Summary
우리는 치료 평가 우리 셀 라인에 머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 실험적인 치료 regimens의 현재 표준 테스트를 가능 하 게 한 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 생체 외에서 모델의 진화 설명 민감성 및 미래에 인간의 표본에서 1 차 셀에 저항.
Abstract
고급 및 재발 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)에 대 한 현재의 치료 옵션은 방사선 및 항 암 치료 방사선 접근 또는 수술 없이 묶습니다. 백 금 기반의 화학요법 식이요법 현재 효능 측면에서 금 표준을 동안에 대부분의 경우, 새로운 화학요법 식이요법, 즉 immunotherapy 등장 하고있다. 그러나, 응답 속도 및 치료 저항 메커니즘 중 항 암 치료 처방에 대 한 예측 하 고 제대로 이해 남아 있습니다. 항 암 치료 및 방사선 저항 메커니즘의 광범위 한 변화는 날짜를 알려져 있습니다. 이 연구는 표준화, 높은 처리량에 생체 외에서 분석 결과의 개인된 종양에 대 한 미래의 도구로 개별 환자에서 HNSCC 셀 라인의 응답 다양 한 치료 식이요법, 그리고 잘하면 1 차 셀을 평가 하기 위해 개발을 설명 합니다. 치료입니다. 분석 결과 우리의 제 3 배려 센터; HNSCC 환자에 대 한 품질 제어 표준 알고리즘에 통합 되 고 하도록 설계 되었습니다. 그러나,이 미래 연구의 대상이 될 것입니다. 기술적 타당성 실제 환자에서 종양 생 검에서 1 차 셀에 대 한 약속 같은 데. 표본은 다음 실험실으로 전송 됩니다. Biopsies는 기계적으로 따라 효소 소화에 의해 구분 됩니다. 다음 셀에 3 차원, 회전 타원 체 모양의 셀 대기업의 재현, 표준 및 자발적 형성을 촉진 하는 매우 낮은 접착 셀 문화 튜브 교양. Spheroids 다음 프로토콜과 immunotherapy 프로토콜 필요에 따라 항 암 치료 방사선에 노출 될 준비가 됩니다. 마지막 셀 생존 및 회전 타원 체 크기 치료 민감성의 지표 이며 환자 들 치료 가능성이 응답을 평가 하기 위해 미래에 고려 사항으로 얻을 수 수 있습니다. 이 모델 쪽으로 머리와 목 암 맞춤된 치료 가치, 비용 효율적인 도구 수 있습니다.
Introduction
머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)는 여섯 번째 가장 일반적인 암 전세계 점 막 인간 유 두 종 바이러스 (HPV) 감염 관련 pathogenesis, 대부분의 경우 과도 한 니코틴과 알콜으로 인 한 옆의 상승 부각 소비 1,2. 고급 단계와 재발 HNSCC에 대 한 치료 남아 공격적인 종양 침공으로 인해 도전 작은 종양 전 침략 적인 단계는 일반적으로 외과 절단, 일반적으로 자 궁 경부 림프절 절 개와 결합으로 잘 치료할 수 전이성 확산 및 저항 방사선 및 화학 요법 프로토콜3,,45,6,7,8. 최근 연구 제안 세포 표현 형의 높은 가변성 및 순환의 하위 특성화 고 전파 종양 세포 막9,10를 시작 했다. 고체, 균일 한 종양의 이전 신념 질량 과거에 최근의 연구에 비추어 수정 되어야 했다 년11,12,13,14. 종양 특성 및 주요 돌연변이의 id에 대 한 현재 접근 여러 유전자 치료 저항에 연결할 수 있지만 비용 집약적인 접근을 유지 하는 것을 식별할 수 있는. 또한, 유전자 형의 지식 표현 형 및 치료 응답의 신뢰할 수 있는 예측을 반드시 허용 하지 않습니다.
