total de soro; ALT, alanina aminotransferase; ALP, fosfatase alcalina).
Figura 1:exposição de abdominal cavidade e vilosidades sistema. (A) intestino delgado estão retraídos suavemente para evitar a lesão do intestino, e os ligamentos conectando são cortados livres de retroperitônio. (B) fígado é delicadamente retraído para permitir a máxima visualização da árvore biliar no hilo hepático (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Ligadura parcial biliar. (A) o fim brusco da agulha cirúrgica é usada para cercar cuidadosamente a sutura de nylon ao redor do ducto biliar hepático esquerdo, acima da confluência com o ducto biliar comum (original ampliação 40 x). (B) sucesso ligadura do ducto biliar hepático esquerdo, que normalmente drena o lobo esquerdo do fígado. Os ductos biliares remanescentes são unligated (ampliação original 40 X). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: bruta de aparência no fígado de rato WT (c57/b6) 14 dias depois de pBDL. Observe que o lobo esquerdo ligado aparece mais pálido na cor (setas), enquanto os lóbulos unligated mantém sua coloração normal, escura, marrom-avermelhada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Lobo específico muda em secções de tecido hepático representativa de pBDL dia 14 comparando o lóbulo direito unligated (R) ligados à esquerda no lóbulo (L) em camundongos WT (c57/b6). (A) hematoxilina e eosina (H & E) coloração mostrando aumentada ducto biliar proliferação (setas) no lóbulo ligado. (B) Sirius vermelho mancha apresentando fibrose ponte que acompanha a proliferação do ducto biliar no lóbulo ligado. Histologia para o PiZ rato tem sido anteriormente relatados10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora cBDL é a mais comum técnica experimental para colestase obstrutiva, pode apresentar vários desafios em roedores. Dependendo do número de dias pós-operatórios necessários para alcançar um ponto de extremidade, os animais podem experimentar significativa morbidade e mortalidade que o tempo avança. O grau de lesão tecidual e necrose biliar é ainda agravado quando se trabalha com alguns modelos de rato transgénico de doença hepática, que demonstram o parênquima hepática anormal e função na linha de base. Comparado a cBDL, relatórios de pBDL são limitados, mas esta técnica pode ser aplicada como uma alternativa em selecionados experimentos para reduzir resultados negativos e perdas de animais.
Variações no método de pBDL também têm sido relatadas. No método de Heinrich et al, uma agulha curva externa situa-se adjacente ao ducto biliar comum, seguido por ligadura ao redor tanto o ducto biliar comum e a agulha de17. A agulha é então removida antes da sutura da parede abdominal, resultando em fluxo de bile limitada através de um estreitamento lúmen (ou seja, obstrução subtotal) do ducto biliar17. Durante este procedimento, a vesícula biliar também é levada para evitar colecistite17. Os autores concluíram que este método era mais benéfico para estudar colestase aguda ao invés de alterações crônicas17. Em contraste, o método de pBDL que descrevemos aqui é estritamente controlado, com lóbulos ligados e unligated ("sham") no mesmo animal, para que menos animais são necessários por experiência. Mesmo transgénica dos ratos com doença grave do fígado subjacente pode ser sustentada por mais pontos de extremidade (2-3 semanas). Deve ter cuidado para totalmente expor e identificar a árvore biliar, usando técnicas de microdissection, com limitado manipulação de estruturas vasculares e biliares para evitar ferimentos.
