Summary
نقدم هنا بروتوكولا لزيادة إنتاج الوهم دون الاستخدام المعدات الجديدة. يمكن تغيير اتجاه بسيط للجنين لحقن زيادة عدد الأجنة المنتجة، ويساعد على تقليل الفترة الزمنية لنقل الخط.
Abstract
في محاولة لزيادة الكفاءة في خلق الفئران المعدلة وراثيا عن طريق منهجيات خلية دإط، نقدم لتكيف لبروتوكول الحقن الكيسة الحالي. هنا يمكننا تقرير أن دوران بسيطة للجنين، وحقن من خلال كتلة الخلايا الداخلية عبر (تكم) زيادة النسبة المئوية للفئران تشيميريك من 31 في المائة إلى 50 في المائة، مع أي معدات إضافية أو مزيدا من التدريب المتخصص. 26 مختلفة فطري الحيوانات المستنسخة، وتم حقن الحيوانات المستنسخة إجمالي 35 خلال فترة 9 أشهر. كان هناك لا اختلاف كبير في معدل الحمل أو معدل الاسترداد الأجنة بين تقنيات الحقن التقليدية وتكم. ولذلك، دون أي تغيير رئيسي في عملية الحقن والمواقع بسيطة الكيسة والحقن من خلال ICM، الإفراج عن خلايا ES في تجويف blastocoel يمكن أن يحتمل أن تحسين كمية الإنتاج تشيميريك واللاحقة نقل الخط.
Introduction
لما يقرب من 25 عاماً، تم إنشاء الفئران وراثيا المستهدف عملية بطيئة، كثيرا ما تعرقل باختناق في مرحلة microinjection blastocysts دإط الخلايا لتوليد germline تحيل التركيبات. التطورات الأخيرة، بما في ذلك كريسبر/Cas91،2 استهداف دإط الخلايا ووفاق الفائق الخلية اتحادات جيل مثل كومب، تحسنت الجيل/توافر دإط الخلايا المحورة وراثيا. ومع ذلك، يظل توليد التركيبات germline عنق زجاجة في خلق الفئران المعدلة وراثيا من هذه الخلايا ES3،4. مشاريع توليد خلايا ES الفائق ابتليت بتقلب عالية في وفاق خلية الجودة، هو أمر حاسم لنجاح إنشاء التركيبات germline. بالإضافة إلى ذلك، بعض خطوط الخلية ES المستخدمة عادة معروفة انيوبلويدي العالية، وصعوبة إنتاج germline التركيبات المختصة5.
تم تطوير العديد من الأساليب لخلق الفئران مع أما حلما أعلى، أو تماما المستمدة خلية ES الفئران6،،من78،،من910. بينما كل من هذه الأنظمة له مزاياه الخاصة، كما أن لها عيوبها. توليد التركيبات تيترابلويد، في حين توليد 100% وفاق الخلية المستمدة من الفئران، غير فعالة، وتقتصر عموما على خطوط أووتبريد 5،6. أحدث أساليب الحقن morula يمكن أن تسفر عن ارتفاع نسبة التركيبات، تقترب من 100%، لكن عموما تتطلب معدات إضافية هامة (أشعة الليزر أو بيزوس) وتدريب10،11. في المختبرات حيث هذه التقنيات موجودة بالفعل، قد لا تكون هذه المنهجية الجديدة الضرورية.
وكان الهدف من هذه الدراسة لإيجاد أسلوب يستخدم التقنيات الشائعة والمعدات متاحة بسهولة لزيادة معدل توليد الوهم، وزيادة فرصة انتقال germline اليل متحولة لإنشاء مستعمرة الماوس اللاحقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع العمليات كجزء من العمل العادي لمرفق "نيس تدق الماوس خارج الأساسية". وأبقى جميع الفئران في 12:12 دورة ح الضوء: الظلام، وكانت تتغذى على نظام غذائي من المعاهد الوطنية للصحة-31 والمياه متواصلة ad. جميع التجارب التي أجريت وفقا للعناية بالحيوان واستخدام اللجنة للوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية.
