Summary
Vi beskriver udviklingen i en klumpformet-baseret, tre-dimensionelle in vitro- model, der gør det muligt for os at teste den nuværende standard for eksperimentel behandling regimer for hoved og hals planocellulært karcinom i cellelinjer, med henblik på at evaluere terapi modtagelighed og modstand på primærelementer fra humant prøvemateriale i fremtiden.
Abstract
Nuværende behandlingsmuligheder for avancerede og tilbagevendende hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCC) vedlægge stråling og kemo-stråling tilgange med eller uden kirurgi. Mens platinum-baseret kemoterapi regimer i øjeblikket repræsenterer guldstandarden i form af effektivitet og er givet i de fleste tilfælde, nye kemoterapi regimer, nemlig immunterapi nye. Responsrater og terapi resistensmekanismer for enten kemo regime er dog svært at forudsige og forbliver utilstrækkeligt forstået. Bred variationer af kemo og stråling resistensmekanismer kendes til dato. Denne undersøgelse beskriver udviklingen af et standardiseret, høj overførselshastighed i vitro assay at vurdere HNSCC cellelinje svar til forskellige terapi regimer, og forhåbentlig på primærelementer fra enkelte patienter som et kommende værktøj til personlig tumor terapi. Analysen er designet til at blive integreret i kvalitetskontrollerede standard algoritmen for HNSCC patienter på vores tertiær Plejecenter; imidlertid vil dette være genstand for fremtidige undersøgelser. Teknisk gennemførlighed ser lovende ud for primærelementer fra tumor biopsier fra faktiske patienter. Enhederne er derefter overført til laboratoriet. Biopsier adskilles mekanisk efterfulgt af Enzymatisk nedbrydning. Celler er derefter kulturperler i ultra-lav friktion celle kultur hætteglas, der fremmer reproducerbar, standardiseret og spontane dannelse af tre-dimensionelle, klumpformet-formet celle konglomerater. Spheroids er derefter klar til at blive udsat for kemo-stråling protokoller og immunterapi protokoller efter behov. Den sidste celle levedygtighed og klumpformet størrelse er indikatorer for terapi modtagelighed og derfor kunne drages i betragtning i fremtiden at vurdere patienternes sandsynligvis terapi svar. Denne model kunne være en værdifuld, omkostningseffektive redskab mod personlig behandling for hoved og hals kræft.
Introduction
Hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCC) er den sjette mest almindelige kræftform på verdensplan med en stigende forekomst af slimhinde humant papillomvirus (HPV) infektion-associerede patogenese, ved siden af et flertal af tilfældene forårsaget af overdreven nikotin og alkohol forbrug 1,2. Mens mindre tumorer og pre invasive faser er som regel godt kan behandles med kirurgisk excision, som regel kombineret med livmoderhalskræft lymfeknude dissektion, behandling af fremskreden fase og tilbagevendende HNSCC er stadig en udfordring på grund af aggressiv svulst invasion med metastatisk spredning og modstand mod stråling og kemoterapi protokoller3,4,5,6,7,8. Nylige undersøgelser tyder på en høj variation af cellulære fænotype og sub karakterisering af cirkulerende og formidlet tumorceller er lige begyndt9,10. Den tidligere tro på en fast, ensartet tumor masse måtte revideres i lyset af nylige undersøgelser i seneste år11,12,13,14. Nuværende tilgange til tumor karakterisering og identifikation af nøgle mutationer kunne identificere flere gener, der synes at være forbundet med terapi modstand men forblive en omkostningskrævende tilgang. Desuden tillader viden om genotype nødvendigvis ikke en pålidelig forudsigelse af fænotype og dens behandlingsrespons.
Der har været få fremskridt i forbedringen af overordnede og sygdomsfri overlevelse for fremskreden fase og tilbagevendende sygdom. For nikotin - samt virus-associerede karcinom vedlægge nuværende behandlingsmuligheder udover kirurgi aggressive stråling og platinum-baseret kemoterapi regimer. Der har været konsekvenser for forskellige responsrater mellem HPV-negative og positive karcinom; men dette har endnu ikke føre til en ændring i almindelighed terapi retningslinjer. Modstand mod stråling og kemoterapi er et udbredt fænomen i alle tumor faser og findes til platinum-baseret kemoterapi samt for målrettet behandling (Anti-EGFR; epidermal vækstfaktor receptor) og for nylig nye checkpoint hæmning15. Ineffektiv stråling og kemoterapi komme en høj pris for betydelig patienters sygelighed dysfagi, mucositis, mundtørhed og risikoen for fald af nyre eller hjertets funktion blandt andre. Forudsige terapi svar forudgående synes beslutning af en generel terapi koncept for hver enkelt patient at være det afgørende mål, at forhindre unødvendig behandling begreber, bivirkninger og omkostninger.