고급 단계와 재발 성 질환에 대 한 전체 및 질병-무료 생존 개선 몇 발전 되었습니다. 니코틴-로 바이러스 관련 암, 수술 외에 현재 치료 옵션이 공격적 방사선 및 백 금 기반의 화학요법 식이요법을 묶습니다. 자 궁 부정과 긍정적인 암; 사이 다른 응답 속도 대 한 의미 되었습니다. 그러나,이 되지 않은 아직 변화를 일반적 치료 지침 이어질. 저항 방사선 및 화학 요법 광범위 한 현상에서 모든 종양 단계 이며 백 금 기반 화학 요법 또한 타겟된 치료 (안티-EGFR;에 관해서는 존재 표 피 성장 인자 수용 체) 그리고 최근 검사점 금지15신흥. 효과 없는 방사선 및 화학 요법 dysphagia, mucositis, 구강 건조와 다른 사람 사이 신장 또는 심장 기능의 감소의 위험이 큰 환자 사망률의 높은 비용에 온다. 치료 응답 사전 예측 각 개별 환자에 대 한 일반적인 치료 개념의 결정 중요 한 목표는, 불필요 한 치료 개념, 부작용 및 비용 방지 될 것으로 보인다.
우리가 현재 표준 항 암 치료-방사선 기술 서 점에서 일반 및 품질 제어 종양 치료 알고리즘에 통합 될 수을 향해 개별 환자의 치료 민감성을 테스트 하는 모델을 확립 하고자 했다. 멀리 목표 그들은 제대로 그들의 변화 없이 실제 인간 종양 세포를 대표 하 고이 프로토콜의 설립 동안 지금, 아시다시피 이루어졌다 다양 한 셀 라인에 무 겁 게 변경 하 고 세 셀 라인을 사용 하지 않고 모델을 사용 했다. 상업적으로 사용 가능한 셀 라인 에서만 독립 수, 우리 최근 성공적으로 생성 "피 카" 라는 중간 셀 라인 인간의 종양 표본에서 기본 HNSCC 세포에서 그것의 표면 및 한정 된 구절 에 보존 세포 마커 16.이 피 카 셀 라인 나중 다음 신선한 인간의 암 세포 실험에서 종양 생 검에도 모델의 개발에 대 한 준비로 봉사 해야 한다. 그것은 그 문화는 다르게 반응 하는 3 차원 셀 및 더 많은 vivo에서세포 표시 되었습니다-monolayers17,,1819,20에서에서 성장 보다 암 약물의 관리 같은 ,21, 철새의 보존 때문에 주로 및 특정 셀 하위 집합22,,2324의 하위 차별화 속성. 여기, 우리가 중간 셀 라인에서 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 모델의 프로토콜을 설명 하 고 기본 인간의 편평 세포 암 종 세포와 방법을 어떻게 통합 같은 모델 머리와 목 외과 및 종양학 ( 의 암 치료 그림 1).
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Protocol
이 원고, 즉 인간의 종양 견본의 사용에 표시 된 모든 연구는 사전 결정에서 대학 의학의 마인츠/대학 뮌헨 의료 센터 윤리 위원회의 동의 보호 됩니다. 환자는 그들의 치료 과정에서 얻은 초과 생물학 자료의 과학적인 사용에 동의 하는 국가 법률 지침에 따라 동의 주었다. 연구는 인간의 복지에 대 한 모든 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행 되었습니다.
1. 머리와 도대체 편평 세포 암 종에서 종양 생 검 복용
- 수행 일반 (propofol 및 sevoflurane, 근육 편안한 에이전트) 또는 로컬 침투 (2 %ultracaine, 아드레날린) / (xylocaine) 마 취 수술 실 또는 이비인후과 검사의 자에 표면. 표준 계기 운영 위 소화 및 호흡 관의 구두 구멍/인 두/후 두/다른 부분에서 종양 질량 시각화 하 고, 필요한 경우, 현미경.
- 신선한 종양 생 검 암 병 변 주변에서 무딘 또는 절단 악기 가져가 라. 때문에이 지역에 풍부한 괴 사 병 변의 중심을 하지 마십시오. 얻은 조직 isotonic 나트륨 염화 물 솔루션 무 균 용기에 넣어.