1-إعداد الحيوان
- تتكاثر الفئران المانحين، B6 (Cg)-صور < ج-2J > الفئران الإناث/J في 8-10 أسابيع عمر بطبيعة الحال إلى B6 (Cg)-صور < ج-2J >/J الفئران الذكور بين 8 و 26 أسبوعا من العمر. افحص المقابس بصريا في صباح اليوم التالي (E0.5).
- تتكاثر الفئران المستفيدة، "بستر السويسرية" هي بطبيعة الحال ولدت الفئران الإناث بين 6 و 9 أسابيع من العمر للفئران الذكور "وبستر السويسرية" استؤصل الاسهر لديهم. افحص المقابس بصريا في صباح اليوم التالي (E0.5).
2-إعداد الخلية ES
- 129-ديريفيد AB2.2 ES الخلايا، ثقافة الخلايا في دميم وتستكمل مع 15% FBS، 1% الجلوتامين و 1% بنسلفانيا/بكتيريا و 0.1% β-ميركابتوثانول. ثقافة جميع دإط الخلايا الأخرى كل تعليمات ES خلية المورد، باستخدام البروتوكولات الموصى بها.
3-الأجنة جمع
-
تشريح الحيوان
- إعداد عدة أطباق 60 ملم، ما يقرب من 1 كل الفئران 5 زائد 3 إضافية، مع 10 مل انفجار جمع وسائل الإعلام (بليون متر مكعب) (10% FBS في دميم)، وكذلك طبق 4 واحد مع مل 0.5 بليون متر مكعب في بئر. حجته على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
- Euthanize B6 (Cg)-صور < ج-2J > الفئران الإناث/J في E3.5 استخدام CO2 الخنق، مع معدل تدفق بنسبة 10%.
- وبعد يوثانيزينج، وضع الفئران في موقف ضعيف والرطب في البطن جيدا مع الإيثانول 70%.
- جعل الشق الأول من خلال الجلد فقط، في منتصف البطن، مما يجعل فتح أوسع نطاق ممكن. بعد فتح من خلال جدار البطن، مرة أخرى مما يجعل شق أوسع نطاق ممكن.
ملاحظة: القيام بذلك في خطوتين يساعد على الحد من أو القضاء على التلوث الفراء. - بدءاً مبيض، ويحمل لوحة الدهون المبيض مع الملقط حادة، بعناية إزالة المبيض، قناة، والرحم، واتخاذ المزيد من الحيطة للحفاظ على الأنسجة الدهنية إلى الحد أدنى. إزالة الرحم كوحدة واحدة، أو كأبواق الفردية، بدون أي تغيير في الإجراء التالي.
- بعد الإزالة، مكان الرحم في طبق 60 ملم تحتوي على انفجار جمع وسائل الإعلام.
-
إزالة الجنين
- إعداد حقنه 10 مل مليئة بليون متر مكعب، وتناسب مع إبرة 25 جرام.
- الرحم واحد في كل مرة، بإزالتها من طبق عقد بليون متر مكعب، لطخة لهم في أنسجة لإزالة الدم الزائد، ووضعه في طبق 60 ملم تحت تكبير منخفضة تشريح مجهر.
- أثناء الضغط بعناية ولطف الرحم أسفل النهاية البعيدة (بالقرب من قناة) مع تشريح الملقط، إدراج الإبرة من الرحم في وسط التوازي طائرة قدر الإمكان. أدخل إبرة أبعد من مجرد النصائح من الملقط.
- تطبيق بعض الضغوط على الملقط عقد الرحم بالإبرة، وطرد حوالي 1 مل من بليون متر مكعب خلال القرن الأفريقي الرحم.
ملاحظة: يجب الحرص في هذه الخطوة، سوف يسبب الكثير من الضغط في المحاقن دفق لا يمكن السيطرة عليها من وسائل الإعلام، وكثيراً ما يترك الطبق. - بعد التنظيف الرحم، والتي تصل إلى 5 كله كل طبق 60 مم، ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة حتى جمع.