Vi forsøgte at etablere en model for at teste individuelle patientens behandling modtagelighed over for nuværende standard kemo-stråling, der kan integreres i den regelmæssige og kvalitetskontrollerede oncologic behandling algoritme fra en teknisk stående punkt. Det yderste mål var at bruge modellen uden brug af stærkt ændret og alderen cellelinjer, som de dårligt repræsenterer faktiske menneskelige tumorceller uden deres variation og uensartethed som vi kender nu, mens etableringen af protokollen blev gjort i forskellige cellelinier. For at være uafhængige kun fra kommercielt tilgængelige cellelinjer, genereret vi for nylig med succes en mellemliggende cellelinje kaldet "PiCa" fra primære HNSCC celler fra menneskelige tumor prøver med bevarede cellulære markører på dens overflade og begrænset passager 16. denne PiCa cellelinie bør tjene som en forberedelse til udvikling af model på vej til derefter senere efter forsøg med friske menneskelige kræftceller fra tumor biopsier. Det har vist sig at celler i tre-dimensionelle celle kulturer reagerer forskelligt og flere i vivo-gerne administration af kræftlægemidler end dem, der vokser i encellelag17,18,19,20 ,21, hovedsagelig på grund af bevarelsen af migrerende og sub differentiering egenskaber af visse celle subsets22,23,24. Her, vi beskriver protokollen af en klumpformet-baseret, tre-dimensionelle model fra mellemliggende cellelinjer og primære menneskelige pladecellekræft celler og måder hvordan integrere sådan en model i kræftbehandling af hoved og hals kirurg og onkolog ( Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle undersøgelser vist i dette manuskript, nemlig anvendelsen af menneskelige tumor prøver, er beskyttet under og i samtykke med forudgående beslutninger fra Universitet medicin af Mainz/Universitet München medicinsk Center etisk komité. Patienter har givet informeret samtykke ifølge nationale juridiske retningslinjer accepterer at videnskabelig anvendelse af overskydende biologisk materiale, der blev opnået i løbet af deres behandling. Forskning er blevet udført i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for menneskelig velfærd.
1. finder en Tumor biopsi fra hovedet og dælen planocellulært karcinom
- Udføre general (propofol og/eller Sevofluran, muskel afslappende middel) eller lokale infiltration (2% ultracaine, adrenalin) / overflade (xylocaine) anæstesi i operationsstuen eller ørelæge undersøgelse stol. Visualisere tumor massen i mundtlig hulrum/svælget/strubehovedet/andre dele af den øvre mave og respiratorisk tarmkanalen med standard opererer instrumenter og, hvis det er nødvendigt, under mikroskop.
- Tag en frisk tumor biopsi fra periferien af kræft læsion med stump eller opskæring instrumenter. Undgå midten af læsion på grund af rigelige nekrose i dette område. Sætte den opnåede væv til en steril beholder med isotonisk natriumchlorid løsning.
- Efter biopsi, udføre hæmostase efter behov, fx., med en bipolar eller monopolære koagulation enhed ud over anvendelsen af vasokonstriktoriske stoffer.
- Bringe tumor biopsi anvendes til celle kultur eksperimenter direkte til den tilstødende laboratorium tarmkanalen. Send andre tumor biopsier til patolog som sædvanlig at udelukke kræft.
- Sørg for, at en laborant er klar til at behandle modellen direkte.
2. behandling af Tumor prøven
- Placer tumor modellen på en egnet, steril overflade og skæres det grundigt med en steril engangsbrug skalpel i så lidt som muligt stykker.
Forsigtig: Sørg for, at status for smitsomme og blodbårne sygdomme er veldokumenteret og teknikeren er i standard institutioner opmærksomme på protokoller at forhindre nål stick eller opskæring skade med potentielt biohazard patient materiale og den protokoller til at følge efter eventuel skade. - Efter tilstrækkelig mekanisk separation af de primære væv, sætte vævet ind i et hætteglas indeholdende Collagenase jeg / II og Inkuber i 1 time ved 37 ° C. Sigtes gennem et 70 µm falcon celle si og vask udsættelse med Hanks' Balanced Salt solution (HBSS).