- 생 검 후 수행 hemostasis, 예를 들어필요에 따라., 바이 폴라 또는 monopolar 응고 장치 vasoconstrictive 물질의 사용 이외에.
- 가져 종양 생 검 인접 한 실험실으로 직접 세포 배양 실험을 위해 사용 됩니다. 다른 종양 생 검 암을 배제 하기 위해 평소 병리학 자 보내기.
- 실험실 기술 자가 직접 표본을 처리할 준비가 있는지 확인 합니다.
2. 종양 견본 처리
- 적합 하 고 메 마른 표면에 종양 견본을 놓고 철저 하 게 멸 균 일회용 메스와 가능한 한 작은 조각으로 그것을 잘라.
주의: 감염 및 혈액을 매개로 질병의 상태는 잘 문서화 이며 기술자 표준 기관의 관심을 방지 하기 위해 프로토콜 바늘 막대기 또는 잠재적으로 biohazard 환자 소재 절단 부상 확인 및 가능한 부상 후 따라 프로토콜입니다. - 충분 한 기계적 분리의 기본 조직, 후 콜라를 포함 하는 유리병에 조직을 넣어 나 / II 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 70 µ m 팔 콘 셀 스 트레이너를 통해 체질 하십시오 그리고 행 크 스 균형 소금물 (HBSS)와 현 탁 액을 씻어.
-
성공적인 분리 이후 세척 후에, 5% CO2 와 37 ° c.의 온도에 하위-confluency 성장 T75 셀 문화 플라스 (75 cm2)에 1-2 × 106 셀을 포함 하는 정지 장소 이 단계는 최대 10 일을 걸릴 수 있습니다.
- 다음의로 구성 된 특별 keratinocyte 문화 매체를 사용 하 여: 125 mL Dulbecco의 독수리 매체 (DMEM) Keratinocyte 보완 매체 (보완된 매체 구성 된 500 mL Keratinocyte SF 매체의 소 뇌 하 수 체의 15 mg의 250 mL 수정의 추출 (BPE), 페니실린/스, 150 ng 재조합 인간 상피 성장 인자 (EGF), 300mm CaCl2의 516 µ L, 사전에 대비해 주식 혼합의 2.5 mL), F12 영양소 혼합, BPE (0.75 mL), 75 ng 재조합 인간 EGF의 10 mg의 125 mL (2 µ L) 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide (자료 테이블)의 3.75 mL.
3. 낮은 접착 세포 배양 배지로 셀 시드
- 현미경 종양 세포 성장 확인. 문화에 있는 셀의 개수 (기본 또는 세포 배양) 5000 기본 종양 세포 또는 중간 셀 라인의 1000-2000 셀 씨와 / 오목와 함께 낮은 접착 판으로 미디어 (3.2 단계.)의 200-300 µ L에서 다른 셀 라인 라운드 바닥 (96-음).
-
1%에서 5% CO2 37 ° C에서와 동등한 부품 DMEM 그리고 기도 상피 세포 매체 (BEGM), 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린/스, 1% 나트륨 pyruvate, 1% 비 본질적인 아미노산, 셀 문화 L-글루타민 (2.3 단계.). 셀 라인 사용 되 DMEM 기초 미디어 충분 하다.
- 미디어 변화를 매일 수행 합니다. 미디어 변경 시 피펫으로와 회전 타원 체를 발음 하지에 주의. 성장의 수준까지 문화는 spheroids로 descibed 3.3에 (약 7-10 일)에 도달.
- 3 차원, 회전 타원 체 모양의 셀 대기업에 대 한 보고 현미경 자발적인 회전 타원 체 형성을 확인 합니다. 불규칙 한 또는 추가 조사에서 여러 회전 타원 체 형성 우물을 제외 합니다.
참고: Spheroids 표시 됩니다 맨 눈으로도, 더 처리 및 아래 설명 된 대로 미디어 변화를 촉진.