-
جمع الجنين
- استخدام ماصة زجاج مرسومة يد، وجهاز ماصة فم، جمع blastocysts تحت نطاق تشريح، تعيين بين 25 X و 35 س. (الشكل 1).
ملاحظة: الفم ماصة جهاز يتألف من 30-40 سم أنابيب مرنة، وإدراج تحت 5 ملم معرف من 1، 000 نصيحة ماصة ميليلتر، تشير أولاً إلى نهاية واحدة، وإلصاق ماصة زجاجية في ذلك. إضافة عامل تصفية حقنه في الطرف الآخر، مع مرفقة 1 cc حقنه لبرميل، لا المكبس، بمثابة قطعة فم. - إزالة الأطباق من الحاضنة، واستخدام نمط شبكة، تفحص كل جزء من الطبق للأجنة. يتم انتقاء الأجنة فردياً، ووضع على قطره من بليون متر مكعب في طبق ثانوي.
- بعد جمع من جميع الأطباق، تغسل الأجنة مرة أخرى في قطره جديدة بليون متر مكعب، ومن ثم ضع الطبق جيدا 4 انتظارا لحقن.
- استخدام ماصة زجاج مرسومة يد، وجهاز ماصة فم، جمع blastocysts تحت نطاق تشريح، تعيين بين 25 X و 35 س. (الشكل 1).
4-الجنين حقن
- التقاط دإط الخلايا على حدة مع إبرة حقن استناداً إلى تأكيد.
- تحضير طبق حقن بإضافة 5-7 مل من حقن وسائل الإعلام (دميم، 10% FBS و 20 ملم حبيس) إلى طبق حقن أسفل زجاج. الحقن تتم في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام الهواء أو زيت ميكروينجيكتور، تنطبق فراغ إبرة حقن رسم خلايا ES. الحرص على الحفاظ على مساحة صغيرة قدر الإمكان بين الخلايا. عد الخلايا ES هنا، أو في خطوة الحقن.
- حدد دإط الخلايا التي هي المتوسطة وصغيرة الحجم بالمقارنة مع السكان عموما من الخلايا، مع سطح أملس، والخالية من العيوب الواضحة مثل فاكوليس.
ملاحظة: الخلية ES السكان تختلف اختلافاً كبيرا في نوعية المورفولوجية، والمعايير المستخدمة وسوف تحتاج إلى ضبط معهم.
- حقن الأجنة بحوالي 15 دإط الخلايا (الشكل 1).
- إرفاق ماصة القابضة نصيحة ميكروينجيكتور جوية ثانية، ووضع جنين قرب افتتاح الحامل. تطبيق فراغ لتأمين الجنين إلى الحامل.
- ضبط للمحور z بتحريك ماصة القابضة لأعلى أو لأسفل حتى أن مجرد لمس الجنين الشريحة، متبوعاً بغرامة يركز زونا. المقبل، ضبط المحور Z من إبرة حقن حيث تكون خلايا ES قرب الحافة في التركيز.
- ضبط الجنين الآن بدفع بلطف من إبرة حقن في الجزء العلوي أو السفلي، الدورية لوضع ICM في الموضع المطلوب.
- أدخل إبرة حقن من خلال زونا، وأما ICM أو تروفوبلست، استخدام ضغط الثابت الخاضعة للرقابة. تطبيق ضغط طفيف على ميكروينجيكتور إبرة الحقن للمساعدة في الحفاظ بلاستوكول من الانهيار.
- الضغط مرة واحدة قد اخترقت الإبرة بلاستوكول، من ميكروينجيكتور لنقل خلايا ES إلى بلاستوكول للجنين. يبدأ وقفه بإيجاز المجسم مشطوف الحواف الإبرة لخروج الجنين إلى السماح الضغط في الجنين إلى العودة إلى وضعها الطبيعي، في حين لا يزال الإبقاء على الخلايا.