-
Efter vellykket adskillelse og efterfølgende vask, placere den suspension, der indeholder 1-2 × 106 celler i en T75 celle kultur målekolber (75 cm2) til at vokse til sub-confluency ved 5% CO2 og temperatur på 37 ° C. Dette trin kan tage op til 10 dage.
- Bruge særlige keratinocytter næringssubstratet bestående af følgende: 125 mL Dulbecco ændrede eagles medium (DMEM), 250 mL af keratinocytter suppleret medium (suppleret medium bestående af 500 mL af keratinocytter SF Medium, 15 mg af kvæg hypofyse Uddrag (BPE), 2,5 mL af penicillin/streptomycin, 150 ng rekombinant humant epitelial vækstfaktor (EGF), 516 µL af 300 mM CaCl2, bestand blanding til at være forberedt på forhånd), 125 mL af F12 næringsstof mix, 10 mg af BPE (0,75 mL), 75 ng rekombinant humant EGF (2 µL) , 3,75 mL af 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-dipeptid (tabel af materialer).
3. Seedning cellerne i ultra-lav friktion celle kultur plader
- Bekræfte tumorcellevækst under et mikroskop. Tælle celler i kultur (primære eller celle kultur) og seed 5.000 primær tumorceller eller 1.000-2.000 celler af mellemliggende cellelinie / andre cellelinie i 200-300 µL af medier (trin 3.2.) i en ultra-lav friktion plade med konkave, runde bunde (96-brønd).
-
Kultur cellerne i 5% CO2 ved 37 ° C og i lige dele DMEM og luftvejene epitelcelle medium (BEGM), 10% føtal bovint serum, 1% penicillin/streptomycin, 1% natrium pyruvat, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1% L-glutamin (trin 2.3.). Hvis cellelinjer, der bruges, medier på grundlag af DMEM er tilstrækkelig.
- Udføre ændringer i medierne hver anden dag. Være opmærksom på ikke Aspirér klumpformet med pipetten under medieændringer. Kultur spheroids indtil niveau af vækst, som beskrevet i 3.3 er nået (ca 7-10 dage).
- Bekræfte spontan klumpformet dannelse under mikroskop af tre-dimensionelle, klumpformet-formet celle konglomerater på udkig. Udelukke brøndene med uregelmæssige og/eller flere klumpformet dannelsen af en yderligere undersøgelse.
Bemærk: Spheroids skal være synligt med det blotte øje, også at lette yderligere forarbejdning og medieændringer som beskrevet nedenfor.
4. udsætter Spheroids til multimodale Standard eller eksperimenterende Tumor terapi
- Vælge en ønskede therapy regime. Design tilstrækkeligt stort kontrolgrupper, der giver mulighed for sammenligninger af behandlinger til ubehandlet spheroids eller spheroids modtager kun delvis terapi regimer, fx. stråling alene. Størrelsen af kontrolgrupper afhænger af eksperimentelle gruppe design og kan ikke defineres universelt.
- Udveksle medier til medier med tilsætningsstoffer, betydning medier med kemoterapeutika og/eller monoklonale antistoffer på ønskede koncentrationer. Tilføje Cisplatin i koncentrationer på 5-2,5-10 µM eller 5-fluoruracil (5FU) på 30 µM.
Bemærk: For høj overførselshastighed eksperimenter eller stor gruppe størrelser/stort antal grupper, kan man bruge en automatiserede pipettering robot, som vi yderligere oprette i eksperimenter. - Alternativt, udstråle celle kultur plader med spheroids på 2 Gy ved hjælp af en egnet stråling facilitet.
Forsigtig: Respektere institutionens protokoller vedrørende forebyggelse af skadelige stråling af medarbejdere. Arbejde kun med udpegede og uddannede teknikere ifølge stråling beskyttelse retningslinjer. Hvis det ønskes, tilføje kemoterapeutika som beskrevet under 4.2. bagefter. - Inkuber celler i 24 timer i tidligere beskrevet kultur betingelser (37 ° C, trin 3.2).