4. 노출 복합 표준 또는 실험 종양 치료에 Spheroids
- 원하는 치료 처방을 선택 합니다. 치료 spheroids 또는 spheroids만 부분 치료 regimens, 예를 들어받는 치료의 비교를 허용 하는 충분히 큰 컨트롤 그룹을 디자인 합니다. 방사선 혼자입니다. 컨트롤 그룹의 크기 그리고 실험적인 그룹 디자인에 따라 보편적으로 정의할 수 없습니다.
- 첨가제와 함께 미디어 미디어, chemotherapeutics 및/또는 원하는 농도에서 단일 클론 항 체와 의미 미디어를 교환 합니다. 2.5/5/10 µ M 또는 5-fluoruracil (5FU) 30 µ M의 농도에서 Cisplatin를 추가 합니다.
참고: 높은 처리량 실험 또는 큰 그룹 크기/다 수 그룹의, 하나 사용할 수 있습니다 자동된 pipetting 로봇 우리가 더 실험에서 설치 하 고 있다. - 또는 적합 한 방사선 시설을 사용 하 여 2 Gy에서 spheroids와 세포 배양 배지 방출.
주의: 직원의 유해한 방사선 노출의 방지에 관한 기관의 프로토콜을 존중 합니다. 방사선 보호 지침에 따라 지정 및 훈련 된 기술자 에서만 작동 합니다. 원하는 경우, chemotherapeutics 4.2 아래 설명 된 대로 추가 합니다. 이후에. - 앞에서 설명한 문화 조건 (37 ° C, 3.2 단계)에서 24 h에 대 한 셀을 품 어.
- 부 화 후 미디어 변경 최소 6 일 매일 세포 배양을 계속 합니다.
5. 회전 타원 체 크기와 분석 결과 읽기에 대 한 세포질 확산의 정도 평가
- 회전 타원 체 크기 6 일에 디지털 사진 설명서 후 지역 (10 일, 16 일) 그래픽 소프트웨어 (매개 변수 1)를 측정 합니다.
- 접시의 2.5 분 520 x g에서 원심 분리 후에 상쾌한을 제거 합니다. 1 x PBS와 접시 다시 설명, 뒤 상쾌한 (PBS)를 제거 하는 원심 분리기의 충분 한 양의 세포를 씻어.
- 해산을 spheroids 수 있도록 각 유리병에 효소 세포 분리 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 8 분 동안 접시를 품 어
- 성공적인 현미경 회전 타원 체의 용 해를 확인 합니다. DMEM의 100 µ L를 추가 합니다. 원심에서 520 x g 2.5 분 제거에 대 한 접시는 상쾌한 고 DMEM의 100 µ L의 세포를 중단.
- 예를 들어 서 부 표준시-8 분석 결과 제조업체의 지침25에 따라 각 유리병에 상용 색도계 확산 분석 결과 수행 합니다. 분석 결과 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 리더 (매개 변수 2)에 밖으로 읽기.
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Representative Results
우리 reproducibly 나중 Hagemann 외 에 설명 된 대로 신선한 종양 생 검에서 파생 하는 기본 인간 암 세포에서에서 독점 피 카 셀 라인을 포함 하 여 다른 셀 라인에서 먼저 단일 셀 정지에서 spheroids 생성 수 있었다 . 26. 우리는 회전 타원 체 세대;에 대 한 두 가지 설립된 방법 평가 소위 교수형 되 고 두 드롭 (HD) 메서드와 매우 낮은 접착 (울 라) 메서드, 후자 더 효과적이 고 안전한 하나 되. 플레이트 처리, 무거운 진동, 그리고 균일성 ( 에서 더 많은 재현 회전 타원 체 성장 spheroids의 필연적인 손실 적은 문제 빠른 회전 타원 체 성장를 포함 하 여 HD에 비해 울 라 방법의 이점 강조 수 있었습니다. 그림 2). 유리병 당 여러 spheroids의 HD 방법에서 더 일반적 이었다. 우리는 회전 타원 체 형태의 더 뚜렷한 특성을 확인합니다. 그림 3 Ki67, 피 카 셀에서 회전 타원 체의 확산 표식에 대 한 얼룩이 지는 immunochemistry를 보여 줍니다. 문학에 설명 된 대로 spheroids 덜 코어 proliferating 외부 층으로 확산, 인 간에 있는 단단한 HNSCC의 확산의 다른 지구를 흉내 낸 구성 됩니다. 체 외 로 vivo에서, 이것은 살 일 걸 요 영양분과 산소 종양의 센터 주변에서 감소를 일으키는 세포 배양에 의해 제공의 그라데이션에 의해 발생 합니다.