ملاحظة: تم حقن خلايا ES المجموعة المرجعية عادة، عقب وفاق تقليدية الخلية حقن البروتوكول9، مع الحرص على عدم لمس ICM. أيضا تم حقن دإط الخلايا عن طريق ICM، دفع الإبرة مباشرة من خلال ICM (تكم) (الشكل 2، فيلم تكميلية).
5-نقل إمبريس
- نقل أجنة للفئران "السويسرية وبستر" في E2.5، باستخدام جهاز نقل جنين غير جراحية، كل الإجراءات للتصنيع. لا يتطلب هذا الإجراء غير الجراحي أي تخدير أو الرعاية بعد العملية الخاصة. بيت الفئران على حدة بعد نقل الأجنة، ومن خلال الولادة والفطام اللاحقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
علاج خط الخلية كأثر عشوائي، استخدم نموذج خطي آثار مختلطة لتحليل البيانات في البرنامج (مثل محركات أقراص SAS (الإصدار 9.2)). تحليل كل الخاضعة لعدد الأجنة المنقولة وخط الخلية. التحليل الثاني يسيطر أيضا على عدد من الجراء التي نجت.
لهذه الدراسة، كل خط الخلية وفاق واستنساخ تم حقن على حد سواء مع التقليدية وتقنيات تيكم، بالتناوب بين هاتين الطريقتين بعد كل الأجنة. بعد الحقن، فصل في الطبق وتجميعها بواسطة نقل، وعموما بين الأجنة 12 و 15 كل مستلم الإناث الأجنة. الأجنة التي لم يكن بلاستوكويل واضحة للعيان، تفتقر إلى Zona pellucida، أو حيث فشلت دإط الخلايا ميكروينجيكتيد للدخول بلاستوكويل، وأزيلت من هذه التجربة.
وكان أول بيانات فحص معدل الحمل. كما هو موضح في الشكل 3، كانت معدلات الحمل دون تغيير في المجموعة تكم من السيطرة على المجموعة. بالإضافة إلى ذلك، نجا نسبة متساوية من الجراء للفطام (P = 0.50، الرقم 4). الأهم من ذلك، بينما عدد الفئران في الفطام لم يتغير، عدد الجراء عرض تشيميريسم لون معطف ارتفع من 31% إلى 50% للمجموعة تكم (p = 0.005، الرقم 5). واعتبر درجة تشيميريسم لون معطف ذاتية جداً ليتم تقييمه في هذه الدراسة، وليس حقاً ذات الصلة بالفعل تشيميريسم.
رقم 1: المعدات المتخصصة. (اليسار) حقن مجهر الإعداد، بما في ذلك المتلاعبين الصغرى (A) والهواء الترام الخلية (ب) . (اليمين) أجهزة ماصة الفم، مع ماصة زجاجية مرسومة (ج) ، (د) 1000µL ماصة نصيحة والأنابيب (ه) ، التصفية (و) والمحاقن (ز) للبرميل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: مثال لحقن الأجنة الكيسة. (أ وب) أسلوب الحقن التقليدية، حيث يدخل إبرة حقن مقابل من ICM، تجنب أي تفاعل مع ICM. (ج، د) أسلوب تكم، حيث يدخل إبرة حقن مباشرة من خلال مؤسسة أي سي أم في blastocoel. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: معدل الحمل. أن معدل الحمل أظهرت لا يوجد فرق كبير بين التقليدية (39/50) وتكم (64/76). المتوسطات بالإضافة إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: معدل البقاء على قيد الحياة- معدل البقاء على قيد الحياة هو عدد الجراء التي نجت للفطام، حيث كان هناك القمامة إلى فطم. الجراء التي لم ينج للفطام، وليتر حيث نجا لا الجراء للفطام، لم تدرج في هذه البيانات. المتوسطات بالإضافة إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 5: معدل تشيميريسم- تمثل هذه البيانات فقط العدد إذا التركيبات أنتجت، ولا تعالج نوعية تشيميريسم. في المجموعة التقليدية، أظهرت 31% (34/110) من النسل تشيميريسم، حيث كان الفريق تيكم بمعدل 50% (79/158). في المتوسط، بالإضافة إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكان يعتقد منذ فترة طويلة أن أي اضطراب الرياضيات يمكن أن يؤدي إلى وفيات، في الواقع، بروتوكولات microinjection الكيسة الحالي ما زال التحذير من هذا12،13. ما أثبتنا هنا أن microinjection من خلال مؤسسة أي سي أم لا يضر بالجنين، وزيادة عائد التركيبات.