- Efter inkubation, fortsætte cellekultur mindst 6 dage med medieændringer hver anden dag.
5. vurdering af klumpformet størrelsen og omfanget af cellulære spredning for Assay udlæsning
- Måle den sfæroide størrelse målt i området efter digital foto dokumentation på dag 6 (dag 10, dag 16) med en grafisk software (parameter 1).
- Efter centrifugering ved 520 x g for 2,5 min af pladen, Fjern supernatanten. Cellerne vaskes med tilstrækkelig mængde 1 x PBS og centrifugeres pladen igen som beskrevet, efterfulgt af fjernelse af supernatanten (PBS).
- Tilføje 100 µL af enzymatisk celle detachement løsning til hvert hætteglas tillade spheroids at opløse. Inkuber plade i 8 minutter ved 37 ° C.
- Check for vellykket opløsning af sfæroide under mikroskop. Tilsæt 100 µL af DMEM. Der centrifugeres plade på 520 x g for 2,5 min. Fjern supernatanten og suspendere celler i 100 µL af DMEM.
- Udføre en kommercielt tilgængelig kolorimetriske spredning assay, i eksempel WST-8 assay på hvert hætteglas ifølge producentens instruktioner25. Læse højt assay i en enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) læser (parameter 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi var i stand til at generere reproducerbar spheroids fra enkelt celle suspensioner, først fra forskellige cellelinjer, herunder den proprietære PiCa cellelinie, senere fra primære menneskelige kræftceller stammer fra frisk tumor biopsier, som beskrevet i Hagemann mfl . 26. vi evalueret to etablerede metoder for klumpformet generation; de to er de såkaldte hængende drop (HD) metode og ultra-lav friktion (ULA) metode, hvor sidstnævnte er en mere effektiv og sikker. Vi var i stand til at fremhæve fordele ved metoden ULA sammenlignet med HD, herunder hurtigere klumpformet vækst, færre problemer med plade håndtering, deraf følgende tab af spheroids med kraftige vibrationer, og mere reproducerbare klumpformet vækst ensartethed ( Figur 2). Forekomsten af flere spheroids pr. hætteglas var mere almindelig i metoden HD. Vi kontrolleres for en mere tydelig karakterisering af klumpformet morfologi. Figur 3 viser en immunochemistry farvning for Ki67, en spredning markør for en klumpformet fra PiCa celler. Som beskrevet i litteraturen, består spheroids af en mindre prolifererende kerne med en prolifererende ydre lag, efterligne forskellige regioner af spredning af solid HNSCC hos mennesker. In vitro som in vivo, dette er angiveligt forårsaget af en graduering af næringsstoffer og ilt leveret af celle kultur medier forårsager et fald fra periferien til centrum af tumor.
Derefter forsøgte vi at vise, at analysen er købedygtig opdager variationer i klumpformet størrelse efter inkubation med kemoterapeutiske stoffer eller udsættelse for ioniserende stråling, her repræsenterer to fælles standard behandlingsregimer for HNSCC. Før eventuelt integrere analysen i en forbehandling rutine, er validering af følsomheden af analysen en forudsætning. To parametre var tilgængelig som slutningen punkter i analysen: klumpformet størrelse (område, parameter 1 fra trin 5.1.) og spredning (Se parameter 2 fra trin 5.4.), at blive et surrogat markør for cellernes levedygtighed og vækstpotentiale efter terapi. Resultaterne af undersøgelserne, behandling med fælles kemoterapeutiske og kemo-stråling protokoller er vist i figur 4. Eksponering og inkubation af spheroids med cisplatin eller 5FU førte til en betydelig reduktion i vækst hastighed over tid i forhold til en ubehandlet kontrolgruppen (p< 0,001). Stråling med 2Gy var i stand til at reducere vækst hastighed på en væsentlig måde (p< 0,01). Overlevelse assay (WST-8) var i stand til at opdage en yderligere betydelig værdi af kemo-stråling med cisplatin i forhold til stråling alene (p = 0.017), en tidligere uopdaget forskel i vurderingen af klumpformet størrelse. Dette understreger dens betydning for analysen som helhed, forstærke dens følsomhed over for små ændringer terapi svar.