No experimento ideal, os tecidos de lóbulos ligados (à esquerda) e unligated (à direita) vão ser colhidos ao mesmo tempo, para que comparações diretas da função secretora de bile e transportadores podem ser feitas usando técnicas histológicas e moleculares. Embora biochemistries soro fígado não refletirá a colestase grave, o lóbulo ligado irá demonstrar alterações histológicas associadas a colestase obstrutiva10. Este modelo é útil para estudar os efeitos microenvironmental directos dos componentes da bile retida (por exemplo, os ácidos biliares, lipídeos, colesterol) dentro do fígado. Como um estudo futuro, pBDL pode ser considerado para investigar cholehepatic "manobras", onde certos ácidos biliares e drogas são reabsorvidas diretamente do cholangiocytes de hepatócitos18,19. Endógenos ácidos biliares conjugados ineficiente pelos hepatócitos passivamente são absorvidos pelo epitélio biliar submeter-se a cholehepatic bem como a derivação, levando a hypercholeresis e alkanlinization de bile pela secreção de bicarbonato aumento20. Aplicação da técnica de pBDL poderia facilitar a descoberta de drogas através da identificação de mecanismos farmacológicos para novos ácidos biliares terapêutica sob investigação por doença hepática.
Pedidos adicionais de pBDL podem estender além da árvore biliar. Reversibilidade da cBDL e seus efeitos associados tem sido descrita, e isto também pode ser aplicado de pBDL com comparação direta, o controle interno21. Da mesma forma, longitudinal na vivo bioimaging da expressão de repórter fluorescentes em fígado de rato estudado depois cBDL22, com poderosas implicações para experimentos de pBDL. Além disso, roedores experimentos usando de pBDL têm o potencial para incorporar o rastreamento de linhagem ou "orientação" de células, como células mesenquimais derivadas da medula óssea, para o local da lesão hepática, permitindo que eles sejam monitorados na vivo com mais de circulação precisão de23,24,25.
Claramente, há pedidos generalizados de pBDL sozinho como uma técnica internamente controlada e reprodutível para estudar a reparação, juntamente com o metabolismo de Fisiologia e drogas biliar e lesão hepática. Para experimentos que visam avaliar a progressão e efeitos sistêmicos de colestase crônica, cBDL ainda é o método preferencial; no entanto, pBDL ainda gostaria de acrescentar dados complementares para apoiar tais achados.
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Disclosures
Os autores têm sem divulgações.
Acknowledgments
Dr. Khan reconhece apoio de concessão da K12HD052892 NIH/FORMULADORES, a Alpha-1 Foundation, Fundação Hillman e centro de pesquisa do fígado de Pittsburgh. Dr. Michalopoulos reconhece apoio de concessão do NIH/NIDDK P01DK096990. Agradecemos a assistência técnica excelente e generosa de Anne Orr. Nós também estamos gratos ao Dr. David A. Geller para fornecer acesso ao laboratório de microcirurgia do transplante/roedor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope-Leica Wild M650, 6–40× magnification | Leica Microsystems | n/a | |
| Tec 3 isoflurane funnel fill vaporizer | General Anesthetic Services | n/a | |
| Stevens Tenotomy Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation | ASSI.9193 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | |
| Mosquito classic delicate hemostatic forceps | Codman | 30-4472 | |
| Micro-retractor | Murdock; Roboz Surgical Instrument | RS-6550 | |
| Nonwoven gauze sponges | Fisherband | 870-PC-DBL | |
| Puritan 6” Small Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company | 868-WCS | |
| Dumont SS Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-23 | |
| Dumont SS Forceps - Standard Tips/Angled 45°/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-25 | |
| Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge | Fine science tools | 15000-00 | |
| Microneedle holder | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | |
| Micro AROSuture, sterile 10-0 nylon suture, 70 µm, TAP points | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J662H | |
| 5-ml Syringe | BD | 309646 | |
| Falcon tissue culture dish, 60 × 15 mm | Corning | 353002 | |
| Isoflurane, United States Pharmacopeia (USP) liquid for inhalation, 250 ml | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | |
| Buprenex injectable (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496-0757-1 | |
| Cefazolin for injection , USP | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-238-61 | |
| PVP scrub solution (povidone–iodine 7.5%) | Medline | NDC 12496-0757-1 | |
| 70% Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Phosphate Buffered Saline Without Calcium or Magnesium | LONZA | 17-516F | |
| Sirius Red | Sigma | 365548 | |
| Hematolxylin | Fisher (Richard-Allan Scientific) | 22-050-111 (7211) | |
| Eosin | Anatech (Fisher) | 832 (NC9686037) | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 |
References
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