لا تم التعرف على الآلية الدقيقة لهذا الغرض. ومع ذلك، تعطل الميكانيكية في الرياضيات، و hypoblast المصاحبة لها، ينبغي زيادة حدوث وفاق خلية إدماج ICM المشكل حديثا بعد microinjection. وقد أظهرت عمل مؤخرا في مجال إيبسكس أن التحفيز الميكانيكي ويساعد في إعادة برمجة الإنسان [ايبسك]14. إذا كان التلاعب ميكانيكية تأثير مماثل في مؤسسة أي سي أم للجنين الماوس، فإنه يمكن أن يترتب عليها عودة خلايا ICM التي يحتمل أن تكون قد بدأت في التفريق، مرة أخرى إلى حالة pluripotent، إزالة احتمال 'السبق' من الجهة المانحة الكيسة المشتقة من الخلايا في تشكيل الأنسجة الجنينية. وأخيراً، فمن الممكن أن الحقن من خلال نتائج ICM في وفاة عدد غير معروف من الخلايا في ICM، خفض مستوى المنافسة ميكروينجيكتيد وراثيا تعديل دإط الخلايا.
الفوائد الرئيسية لتعديل هذا الأسلوب أنه يتطلب لا التعلم الجديدة، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، أو المعدات. جميع التقنيات التي تحمل أكثر من حقن الكيسة القياسية. الخطوات الأكثر أهمية أيضا تظل دون تغيير؛ جمع المناسب وفي الوقت المناسب للأجنة، وشروط الثقافة المناسبة للأجنة قبل وأثناء وبعد الحقن. عند استخدام تقنية نقل الأجنة غير الجراحية، فأصبح أكثر أهمية لتحديد الفئران المستلم الصحيح. كان الجراح بالتحويلات الجراحية، الفرصة لدراسة الماوس للتحقق من حالة الإنجابية السليمة، حيث مع التحويلات غير الجراحية، هذا غير ممكن. ينبغي أن تكون الفئران في سن الإنجاب رئيس الوزراء (6-9 أسابيع)، وينبغي أن تستخدم فقط من الفئران مع المقابس مرئية. الجانب الأكثر أهمية لهذا الأسلوب، ووفاق كل خلية الحقن، هو نوعية دإط الخلايا.
عند التعامل مع جودة عالية، وخطوط الخلايا قوية، هذا الأسلوب قد تسفر عن الاختلافات الحد الأدنى فقط، ولكن مع وفاق الأمثل الخلية خطوط أو صعوبة في العمل مع خطوط، أي، حتى التحسينات الطفيفة، يمكن أن تكون كبيرة وجعل الفرق بين نجاح المشروع وفشل. وأيضا من ملاحظة، أن خلال هذه الدراسة، عدة خطوط الخلايا ES المتاحة تجارياً إنشاء التركيبات germline، وجميعهم تقريبا الخطوط ES التجارية التي ولدت التركيبات germline حقن تكم. هنا أننا أظهرنا أن تغيير بسيط في أسلوب يمكن أن يؤدي في تحسن كبير في الإنتاجية، دون تكبد أي تكاليف إضافية لمعدات جديدة، أو التدريب، أو زيادة استخدام الحيوانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا المصالح المتنافسة الكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث [جزئيا] "برنامج البحوث الداخلية" للمعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية. خاص بفضل بيدادى شيامال للتحليل الإحصائي. كما نود أن نشكر ياو همفري والطيور غاري اراو يوكي لاستعراض هذه المخطوطات، و "ديمايو فرانكو" لمواصلة تقديم الدعم والمشورة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al.
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