우리 다음 하려고 분석 결과 화학요법 약물 또는 전리 방사선에 노출 부 화 후 회전 타원 체 크기에 변화를 감지할 수 여기 HNSCC에 대 한 두 가지 일반적인 표준 치료 regimens를 나타내는. 사전 처리 루틴으로 분석 결과 가능 하 게 통합 하기 전에 분석 결과의 감도의 유효성 검사는 필수 있을 것 이다. 두 개의 매개 변수는 분석 결과의 끝 지점으로 사용할 수 있었다: 회전 타원 체 크기 (영역, 매개 변수 1 단계 5.1에서에서)와 확산 (매개 변수 2 단계의 5.4 참조.), 치료 후 세포 생존 능력 및 성장 잠재력에 대 한 대리 마커를 되 고. 일반적인 화학요법 및 방사선 항 암 치료 프로토콜 치료 연구의 결과 그림 4에 나와 있습니다. 노출과 cisplatin 또는 5FU와 spheroids의 부 화는 치료 되지 않는 통제 그룹에 비해 시간이 지남에 성장 속도 있는 뜻깊은 감소를 주도 (p< 0.001). 방사선 2Gy와 중요 한 방식으로 성장 속도 줄일 수 있었습니다 (p< 0.01). 생존 분석 결과 (서 부 표준시-8) 방사선 혼자에 비해 cisplatin 항 암 치료 방사선의 추가, 중요 한 가치를 검출 수 있었다 (p = 0.017), 이전 회전 타원 체 크기의 평가에 차이 감지. 이 작은 변화 치료 응답에 대 한 감도 보강, 전체적으로 분석 결과 대 한 중요성을 밑줄.
그림 1: 미래 맞춤된 치료 하는 방법에 대 한 모델의 개념. 점 막 HPV 감염의 어느 배경 또는 역사의 머리와 목 암 의심된 진단에 대 한 우리의 제 3 소개 센터에 존재 하는 담배 및 알코올 남용 환자. 생 검 의심 스러운 점 막 영역 또는 거시적인 종양 질량의 마 취 진단 보안을 가져옵니다. 또한, 우리는 실험실에서 3 차원 회전 타원 체 모양의 셀 문화를 생성 하는 종양 biopsies 걸릴. 1 차 셀 기반된 spheroids의 충분 한 성장에 우리 개별 치료 응답에 대 한 테스트 하려면 현재 표준 또는 실험적인 치료 regimens에 그들을 노출. 유전적 또는 분자 변이의 더 분석 치료 결과의 분석 후 추가할 수 있습니다. 치료 결과 생체 외에서 환자에 대 한 치료 개념을 계획의 과정에 대 한 고려 사항으로 그릴 수 있습니다. 이 그림은 Hagemann, J. 그 외 여러분 에서 증 쇄 26, 저자와 저널에 의해 부여 된 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 모든 셀 라인 신뢰할 수 있는 spheroids를 생성할 수, 그림 1에 따라 크기와 읽기의 시간 차이. 예비 실험에서 1 차 셀 않았다 형성 하지 재현 spheroids HD에 울 라 접시 (하단 왼쪽) 하지만. 더 연구는 1 차 셀에서 회전 타원 체 성장 특성 평가를 실시할 수 있습니다. 오른쪽에 있는 셀의 수는 회전 타원 체를 유리병에 넣어 셀의 초기입니다. 이 그림은 Hagemann, J. 그 외 여러분 에서 증 쇄 26, 저자와 저널에 의해 부여 된 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Ki67 immunochemistry 회전 타원 체 슬라이스 (피 카)의 얼룩. 