Summary
ここで新しい機器を使用せずキメラを増産するためのプロトコルを提案する.胚の注入のための簡単な方向の変更は生産、胚の数を増やすし、潜在生殖するタイムラインを削減できます。
Abstract
ES 細胞の方法論による遺伝子改変マウスの作成の効率を上げるために、現在の胚盤胞の注入のプロトコルへの適応を提案する.単純な回転胚とトランス内部細胞塊 (TICM) を注射が追加の機器の 50% 31% からキメラマウスの割合を増加またはさらに特殊な訓練を行った。26 の異なるクローンを近交系し、9 ヶ月の期間にわたって 35 合計クローンを注入しました。伝統的な注入技術と TICM 間妊娠率や胚の回収率に有意差はありませんでした。したがって、注入プロセスと胚盤胞の単純なポジショニングと ICM を注入することですべての主要な変更、なし胞胚腔腔に ES 細胞を解放可能性があります向上できますキメラの生産、その後量生殖。
Introduction
約 25 年間、遺伝子ターゲットのマウスの作成は生殖系列キメラを送信の世代のため、胚盤胞 ES 細胞インジェクション段階でしばしばボトルネックによって妨げ、ゆっくりとしたプロセスをされています。CRISPR/Cas91,2 ES 細胞と高スループット ES のターゲットを含む、最近の進歩は携帯サイト制作のような生成コンソーシアム、遺伝子組み換え ES 細胞の生成/可用性を改善しています。ただし、生殖巣キメラの生成は、これらの ES 細胞3,4から遺伝子改変マウスの作成にボトルネック残ります。高スループット ES 細胞世代プロジェクトは、生殖系列キメラの作成に成功のために重大である ES 細胞質の高い変動に悩まされています。さらに、一般利用の ES 細胞株の高い異数性と生殖系列キメラ主務5の困難な生産の知られています。
いずれか高いキメラとマウスを作成するための多くの方法が開発されている、または完全に ES 細胞マウス6,7,8,9,10。これらの各システムは、独自のメリットが、また自分の欠点があります。非効率的、四倍体キメラ、マウス由来 100 %es 細胞の生成間の世代でありザイモグラム行5,6に一般に限られました。桑実胚に注入する新しい方法は、100% に近づいている高パーセントキメラをもたらすが、一般的に重要な追加機器 (レーザーまたは piezos) とトレーニング10,11が必要です。研究所は、これらの技術が既に場所で、この新しい手法が必要場合がかもしれません。
本研究の目的は、後続のマウスのコロニーを確立する突然変異体の対立遺伝子の生殖細胞感染の機会が増え、キメラ世代の率を高めるための一般的な技法と容易に利用可能な機器を使用する方法を見つけることだった。
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Protocol
すべての操作はマウスを NIEHS ノック中核施設の通常の操作の一部として行われました。すべてのマウスが、12:12 で保たれた h: 明暗サイクル NIH 31 と水の食事をしたとアドリブ。動物のケアおよび使用委員会の国立環境衛生研究所に従ってすべての実験を行った。
1. 動物の準備
- ドナー マウス、B6 を繁殖 (Cg)-Tyr < c 2 j > B6 に当然のことながら年齢の 8-10 週で/J 雌マウス (Cg)-Tyr < c 2 j >/J 生後 8、26 週齢の雄マウス。視覚的に次の朝 (E0.5) のプラグを確認します。
- 受信者のマウス、6 と 9 週齢の雌マウス自然精管スイスウェブ スター マウスを飼育しているスイスのウェブスターを繁殖させます。視覚的に次の朝 (E0.5) のプラグを確認します。
2 ES 細胞作製
- 129 硼素 AB2.2 ES 細胞で 15 に DMEM で細胞の培養 %fbs、1% のグルタミン、1% ペン/連鎖球菌および 0.1% の β-メルカプトエタノール。ES 細胞供給の指示に、その推奨されるプロトコルを使用して他のすべての ES 細胞を培養します。
3. 胚のコレクション
-
動物解剖
- 60 mm の料理をいくつか、5 マウス プラス 3 余分な 10 mL ブラストメディア コレクション (BCM) あたりおよそ 1 (10 %fbs の DMEM)、1 つ 4 ウェルあたり 0.5 mL BCM も皿と。37 ° c、5% CO2平衡します。
- B6 を安楽死させる (Cg)-Tyr < c 2 j > 10% の流量と CO2窒息を使用して E3.5 で/J 雌マウス。
- 安楽死させる後、仰臥位の位置にマウスを配置、70% エタノールで十分に腹部を濡れています。
- できるだけ大きく開口部を作り、腹部の中間点で最初だけ、皮膚切開を行います。次にできるだけ大きく切開を再度作る腹部壁を開きます。
削減または排除毛皮汚染注意: 2 つの手順でこれを行うことができます。 - 鈍い鉗子が付いて卵巣の脂肪パッドを押し、卵巣から始まる卵巣、卵管、子宮、脂肪組織を最小限に保つために余分な世話を慎重に取り外します。1 つの単一ユニットとして、または次の手順の変更なしで、個々 の角と子宮を削除します。
- 除去した後、コレクションのブラスト媒体を含む 60 mm ディッシュに子宮を配置します。
-
胚が除去
- BCM でいっぱい 10 mL 注射器を準備し、25 G 針と合います。