Figur 1: begrebet en model på vej til fremtidige personlig terapi. Patienter med enten baggrund af slimhinde HPV-infektion og/eller historie af tobak og alkohol misbrug stede til vores tertiære henvisning care center for formodede diagnose af hoved og hals kræft. Biopsier af mistænkelige slimhinde områder eller makroskopisk tumor masserne er taget under anæstesi for at sikre diagnosen. Derudover tager vi tumor biopsier til at generere tredimensionelle klumpformet-formet cellekulturer i laboratoriet. Ved tilstrækkelig vækst af primær-celle baseret spheroids udsætter vi dem for nuværende standard eller eksperimenterende behandlingsregimer at teste for individuel terapi svar. Yderligere analyser af genetiske eller Molekylær variationer kan tilføjes efter analyse af terapi resultater. Terapi resultater i vitro kan der drages i betragtning ved processen af planlægning terapi koncepter for patienten. Dette tal er genoptrykt fra Hagemann, J. et al. 26, med tilladelse givet af forfattere og journal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: alle cellelinjer kunne generere pålidelige spheroids; forskelle i størrelse og tidspunkt for udlæsning er i henhold til figur 1. I indledende forsøg, primærelementer ikke danne reproducerbare spheroids i HD men ULA plader (nederst til venstre). Yderligere undersøgelser skal gennemføres for at vurdere klumpformet vækst egenskaber fra primærelementer. Antal celler til højre er det oprindelige antal celler i hætteglas til at danne en klumpformet. Dette tal er genoptrykt fra Hagemann, J. et al. 26, med tilladelse givet af forfattere og journal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ki67 immunochemistry farvning af en klumpformet Skive (PiCa). I periferien af kulturen viser meget højere spredning priser end centrale celler, efterligne næringsstof distribution i solide slimhinde tumorer, som ofte viser nekrotisk kerner. Dette tal er genoptrykt fra Hagemann, J. et al. 26, med tilladelse givet af forfattere og journal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: terapi undersøgelser. (A) PiCa celler blev dyrket til at generere spheroids (n = 12 pr. gruppe) i ULA plader. Celler blev stimuleret i henhold til protokollen med enten PBS som kontrol, cisplatin på 5 µM eller 5FU på 30 µM. størrelser af spheroids blev bestemt på dag 6, 10 og 16 ifølge standardprotokoller. Cisplatin og 5FU behandling førte til et betydeligt fald i størrelse (p-værdierne er angivet nederst til venstre i afsnit (B) identiske eksperimentelle design som i (A) (n = 12), men med ekstra stråling af 2Gy. (C) Plot viser min til max. Efter p-værdierne i (C), tidligere stråling med 2Gy førte til et betydeligt fald i klumpformet størrelse i kontrolgruppen, efterligne strålebehandling og viser stråling følsomhed af PiCa celler. Stråling i kombination med cisplatin behandling ikke førte til et yderligere betydeligt fald i størrelsen af sfæroide (p> 0,05). Plot viser min til max. (C) beregnes p-værdier fra 2-vejs ANOVA analyse fra eksperimenter A og B. (D) WST8 analysen udføres på dag 16 som et alternativ til planimetric (området) analyse af spheroids. WST8 analyser har kunnet registrere et markant fald i levende celler efter kemo-stråling (2Gy stråling og cisplatin) sammenlignet med cisplatin alene (p = 0.017), dermed viser fordelen ved at kombinere både planimetric analyse og WST8 kolorimetrisk assay på tidspunktet for assay udlæsning. Plot viser min til max. Dette tal er genoptrykt fra Hagemann, J. et al. 26, med tilladelse givet af forfattere og journal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi var i stand til at etablere en protokol for at generere reproducerbare spheroids fra celle suspensioner, for begge cellelinjer og i indledende forsøg, primære humane tumorceller. Vi først vurderet to tidligere beskrevne metoder og identificeret ULA-metoden, en metode, hvor kultur plader med ultra-lav friktion bruges, til at være den sikrere og mere pålidelige for generation af ensartet tredimensionale spheroids. Ved at kombinere to separate metoder for analyse læse-out (størrelse/område og celle levedygtighed), er denne multimodal analyse tilstrækkeligt følsomme til at identificere små forskelle mellem grupper. Dette er det første skridt mod bevis for teknisk gennemførlighed for senere integration af analysen i patientforløb på vores tertiær Plejecenter. Fremover vil det kunne bruges til (i) vurdere individuelle tumor modtagelighed for fælles første - eller anden/tredje-linje behandling protokoller (kemo-reagenser, stråling) og eksperimentel behandling protokoller, (ii) yderligere karakterisere tumorceller fra friske prøver og korrelere molekylære overflade eller cytoplasmatisk mønstre til terapi svar. Spheroids fra prøverne kommer fra forskellige tumor lokaliseringer, fx, primære og lymfeknude metastase, er tænkelige.