문화의 주변 자주 괴 코어를 보여 주는 단단한 점 막 종양에 영양 분포를 흉내 낸 중앙 셀 보다 훨씬 높은 확산 속도 보여줍니다. 이 그림은 Hagemann, J. 그 외 여러분 에서 증 쇄 26, 저자와 저널에 의해 부여 된 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 치료 연구. (A) 피 카 셀 spheroids 생성 하 경작 했다 (n = 그룹 당 12) 울 라 접시에. 셀은 컨트롤, 5 µ M에서 cisplatin 또는 5FU 30 µ M. 크기는 spheroids의 6, 10 및 표준 프로토콜에 따라 16 일에 결정 했다 어느 PBS와 프로토콜에 따라 자극 했다. Cisplatin과 5FU 치료 크기에 상당한 감소를 주도 (p-값 섹션 (B) (A)와 같이 동일한 실험 설계에서에서 왼쪽된 하단에 주어진 (n = 12), 하지만 2Gy의 추가 방사선. (C) 플롯 최대 분을 보여줍니다. 에 따라 p-값 (C)에, 2Gy와 이전 방사선 방사선 치료를 모방 하 고 피 카 셀의 방사선 감도 보여주는 컨트롤 그룹에서 회전 타원 체 크기에 상당한 감소를 주도. Cisplatin 치료와 함께에서 방사선은 회전 타원 체의 크기에 더 큰 감소에 지도 하지 않았다 (p> 0.05). 음모 최대분을 보여줍니다. (C) p계산-2 웨이 ANOVA 분석 실험 A와 B. (D) WST8 분석 결과에 수행 하는 spheroids의 planimetric (지역) 분석에 대 한 대 안으로 하루 16 값. WST8 분석 화학-방사선 (2Gy 방사능과 cisplatin) 혼자 cisplatin에 비해 후 살아있는 세포에 상당한 감소를 감지할 수 있었다 (p = 0.017), 따라서 planimetric 분석 및 WST8 결합의 이점을 보여주는 분석 결과 읽어 시의 색도계 시험 음모 최대 분을 보여줍니다. 이 그림은 Hagemann, J. 그 외 여러분 에서 증 쇄 26, 저자와 저널에 의해 부여 된 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 세포 정지, 예비 실험, 기본 인간 종양 세포에서에서 그리고 두 셀 라인에서 재현 spheroids를 생성 하는 프로토콜을 설정할 수 있었다. 우리는 먼저 앞에서 설명한 두 가지 방법으로 평가 하 고 울 라-방법, 어디 낮은 접착 표면 배양 배지는 사용 되는 방법, 일정 한 3 차원 spheroids의 생성에 대 한 안전 하 고 더 안정적인 것을 확인. 분석 결과 읽기 (크기/위치 및 세포 생존)에 대 한 두 개의 별도 메서드를 결합해 서,이 복합 분석 결과 그룹 간의 작은 차이 식별 하기 위해 충분히 과민 하다. 이것은 나중의 통합 분석 결과 3 차 케어 센터에서 임상 경로 대 한 기술적 타당성의 증거를 향한 첫 번째 단계. 미래에, 그것은 (i) 일반적인 첫 번째 또는 두 번째-/ 제 3 라인 치료 프로토콜 (항 암 치료 시 약, 방사선)를 개별 종양 민감도 평가 하기 위해 사용 될 수 및 실험적인 치료 프로토콜, (ii) 더 신선한 표본에서 종양 세포의 특성 그리고 분자 표면 또는 세포질 패턴 치료 응답의 상관 관계. Spheroids 다른 종양 있어, 예를 들어, 기본 및 림프절 전이에서 오는 표본에서 상상할 수 있습니다.