- 一度に 1 つの子宮 BCM の持株皿からそれらを削除、余分な血液を削除し、低倍率を解剖顕微鏡の下で 60 mm ディッシュに配置組織にそれらのしみ。
- ゆっくりと慎重に、鉗子を解離性大 (近くに輸卵管) 遠位端のすぐ下の子宮を保持している間並列可能な平面としての子宮の中心に針を挿入します。鉗子の先端を指し示す針を挿入します。
- 鉗子針に子宮を保持するためにいくつかの圧力を適用し、BCM の子宮の角を約 1 mL を追放します。
注: 注意が必要この段階で注射器にあまりにも多くの圧力により、メディアの手に負えないストリームを引き起こすのでよく料理を残してします。 - 60 mm ディッシュあたり最大 5 全体子宮子宮をフラッシュした後のコレクションまでインキュベーターに料理を配置します。
-
胚のコレクション
- 手描きガラス ピペットと口のピペットなどの器具を使って、25 X 35 X と設定、切り裂くスコープ下で胚盤胞を収集します。(図 1)。
注: 口ピペット装置で構成されフレキシブル チューブの 30-40 cm、内径 5 mm 未満を挿入、1 000 μ L ピペット チップ、最初のポイント 1 つの端に、あるガラス ピペットを貼る。シリンジ フィルターを添付 1 cc シリンジ バレルと、口の部分として機能するないのプランジャーのもう一方の端に追加します。 - インキュベーターから料理を削除し、格子パターンを用いた胚の料理のすべての部分を確認します。胚を選んだが個別にし、セカンダリの皿に BCM のドロップを配置。
- すべての料理から収集した後新鮮な BCM のドロップで胚をもう一度洗うし、注射を待つ 4 よく皿に入れます。
- 手描きガラス ピペットと口のピペットなどの器具を使って、25 X 35 X と設定、切り裂くスコープ下で胚盤胞を収集します。(図 1)。
4. 胚の注入
- 注射針の確認に基づいて個別に ES 細胞をピックアップします。
- 5-7 mL 注入メディアを追加することによって注入皿を準備 (DMEM、10 %fbs と 20 mM HEPES) ガラス下部注入皿に。注射は、部屋の温度で行われます。
- 空気またはオイル マイクロインジェクターを使用して、ES 細胞を描画する、注射針に真空を適用します。セル間可能な限り小さなスペースとして保つために世話をします。ここでは、または注入の手順では、ES 細胞をカウントします。
- 細胞、滑らかな表面と液胞など明らかな欠陥なしの一般集団と比較してサイズの小さい媒体は、ES 細胞を選択します。
注: ES 細胞集団は形態学的品質で大きく変化して使用される標準は、それらを調整する必要があります。
- 約 15 の ES 細胞 (図 1) で胚を注入します。
- ホールディング ピペットを添付 2 番目の空気マイクロインジェクターにチップし、ホルダーの口近く胚の位置します。ホルダーに胚をセキュリティで保護するために真空を適用します。
- Z 軸の上下ホールディング ピペットを移動して、胚は正にこの帯で細かいピント合わせに続いて、スライドして調整します。次に、注射針の Z 軸を先端近くの ES 細胞は、フォーカスに調整します。
- 上部または下部、ICM の目的の位置に回転で注射針から優しく押して今胚を調整します。
- 帯と ICM または企業が制御のプッシュを使用して、絨毛を注射針を挿入します。胞胚腔が崩壊しないようにするため注射針のガラスシリンジにわずかな圧力を適用されます。
- 針、胞胚腔に侵入して、一度は、ES 細胞を胚の胞胚腔に転送するマイクロインジェクターから圧力を適用します。針の傾斜面として簡単に一時停止は、細胞を維持しながら、正常に戻ります胚で圧力を許可する胚を終了を開始します。
注: 参照グループの ES 細胞を通常投与、次の伝統的な ES 細胞注入プロトコル9ICM に触れないように世話します。ES 細胞も、直接を通じて、ICM (TICM) (図 2、補足映画) 針を進めて、ICM を注入しました。
5. eEmbryos の転送
- 製造の手順ごとの非外科的胚転送デバイスを使用して E2.5 をスイスウェブ スター マウスの胚を転送します。麻酔や手術後の特別なケアは、この非外科的処置は必要ありません。家のマウス胚と配信とその後離乳後個別に。
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Representative Results
ランダム効果として細胞株を扱う、混合効果線形モデルのソフトウェア (例えば SAS (バージョン 9.2)) のデータを分析していました。各解析転送胚とセルの行の数を制御します。生存仔数の制御も 2 番目の分析。
この研究のため各 ES 細胞とクローンは従来の両方が注入されたと TICM テクニック、交互にそれぞれの胚の後 2 つの方法。注入後、胚が皿の上分離し、一般的に受容雌あたり 12 〜 15 の胚間の移動によりグループ化されます。はっきりと見える胞胚腔はありませんでした胚は透明帯に欠けていたまたは microinjected ES 細胞、胞胚腔を入力していない場合は、この実験から排除されました。
検討した最初のデータは妊娠率でした。図 3のように、妊娠率は対照群から TICM グループが変更されてなかった。さらに、同じ割合で子犬が離乳に生き残った (P = 0.50、図 4)。最も重要なは、変わらずに残る子犬の数を離乳マウスの数コート色キメリズムの表示増加 31% から TICM グループの 50% に (p = 0.005、図 5)。コート色キメリズムの程度は、あまりにもこの研究で評価する主観的と生殖細胞のキメリズムに本当に関係のない考慮されました。