Gennem etablering af protokollen og metode brugt vi forskellige kendte cellelinjer, et par er veletableret i årtier. Den blotte alder af cellelinjer rejser tvivl om deres tilslutning og sammenlignelighed til nuværende faktiske menneskelige tumorceller, angiveligt at have mistet flere egenskaber og hallmark molekylære markører. Resultater fra in vitro- eksperimenter var vanskelige at formere sig i menneskelige eller i vivo forsøg27. Derfor fokuserede vi på en cellelinje, der for nylig genereret fra menneskelig primær tumorceller i vores anlæg, der er godt præget16. Med denne cellelinie PiCa, vi var i stand til at udføre behandlingen eksperimenter på en større skala og bekræftet nuværende terapi forventninger. Dette understøtter den teori, at PiCa celler afspejler faktiske menneskelige tumor adfærd bedre end andre, mere alderen og passaged cellelinjer, der undergik mange passager. Celler, der kan underkastes ikke-fysiologisk valg på grund af langsigtet i vitro betingelser kan bias kemo-stråling følsomhed. I de seneste eksperimenter bekræftet vi gennemførlighed med primærelementer med hensyn til pålidelig klumpformet dannelse; yderligere og større eksperimenter skal dog udføres før at være i stand til at gennemføre analysen i klinisk rutine.
Det antages at spheroids og tre-dimensionelle cellekultur generelt reagerer forskelligt i forhold til konventionel 2D-kultur, når de udsættes for kemoterapeutiske stoffer eller stråling 28. Arkitektur af spheroids fører til en graduering af oxygen og ernæring levering fra ydre overflade til kerne, og de seneste undersøgelser har vist, at også medicinafgivelse til forskellige dele af den tre-dimensionelle celle klynge ikke er ensartet29. Desuden synes celler i klumpformet kultur at bevare visse gen expression mønstre, der er knyttet til resistens hos dyr modeller 30. Vi foreslår, at også såkaldte stråling modstand, en funktion, der har været forbundet med hoved og hals kræft i talrige patienter, er et resultat af celle-celle interaktion og forskellige microenvironments fører til variationer i iltforsyning og metaboliske aktivitet. Dette fænomen kunne efterlignes i spheroids på grund af en forhøjet i vivo funktionalitet. Afslutningsvis, kan brugen af primærelementer og generation af spheroids tillade os at bevare så mange som muligt Karakteristik af i vivo tumorvækst i kombination med en omkostningseffektiv analyse for at undersøge individuelle terapi svar.
Der er helt sikkert begrænsninger tilgang. Til dato, er det uvist, hvordan celler fra forskellige individuelle patienter vil udføre i analysen at blive udsat for tumor behandling, og hvordan intelligent analysen er i sammenhæng med senere terapi resultatet. Overdreven undersøgelser er nødvendige for at blot sammenligne arbejdsindsats i vitro vs kliniske forløb. Blandt andre, nemlig to faktorer bidrager til denne usikkerhed: tumor heterogenitet og manglen på fælles kultur med stromale og immun celler. Tumor heterogenitet er en ikke helt forstået fænomen og findes mellem forskellige underordnede websteder i primære og mellem primær og metastatisk lokalisering12. Siden de seneste undersøgelser, der er en tredje site hvor meget tydelig og specialiseret tumorceller kan findes og sejre i nicher: blod og knoglemarv er i stand til at huse i omløb og formidlet tumor celler9,10. Manglen på andre celletyper som stromale celler og T-celler (som repræsentant for immunsystemet) i cellekultur begrænses ikke til analysen, men en gyldig Ulempen ved de fleste in vitro- assays studerer tumor terapi modtagelighed. I lyset af de seneste narkotika godkendelser og igangværende undersøgelser, der har indflydelse på T-celle respons, skal fremtidige eksperimenter for drug discovery føres i en kombination af forskellige assays og metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af et tilskud af Universitet i München (FöFoLe projekt-nr.: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters' significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