프로토콜 및 방법의 설립을 통해 우리는 다른 알려진된 셀 라인, 몇 가지 되 고 잘 설립 수십 년 동안 사용. 셀 라인의 단순한 나이의 그들의 연결 및 comparability 현재 실제 인간 종양 세포, 아마 몇 가지 속성 및 특징 분자 마커를 잃은 데에 의심을 발생 시킵니다. 생체 외에서 실험에서 결과 인간 또는 vivo에서 실험27에 재현 하기 어려운 했다. 우리는 그러므로 최근 잘 특징이16우리의 시설에서 인간의 기본 종양 세포에서 생성 된 셀 라인에 집중 했다. 이 셀 라인 피 카, 우리 큰 규모에서 치료 실험을 수행할 수 있었고 현재 치료 기대를 확인. 이론을 그 피 카 셀 수많은 구절을 받았다 다른, 더 세 고 passaged 셀 라인 보다 실제 인간의 종양 동작을 반영 하는 것을 지원 합니다. 장기 체 외에 조건 때문에 비 생리 적인 선택 받을 수 있는 셀 항 암 치료 방사선 감도 편견 수 있습니다. 최근 실험에서 우리가 1 차 셀에 관해서 신뢰할 수 있는 회전 타원 체 형성;와 타당성 확인 그러나, 더 큰 실험 임상 일상으로 분석 결과 구현 하기 전에 수행 해야 합니다.
그것은 가정 그 spheroids와 3 차원 세포 배양 일반적 반응 다르게 화학요법 약물 이나 방사선 28에 노출 될 경우 기존의 2D 문화에 비해. Spheroids의 아키텍처 코어, 외부 표면에서 산소와 영양 공급의 그라디언트를 리드 하 고 최근 연구 또한 약물 3 차원 셀 클러스터의 다른 부분에는 배송 하지 유니폼29. 또한, 셀 회전 타원 체 문화에 특정 동물에 마약 저항에 연관 된 유전자 표현 패턴 30모델을 보존 것으로 보인다. 또한 소위 방사선 저항, 수많은 환자, 머리와 목 암에 연결 되어있다는 기능 세포 세포 상호 작용 및 산소 공급 및 신진 대사 활동에서 변화를 선도 하는 뚜렷한 microenvironments의 결과 이다 하는 것이 좋습니다. 이 현상 spheroids 증가 vivo에서 기능 때문에 유사 수 있습니다. 결론적으로, 1 차 셀의 사용과 spheroids의 생성 만큼 vivo에서 종양의 성장 함께 공부 하는 개별 치료 응답에 대 한 비용-효율 분석 결과의 가능한 특성 유지를 허용할 수 있습니다.
확실히 접근 제한이 있습니다. 날짜 하려면, 그것은 불명 하다 어떻게 다른 개별 환자에서 세포 종양 치료에 노출 되 고 분석 결과에 수행 하 고 어떻게 예측 분석 결과 이후 치료 결과와 상관 관계의 관점에서. 과도 한 연구는 단순히 성능에는 생체 외에서 임상 코스 대 비교 하는 데 필요한. 다른 사람들, 즉 두 가지 요인에 기여이 불확실성: 종양이 질 및 공동 문화 stromal 및 면역 세포와의 부족. 종양이 완전히 이해 하지 현상 이며 기본 및 전이성 지역화12사이 에서도 기본의 다른 하위 사이트 간에 존재 합니다. 최근 연구, 이후 세 번째 사이트 어디에 매우 독특한 이며 전문된 종양 세포는 존재 하 고 틈새에 우선 수: 혈액과 골 수를 순환 집 있고 전파 종양 세포9,10. 다른 종류의 세포 stromal 세포와 T 세포 (면역 시스템에 대 한 대표자로) 처럼 세포 배양에서 부족 분석 결과, 하지만 대부분은 체 외에 종양 치료 민감성을 공부 하 고 분석의 유효한 단점에 국한 되지 않습니다. 최근 약물 승인 및 T-세포 반응에 영향을 주는 지속적인 연구에 비추어 다른 분석 실험 및 방법의 조합에 약물 발견에 대 한 미래 실험을 실시 해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 뮌헨의 대학 교부 금에 의해 투자 되었다 (FöFoLe 프로젝트-번호: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
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