図 1: 機器を専門します。(左)(A)マイクロ マニピュレーター (B)セル トラム空気など、インジェクション顕微鏡セットアップ。(右)口ピペット装置、 (C)描かれたガラス ピペット、 (D) 1000µL ピペット チップ、チューブ(E) 、 (F)フィルター、および(G)シリンジ バレルします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 胚盤胞の胚の注入の例。(A, B)従来の注入法、注射針が ICM を使用した任意の相互作用を回避する ICM の反対入る。(C, D)TICM メソッドは、注射針が胞胚腔への ICM を直接入力します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 妊娠率。妊娠率は、従来 (39/50) と TICM (64/76) 間に有意差を認めなかった。平均プラス (SEM) 平均値の標準誤差。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 生存率。生存率は離乳して生存仔数を離乳するくずがあった。離乳、生き残っていない子犬、離乳に子犬生き残ったないどこの仔は、このデータに含まれていません。平均プラス (SEM) 平均値の標準誤差。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: キメリズム率。このデータは、キメラの生成、およびキメリズムの品質は扱いません場合のみ数を表します。伝統的なグループの子孫の 31% (34/110) 示したキメリズム、TICM グループが 50% (79/158) の平均を持っていた。平均プラス (SEM) 平均値の標準誤差。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ICM の妨害につながることを死亡、実際には、現在の胚盤胞マイクロインジェクション プロトコルはまだこの12,13の警告それが長く考えられてしまった。我々 がここで示されているものは、マイクロインジェクション ICM を通して胎児に悪影響はないとキメラの収量を増加させます。
この効果の正確なメカニズムは特定されていません。ただし、機械的破壊、ICM および付随のウズラは ES 細胞統合次のマイクロインジェクション新しく形成された ICM の発生率を増やす必要があります。Ips の分野の最近の研究は、機械的刺激により人間 iPSC14をプログラムし直すことを示しています。ICM 多能性の状態に、区別するために始まった可能性がある潜在的な胚盤胞ドナーの頭 start' を削除のセルを返すの効果を持つことが機械操作にマウス胚の ICM で同様の効果がある場合派生セル萌芽期ティッシュの形成に。最後に、ES 細胞を遺伝子、microinjected のための競争のレベルを下げ、ICM のセル数が不明の死で ICM により注射に変更が可能です。
このメソッドの変更の主な利点は、それを必要としない新しい学習、トラブルシューティング、または機器です。すべての技術は、標準的な胚盤胞の注入から引き継ぐ。最も重要な手順も変わりません。適切でタイムリーな胚と胚の注入中に、前後の適切な培養条件のコレクションです。非外科的胚の転送技術を使用して、適切な受信者マウスを選択する以上に重要になるが。手術転送の場合、外科医は適切な生殖状態を確認するためにマウスを検討する機会では、非外科的転送が可能。マウス必要があります首相生殖年齢 (6 〜 9 週間) と表示プラグとマウスのみを使用する必要があります。この手法の最も重要な側面とすべての ES 細胞注入は、ES 細胞の品質です。
高品質で堅牢な細胞株を扱うこの手法が最小の差分だけをもたらすと準最適 ES 細胞または回線で動作することは困難、でも改善、マイナーな重要であるでき、プロジェクトの成功との間の違いを生む失敗します。また、ノートでは、この研究の過程で、いくつか市販の ES 細胞生殖系列キメラの生成し、TICM 注射をされたほぼすべての商業の ES ライン生殖系列キメラを生成するのです。ここで我々 は技術の簡単な変更可能性がある重要な改善で、生産性の新しい機器の任意の追加コストを発生させず、トレーニング、または動物の使用の増加なし示されています。
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Disclosures
著者は開示する競合する興味を持ってないです。
Acknowledgments
この研究は、NIH、国立環境衛生研究所の学内研究プログラムによって [一部] 支えられました。統計分析のために Shyamal Peddada 感謝します。私たちはまた彼の継続的なサポートやアドバイスをこの原稿とフランコ DeMayo のレビュー ハンフリー八尾、ゲイリー鳥と結城荒尾を感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al.
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
